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Cinetica de crecimiento in vitro de dos cepas de Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) en celulas miocardicas de roedores con diferente susceptibilidad.

RESUMEN

Dos cepas de Trypanosoma cruzi, una originaria de Costa Rica (TCR-4) y otra de El Salvador (UES-1) fueron comparadas in vitro en cuanto a su infectividad y multiplicacion en celulas miocardicas de raton blanco NGP, raton [C.sub.3]H y rata Sprague Dowley con el fin de determinar la resistencia natural de las celulas de estos animales. Las celulas miocardicas fueron cultivadas en cubreobjetos y posteriormente infectadas con tripomastigotos sanguineos de la cepa respectiva en una relacion de un parasito por celula miocardica y posteriormente incubados a 37 [grados]C con 10 % de C[O.sub.2] en atmosfera humeda. Para determinar la capacidad infectante y multiplicacion intracelular se analizaron muestras a las 24, 72, 96 y 120 h de infeccion, determinandose la curva de crecimiento y la tasa de multiplicacion intracelular. Se encontro que las dos cepas fueron capaces de multiplicarse en las celulas miocardicas de raton [C.sub.3]H, muy poco en raton NGP y practicamente nada en rata, lo que sugiere una resistencia natural de las celulas de estos ultimos dos animales. La cepa UES-1 tuvo una tasa de multiplicacion e invasion mayor (p=0.001) sugiriendo por lo tanto una virulencia, al menos in vitro superior a la cepa TCR-4.

Palabras clave: Trypanosomatidae, Trypanosoma cruzi, celulas cardiacas, cultivo de celulas.

Abstract: In vitro growth kinetics of two Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) clones in myocardial cells from rodents of different susceptibility. Two Trypanosoma cruzi isolates, TCR-4 from Costa Rica and UES-1 from El Salvador, were studied in vitro to compare their infectivity or resistance and intracellular replication in myocardial cells in three strains of mice and rats: NGP white mice, [C.sub.3] H mice and Sprague Dowley rats. Myocardial cells were cultured on coverslips at 37 [degrees] C in a humid 10 % C[O.sub.2] atmosphere and then infected at a ratio of one tripomastigote per cell. Samples were studied after 24, 72, 96 and 120 h of infection to determine parasite infection capacity and intracellular multiplication. Both parasites had the highest infection capacity in [C.sub.3] H mice, followed by NGP mice cells with a very low infection rate. Lastly, almost no Trypanosoma cruzi multiplication was observed in Sprague Dowley rats, suggesting a strong natural resistance in this animal to both strains of the parasite. The UES-1 isolate presented higher multiplication and greater invasion than the TCR-4 strain, showing greater virulence of UES-1 in heart cells, at least in vitro. Rev. Biol. Trop. 55 (1): 121-126. Epub 2007 March. 31.

Key words: Trypanosomatidae, Trypanosoma cruzi, heart cells, cell culture.

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Durante su complejo ciclo de vida, Trypanosoma cruzi alterna entre hospederos invertebrados y vertebrados en los cuales establece la infeccion (Zingales y Colli 1985). Las formas encontradas en los vertebrados son parasitos intracelulares obligados que invaden y se replican en una gran variedad de celulas fagociticas y no fagociticas (Sadigursky 1999, Scharfstein y Morrot 1999). Aunque T. cruzi puede parasitar cualquier tipo de celula, su desarrollo en las celulas musculares cardiacas es importante, ya que su presencia en este tipo de celulas tiene un papel preponderante en las manifestaciones clinicas de la enfermedad de Chagas (Andrade 1999b). Tambien se ha determinado que existe una participacion muy activa de las celulas cardiacas en su respuesta a la infeccion con T. cruzi, ya que al cultivarlas, en presencia de varias citoquinas, se observan diferencias importantes en la multiplicacion del parasito en ellas (Postani et al. 1999). Tambien es importante mencionar que las celulas de diferentes animales o aun de diferentes organos en el mismo animal, presentan variaciones en el crecimiento de T. cruzi, lo cual ha sido demostrado en ciertas especies de roedores (Araujo et al. 1976, Chinchilla et al. 1995). Sobre la base de estos estudios y empleando un modelo in vitro descrito por Reyes y Chinchilla (1987), este estudio compara la multiplicacion de dos cepas de T. cruzi en celulas miocardicas de varias especies de roedores.

MATERIALES Y METODOS

Parasitos: Se utilizaron dos cepas, un aislamiento de T. cruzi de El Salvador (UES-1) obtenido de un nino en fase aguda en el departamento de Santa Ana, El Salvador en 1999 y otro aislamiento hecho en Costa Rica en 1987 (TCR-4) de un ejemplar de Triatoma dimidiata; ambas cepas son mantenidas por pases sucesivos cada 25 dias en ratones [C.sub.3]H.

Animales: Se utilizaron ratones [C.sub.3]H de 20-25 g de peso para la obtencion de tripomastigotos. Ademas ratones blancos NGP, ratones [C.sub.3]H y ratas Sprague Dowley de 2-4 dias de nacidos para los correspondientes cultivos de celulas.

Cultivo de celulas miocardicas y modelo de infeccion: Se realizo una diseccion de los animales recien nacidos bajo condiciones asepticas y los corazones se colocaron en una solucion de Hanks (HBSS) a 4[grados]C, lavandose una vez en dicha solucion y para posteriormente cortarlos en pequenas porciones y luego colocarlos cuidadosamente en frascos de Erlenmeyer para su tripsinizacion por 10 min a 37 [grados]C. Este procedimiento se repitio dos veces mas y se recolecto al final del proceso el sobrenadante en Minimal Essential Medium (SIGMA [R]) mas 10 % de suero fetal bovino con 10-100 UI de penicilina, 0.01 mg de estreptomicina y 0.025 ig de anfotericina B por ml (MEM-SFB). La suspension celular se centrifugo a 800 g por 10 min, se descarto el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendio en 10 ml de MEMSFB, colocandose posteriormente en botellas de cultivo esteriles, las cuales se incubaron a 37[grados]C con una atmosfera de 5 % de C[O.sub.2] por 24 h. Luego se agregaron 8 ml de MEM-SFB, se volvio a incubar por otras 24 h y despues de este tiempo, se descarto el medio liquido, se agregaron 10 ml de medio y se incubo por 24 a 48 h hasta que se formara una monocapa. Para pasar las celulas a cubreobjetos, las botellas de cultivo se trataron con tripsina 0.25 % a 37 [grados]C con una atmosfera de 5 % de C[O.sub.2] hasta que la monocapa se desprendiera. Posteriormente se coloco 0.1 ml de esta suspension en cubreobjetos 22 x 22 mm y se incubaron 24 h a 37 [grados]C con una atmosfera de 5 % de C[O.sub.2] para su infeccion posterior (Reyes y Chinchilla 1987). Despues de incubar por 24 h las celulas en cubreobjetos se infectaron con 0.1 ml de suspension de tripomastigotos sanguineos (derivados de ratones [C.sub.3]H infectados previamente con las respectivas cepas) en MEM-SFB, en una proporcion de un parasito por celula miocardica y se incubaron a 37 [grados]C con 5-10 % de una atmosfera de C[O.sub.2]. Los cubreobjetos se retiraron (por duplicado) a las 24, 72 y 96 h lavandolos cuidadosamente con HBSS y fueron tenidos adecuadamente con Giemsa (1ml de colorante de Giemsa mas 9 partes de buffer de fosfatos pH 7.2). Los controles consistieron en cultivos de celulas miocardicas de animales sanos de cada especie de roedor. Cada cubreobjeto se examino por microscopia de luz (lente 100 x) contandose en cada uno 500 celulas; de esta manera se establecio el numero de celulas infectadas y el numero de parasitos intracelulares totales lo que permitio calcular el numero de parasitos por 100 celulas (poblacion total), el numero de parasitos por celulas infectadas y la tasa de multiplicacion. Este valor se calculo dividiendo el numero de parasitos intracelulares despues de 120 h entre el numero de parasitos despues de 24 h. Las diferencias observadas entre los indices de reproduccion del parasito en las celulas de los tres animales se evaluaron mediante la prueba de t de Student para comparacion de promedios independientes utilizando niveles de confianza del 95 %.

RESULTADOS

En los cuadros 1 y 2 se observa la multiplicacion de los aislamientos de T. cruzi en celulas de corazon de los tres roedores, raton [C.sub.3]H (RT [C.sub.3]H), raton NGP (RT NGP) y rata blanca Sprague Dowley(R). En los tres animales la cantidad de parasitos por celulas cardiacas infectadas a las 24 h fue similar, pero el numero de parasitos intracelulares a las 72, 96 y 120 fue diferente y mucho mas obvio en las celulas cardiacas de RT [C.sub.3]H a las 72 h despues de la infeccion, especialmente las celulas infectadas con la cepa UES. En las celulas de corazon de R, el numero de parasitos intracelulares permanecio casi constante durante el experimento, aunque como se observa en el cuadro 2 la multiplicacion de esta cepa (UES) fue muy baja. Es necesario senalar que despues de 120 h, la mayoria de las formas intracelulares fueron amastigotos; sin embargo, en pocos casos, se observaron tripomastigotos en el interior de las celulas, especialmente en lo referente a las celulas cardiacas de RT [C.sub.3]H, en las que se observaron tripomastigotos libres como resultado de la alta multiplicacion del parasito y probable lisis de algunas celulas. En el cuadro 2 se observa que la cepa TCR-4 infecto menor cantidad de celulas en comparacion con la cepa UES. Un comportamiento similar se observo con respecto a la multiplicacion intracelular de la cepa TCR-4.

La tasa de multiplicacion de los parasitos por 100 celulas cardiacas infectadas indican una mayor multiplicacion de la cepa T. cruzi (UES) en RT [C.sub.3]H que la cepa TCR4. Aunque en las celulas de corazon de R se evidencio multiplicacion, esta fue muy baja para ambas cepas (Cuadro 3). La tasa de multiplicacion 24/120 h en celulas de corazon de RT [C.sub.3]H fue mayor para T. cruzi (UES) que el mostrado por la otra cepa (83.3) (Cuadro 3). Esta misma situacion se repite tambien a las 72 y 96 h de infeccion, no obstante valores de multiplicacion intermedios fueron observados en celulas de corazon de RT NGP. Puede verse tambien que hubo una mayor multiplicacion en las celulas de corazon de RT NGP por parte de T. cruzi (UES) que la mostrada por T. cruzi (TCR-4); ambas cepas mostraron indices de multiplicacion similares en celulas de corazon de R (Cuadros 1 y 2).

DISCUSION

Se ha propuesto que la diversidad molecular existente en cepas de T. cruzi puede afectar el funcionamiento de los tejidos y organos que infectan, como se evidencia por el hecho de que infecciones con cepas de parasitos pertenecientes a diferentes grupos fenotipicos, inducen distintos patrones histopatologicos en ratones infectados (Andrade 1999a, De Luca et al. 1993). Es asi como estudios desarrollados con cepas de laboratorio sugieren que la expresion variable de la enfermedad de Chagas puede ser influenciada por la genetica y la diversidad biologica de clones de T. cruzi, circulantes en reservorios selvaticos y domesticos (Macedo y Pena 1998, Magalhaes et al. 1996). La posibilidad de variantes en la virulencia debida a la presencia de clones claramente definidos se ha comprobado, por lo menos en la cepa salvadorena, ya que se han determinado clones con diferente grado de infectividad para macrofagos (Calderon-Arguedas et al. 2002). En Centroamerica no se han llevado a cabo estudios de este tipo, debido probablemente a que los cuadros clinicos descritos en algunos paises no son tan dramaticos como los ocurridos en Sudamerica, aunado a la falta de recursos economicos en los institutos de investigacion (Bloch 1982).

El patron de crecimiento tipico en celulas cardiacas de ratones [C.sub.3]H por parte de T. cruzi fue descrito en los trabajos realizados por Reyes y Chinchilla (1987). Estos investigadores utilizaron solamente una especie de animal, pues los objetivos eran otros, mientras que en este estudio se compara tal multiplicacion en diferentes cepas de animales de laboratorio. La diferencia en multiplicacion de T. cruzi en los tres tipos de animales (Cuadro 3), nos permite razonar lo siguiente: debido a que las celulas cardiacas no realizan mecanismos de defensa como los macrofagos (Bogdan y Rollinghof 1999, Dos-Reis 1997, Israelski et al. 1990), los resultados indican una resistencia natural a la infeccion de las celulas cardiacas de raton en NGP y mas marcada en rata blanca. La diferencia, en cuanto a la susceptibilidad de diversos animales, de permitir la multiplicacion de parasitos tales como el Toxoplasma gondii, habia sido demostrado en celulas no fagociticas pero no en celulas cardiacas (Chinchilla et al. 1995). Aunque conocido el patron antes mencionado, no se conoce de trabajos en los que se comparan el crecimiento de T. cruzi en celulas de corazon de roedores. Con anterioridad se habia informado de la resistencia natural de la rata blanca ante la multiplicacion de algunos protozoarios (Chinchilla et al. 1981, 1995) lo cual se correlaciona con los resultados aqui obtenidos, ya que se observo que las celulas cardiacas de rata son tambien muy resistentes a la multiplicacion de T. cruzi. Probablemente esta resistencia natural esta geneticamente determinada y no depende de factores extrinsecos provenientes de la capacidad de infeccion del parasito. Esta generalmente aceptado que las propiedades de la infeccion de T. cruzi son el resultado de la interrelacion entre cepas de parasito y las especies de hospederos. Los resultados obtenidos en este estudio parecen ratificar este principio. Segun los resultados T. Cruzi (UES) parece ser una cepa con una tasa alta de multiplicacion en las celulas cardiacas de raton [C.sub.3]H, ademas de poseer una mayor capacidad de invadir dicho tipo celular que T. cruzi (TCR-4). Estas diferencias entre la virulencia de estas cepas en cultivos in vitro de celulas de corazon y debido a la alta capacidad de infectar celulas cardiacas por parte de la cepa UES, parece conveniente realizar investigaciones de diferenciacion de biodemas de cepas aisladas de pacientes salvadorenos con enfermedad de Chagas cronica y analizar mediante un modelo animal, la predileccion por el tejido cardiaco.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue financiado en parte por la vicerrectoria de la Universidad de Costa Rica a traves del proyecto No. 803-A2-042 y de acuerdo con el convenio Universidad de Costa Rica-DAAD.

Recibido 22-vII-2004. Corregido 18-XI-2005. Aceptado 11-v-2006.

REFERENCIAS

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Andrade, Z.A. 1999b. Immunopathology of Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 94 (Suppl 1.): 71-80.

Araujo, F.G., D.M. Williams, F.C. Grumet & J.S. Remington. 1976. Strain dependent differences in murine susceptibility to Toxoplasma. Infect. Immun. 13: 1528-1530.

Bloch, M. 1982. Conclusiones del estudio de la tripanosomiasis aguda y cronica. Rev. Inst. Invest. Med. 11: 180-183.

Bogdan, C. & M. Rollinghoff. 1999. How do protozoan parasites survive inside macrophages. Parasitol. Today. 15: 22-28.

Calderon-Arguedas, O., A. Troyo, I. valerio & M. Chinchilla. 2002. Heterogeneidad clonal en epimastigotos de una cepa centroamericana de Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae). Parasitol. Latinoam. 57: 40-45.

Chinchilla, M., M. Alfaro & O.M. Guerrero. 1981. Adaptacion natural de la rata blanca a Toxoplasma gondii. Rev. Biol. Trop. 29: 273-282.

Chinchilla, M., L. Reyes & O.M. Guerrero. 1995. Resistence to intracellular parasites correlates with species differences in ability of macrophages to inhibit parasite replication. Immunol. Infect. Dis. 5: 83-87.

De Luca D'oro, G.M., C.N. Gardenal, B. Berret & J.v. Crisci. 1993. Genetic structure of Trypanosoma cruzi populations for Argentina estimated from enzyme polymorphism. Parasitol 107: 405-410.

DosReis, G.A. 1997. Cell-mediated immunity in experimental Trypanosoma cruzi infection. Parasitol. Today. 13: 335-342.

Israelski, D.M., F.G. Araujo, J.S. Wachtel, L. Heinrichs & J.S. Remington. 1990. Differences in microbicidal activities of human macrophages against Toxoplasma gondii and Trypanosoma cruzi. Infect. Immun. 58: 263-265.

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Magalhaes, J.B., S.G. Andrade & I. Sherlock. 1996. Trypanosoma cruzi strains: behavior after pasaje into autochtonous or foreign species of triatomine (Biological and biochemical patterns). Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo 38: 23-28.

Postani, M., M.R. Arnaiz & L.E. Fichera. 1999. Respuesta de las celulas cardiacas a la infeccion con Trypanosoma cruzi. Medicina. 59 (Suppl II.): 57-62.

Reyes, L. & M. Chinchilla. 1987. Growth inhibition of Trypanosoma cruzi in cultured murine myocardial cells mediated by a specifically induced lymphokine. Infect. Immun. 55: 1513-1516.

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Scharfstein, J. & A. Morrot. 1999. A role for extracellular amastigotes in the immunopathology of Chagas' disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 94: 51-63.

Zingales, B. & W. Colli. 1985. Trypanosoma cruzi: interaction with Host Cells. Cur. Top. Microbiol. Immnol. 117: 129-52.

Rafael-Oswaldo Angel B. (1), Misael Chinchilla C. (2) *, Olga Marta Guerrero B. (2) & Alfredo Castro C. (2)

(1) Departamento de Microbiologia, Facultad de Medicina, Universidad de El Salvador. Fax: (503) 225-8822; rangel@ elsalvador.com

(2) Centro de Investigacion en Enfermedades Tropicales, CIET, Departamento de Parasitologia, Facultad de Microbiologia, Universidad de Costa Rica, 2060, San Jose, Costa Rica. Telefono 506-207-42-77. Fax: 506-225-23-74. * Correspondencia.
CUADRO 1

Curva de crecimiento de T. cruzi TCR-4 en celulas cardiacas

TABLE 1

Growth curve of T. cruzi TCR-4 in heart cells

                                          Celulas contadas

   Animal          Tiempo de
                   infeccion         Totales         Infectadas

      R                24              501                2
                       72              503                1
                       96              500                4
                      120              500                4

   RT NGP              24              510                2
                       72              500                4
                       96              505                8
                      120              503               10

RT [C.sub.3]H          24              504               15
                       72              507               19
                       96              515               25
                      120              510               56

                                    Parasitos

                 Intracelulares     /100 celulas   /100 celulas
                                                    infectadas

      R                 2                0.4            100
                        1                0.2            100
                        4                0.8            100
                        5                1.0            125

   RT NGP               3                0.6            150
                        6                1.2            150
                       16                3.2            200
                       28                5.6            280

RT [C.sub.3]H          15                3.0            100
                       49                9.7            258
                       75               14.6            300
                      425               83.3            759

RT [C.sub.3]H: raton [C.sub.3]H; RT NGP: raton NGP; R: rata.

RT RT [C.sub.3]H: [C.sub.3]H mouse; RT NGP: NGP mouse; R: rat.

TCR-4-cepa de Costa Rica.

TCR-4-parasite clone from Costa Rica.

CUADRO 2

Curva de crecimiento de T. cruzi UES en celulas cardiacas

TABLE 1

Growth curve of T. cruzi UES in heart cells

                                          Celulas contadas

   Animal          Tiempo de
                   infeccion         Totales         Infectadas

      R                24              505                2
                       72              503                2
                       96              500                4
                      120              510                4

   RT NGP              24              500                4
                       72              500               14
                       96              500               12
                      120              500               32

RT [C.sub.3]H          24              500               16
                       72              500               39
                       96              500               51
                      120              500               62

                                    Parasitos

                 Intracelulares     /100 celulas   /100 celulas
                                                    infectadas

      R                 2                0.4            100
                        2                0.4            100
                        4                0.8            100
                        5                1.0            125.0

   RT NGP               5                1.0            125
                       18                3.6            129
                       48                9.6            400
                      126               25.2            394

RT [C.sub.3]H          22                4.4            138
                       78               15.6            200
                      215               43.0            422
                      892              178.4           1439

RT [C.sub.3]H: raton [C.sub.3]H; RT NGP: raton NGP; R: rata.

RT RT [C.sub.3]H: [C.sub.3]H mouse; RT NGP: NGP mouse; R: rat.

UES. cepa de El Salvador.

UES. parasite clone from Costa Rica.

CUADRO 3

Multiplicacion de cepas de T. cruzi en celulas cardiacas

TABLE 3

Multiplication of T. cruzi parasite clones in heart cells

                                Parasitos/100 celulas
                               (Infeccion con T. cruzi)

T. cruzi       Animal       24 h    120 h   Tasa120/24 h

            RT [C.sub.3]H   4.4     178         40.5

UES *          RT NGP       1        25.2       25

                 R          0.4       1          1.25

                            3        83.3       27
            RT [C.sub.3]H

TCR-4 **       RT NGP       1        25.0        9.33

                 R          0.4       1          1

RT [C.sub.3]H: raton [C.sub.3]H; RT NGP: raton NGP; R: rata.

RT [C.sub.3]H: [C.sub.3]H mouse; RT NGP: NGP mouse; R: rat.

* cepa del El Salvador

* parasite clone from El Salvador

** cepa de Costa Rica

** parasite clone from Costa Rica
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Author:Angel B., Rafael-Oswaldo; Chinchilla C., Misael; Guerrero B., Olga Marta; Castro C., Alfredo
Publication:Revista de Biologia Tropical
Date:Mar 1, 2007
Words:3580
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