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Cell dynamics growth in Beta vulgaris L. culture in vitro using digital image analysis and fractal dimension/Dinamica de crecimiento celular de Beta vulgaris L. cultivada in vitro mediante analisis digital de imagenes y de la dimension fractal/Dinamica de crescimento celular de Beta vulgaris L. cultivada in vitro mediante analise digital de imagens e da dimensao fractal.

SUMMARY

In in vitro cell culture, the morphology of cellular aggregates is related to metabolic state and cellular viability. These aggregates display irregular shapes that change during growth. In recent years, digital image analysis (DIA) has been used to characterize irregular objects applying irregularity descriptors, such as the compactness factor. Likewise, the irregularity of an object may also be measured with the application of fractal geometry. In this study, the growth dynamics of Beta vulgaris L. (Chenopodiaceae) cells was analyzed. Chan ges in size and shape of cellular aggregates were measured at 24h intervals during 31 days. These measurements were made using digital images of cellular aggregates taken at intervals of 24h. DIA was later applied to obtain area, perimeter, and compactness factor. Subsequently, the fractal dimension of the aggregates was used to analyze their growth dynamics by time lag utilizing the Poincare phase diagram. The growth dynamics of the aggregates showed two stages of cellular growth, a periodic one anda chaotic one.

RESUMEN

En los cultivos de celulas vegetales en suspension, la morfologia de los agregados celulares puede tener relacion con el estado metabolico y la viabilidad celular. Estos agregados tienen formas irregulares que van cambiando durante el crecimiento. En anos recientes se ha empleado el analisis digital de imagenes (ADI) para caracterizar objetos irregulares, en donde se aplican descriptores de irregularidad, como el factor de compacidad. Tambien, el grado de irregularidad de un objeto puede ser valorado objetivamente con la aplicacion de conceptos como el de la geometria fractal. En este trabajo se estudio la dinamica de crecimiento de un cultivo de celulas de Beta vulgaris L., (Chenopodiaceae). Se determinaron los cambios de tamano y forma de los agregados celulares cada 24h durante 31 dias. Estas mediciones se realizaron obteniendo imagenes digitales de los agregados en intervalos de tiempo de 24h. Posteriormente, se aplico ADI para obtener area, perimetro y factor de compacidad, y se determino la dimension fractal de los agregados. Con los valores de dimension fractal, se analizo la dinamica de crecimiento de los agregados mediante el desfase de tiempo por el diagrama de fases de Poincare, lo que permitio visualizar dos etapas de la dinamica de crecimiento. Una etapa de crecimiento periodico y otra de crecimiento caotico de los agregados celulares.

RESUMO

Nos cultivos de celulas vegetais em suspensao, a morfologia dos agregados celulares pode ter relacao com o estado metabolico e a viabilidade celular. Estes agregados tem formas irregulares que vao mudando durante o crescimento. Em anos recentes tem sido empregada a analise digital de imagens (ADI) para caracterizar objetos irregulares, aonde se aplicam descriptores de irregularidade, como o) Cator de compacidade. Tambem, o grau de irregularidade de um objeto pode ser valorizado objetivamente com a aplicacao de conceitos como o [D.sub.A] geometria fractal. Neste trabalho se estudou a dinamica de erescimento de um cultivo de celulas de Beta vulgaris L., (Chenopodiaceae).

Determinaram-se as mudancas de tamanho e forma dos agregados celulares cada 24h durante 31 dias. Estas medicoes se realizaram obtendo imagens digitais dos agregados em intervalos de tempo de 24h. Posteriormente, se aplicou ADI para obter area, perimetro e fator de compacidade, e foi determinada a dimensao fractal dos agregados. Com os valores de dimensao fractal, foi analisada a dinamica de crescimento dos agregados mediante o desfase de tempo pelo diagrama de fases de Poincare, o que permitiu visualizar duas etapas [D.sub.A] dinamica de crescimento.

Uma etapa de crescimento periodico e outra de crescimento caotico dos agregados celulares.

PALABRAS CLAVE / Analisis Digital de Imagenes / Atractor / Beta vulgaris / Caos / Crecimiento / Cultivo de Celulas Vegetales / Dimension Fractal / Maduracion /

Recibido: 23/12/2009. Modificado: 07/04/2011. Aceptado: 11/04/2011.

Introduccion

El cultivo in vitro de celulas de Beta vulgaris L. para la produccion de pigmentos (betacianinas), puede ser una tecnologia de utilidad en la industria alimentaria (Trejo-Tapia et al, 2007). Estos cultivos se caracterizan por la proliferacion de celulas indiferenciadas que forman agregados llamados callos (Pepin et al., 1999). Estos agregados aumentan de tamafio y cambian de forma a lo largo del tiempo de cultivo. La produccion y acumulacion de betacianinas dentro de los agregados puede estar relacionado con el tamafio y la forma de los agregados (Jimenez et al., 2005). Por lo tanto, la prediccion dEl tamafio y la forma de los agregados puede servir como parametro de control en cultivos celulares de mayor escala (Pepin et al., 1999; Edahiro y Seki, 2006). Ademas, en cultivos con agitacion, el tamafio y la forma de los agregados puede afectar las caracteristicas reologicas (Jimenez-Aparicio et al., 1996).

En anos recientes se ha venido empleando el analisis digital de imagenes (ADI) para cuantificar caracteristicas morfologicas y estructurales en materiales biologicos (Pepin et al., 1999; Berzin et al., 2000), y ha sido utilizado para caracterizar la forma de agregados celulares de Solanum chysotrichum (Trejo-Tapia et al., 2001).

Con la aplicacion de ADI se obtienen algunos parametros que sirven para caracterizar el tamano de los agregados celulares, como lo son las mediciones de area y perimetro (Trejo Tapia et al., 2007). Otros parametros caracterizan la forma, como es el caso del factor de compacidad, cuyo valor es >12 para objetos irregulares, porque la irregularidad del perimetro es mayor Al area correspondiente (Jimenez-Martinez et al., 2009). Por otra parte, se pueden usar los valores de area y perimetro para obtener la dimension fractal (DF) de los agregados. La DF no solo es un parametro de irregularidad, sino que sus valores son independientes del tamano del objeto, por lo cual caracteriza mejor su irregularidad (Katz, 1988; Smith y Behar, 1994; Milosevic y Ristanovie, 2009).

En anos recientes, algunos autores han determinado valores de DF de agregados celulares en cultivo apoyandose en herramientas de ADI. Logan y Wilkinson (1991) describieron el comportamiento fractal de agregados de Zooglea ramigera y Saccharomyees cerevisae. Jimenez et al. (2005) determinaron la naturaleza fractal de celulas de B. vulgaris sometidas a permeabilizacion. Los autores midieron la dimension fractal de los agregados de B. vulgaris crecidos en suspension a traves de la dimension fractal de area (DA) y perimetro ([D.sub.p]). Esto les permitio establecer una relacion entre la concentracion de biomasa y el tamano de los agregados crecidos tanto en matraces como en biorreactores.

Otra caracteristica interesante de la teoria fractal es su relacion con las teorias del caos y de la dinamica no lineal (Grassberger y Procaccia, 1983; Johnson y Moon, 1999), es decir, cuando el comportamiento dinamico no es predecible con una ecuacion lineal. Esto se debe a que el fenomeno en estudio es afectado por mas de un factor. Algunos autores, como Johnson y Moon (1999), consideran que la mayoria de los fenomenos naturales tienen un comportamiento no lineal y en ocasiones su dinamica se vuelve practicamente impredecible a mediano y largo plazo, comportamiento Al que se le denomina caotico.

Sin embargo, en algunos casos, durante la evolucion de un fenomeno puede presentarse un comportamiento periodico, por lo que la evolucion del fenomeno sera relativamente predecible a corto plazo (Mandelbrot, 2003). En el comportamiento periodico, la variable de respuesta oscila dentro de un intervalo estrecho de posibles resultados. A este intervalo se le conoce como 'atractor' du rante la dinamica no lineal.

Tambien existen otros tipos de atractores que no son periodicos, y por ello no son facilmente detectados. Estos atractores son denominados 'extranos', y pueden ser detectados y caracterizados con la ayuda de tecnicas de analisis matematico para sistemas caoticos (Jonson y Moon, 1998).

En los cultivos celulares deben existir simultaneamente distintos estados celulares, celulas jovenes, en division, noviables, en fase apoptotica e incluso muertas (Cosgrove, 2000), por lo que seles puede considerar sistemas asincronos y complejos. Sin embargo, dentro de ese caos aparente puede existir un probable patron de crecimiento ordenado (Chakraborti, 2003). Este trabajo se propone describir el desarrollo de la formacion de agregados celulares de Beta vulgaris L. cultivadas in vitro, aplicando conceptos de dinamica no lineal y utilizando metodos de analisis digital de imagenes.

Materiales y Metodos

Materiales

Se utilizaron celulas indiferenciadas (callos) de Beta vulgaris L. (familia Chenopodiaceae), variedad Crossby Egyptian. Las celulas fueron cultivadas en el medio basal [B.sub.5] (Gamborg et al., 1968) de Sigma (St. Louis, MO, EEUU), adicionado con sacarosa (Merck; 20g x [l.sup.-1]); acido 2,4-diclorofenoxiacetico (9,05 x [10.sup.-2][micron]mol x [.sup.-1]), y cinetina (9,05 x [10.sup.-2][micron]mol x [1.sup.-1]) Sigma. El pH sele ajusto a 5,5 con NaOH 0,1M y posteriormente se agrego fitagel (2g x [1.sup.-1]). El medio preparado se esterilizo en autoclave durante 20min a una presion de 1,2kg x [cm.sup.-2] y se vertio en cajas de Petri desechables de 150 x 25mm.

Condiciones' de crecimiento de los cultivos En condiciones de esterilidad se preparo un lote experimental de 15 cajas de Petri desechables con cuatro agregados en cada caja, para trabajar un total de 60 agregados. A cada caja se adiciono o0ml de medio semisolido Bs. Cada cultivo se incubo durante 31 dias en una camara a 25 [+ o -] 3[grados]C, con fotoperiodo de 16h de luz e intensidad luminosa de 140 [micron]mol fotones x [m.sup.-2] [s.sup.-1] (Jimenez-Aparicio et al., 1996).

Adquisicion de imagenes de los agregados celulares

La captura de imagenes de los agregados se realizo en cada caja de Petri sin abrirla, y para ello se empleo un sistema compuesto por una camara digital CCD de 2,1 megapixeles de resolucion (Nikon, Coolpix E900; Japon) soportada por un tripode fotografico con iluminacion de 2 focos de 100W de luz blanca. La camara se enfoco manualmente manteniendo rija la distancia entre el lente y la caja de Petri. Se obtuvo una imagen de cada agregado (60 imagenes por dia). Este numero de imagenes permite mantener el error estandar por abajo dei 5% (Jimenez et al., 2005). Las imagenes fueron adquiridas en color RGB, tamano de 680x480 pixeles y formato BMP.

[FIGURA 1 OMITTED]

Procesamiento de imagenes, AD1 y DF

Las imagenes se transformaron a escala de grises (8 bits), y se contrastaron modificando el brillo y contraste mediante el programa Corel Photo Paint (V11.0; Corel Corporation, EEUU). Las imagenes contrastadas de los agregados se binarizaron (area de agregado en negro con entorno blanco). Sobre los objetos binarizados se realizo el ADI, que consistio en la medicion de area (A); perimetro (P); diametro de Feret (F), que es el diametro calculado igualando el area del objeto con el area de un circulo; y factor de compacidad (Fc) que es un parametro de irregularidad definido por [P.sup.2] x [A.sup.-1] Para estas mediciones se empleo Sigma Scan Pro (V5.0, SPSS, EEUU). Los valores obtenidos fueron analizados estadisticamente con Excel (Microsoft Corporation, EEUU)

La complejidad de las formas de los agregados fue caracterizada utilizando: a) dimension fractal de area ([D.sub.A]), obtenida con la pendiente dei grafico dEl logaritmo natural dEl area de cada uno de los agregados vs el logaritmo de la longitud del eje mayor; b) dimension fractal de perimetro ([D.sub.p]), que se obtiene como la pendiente resultante del logaritmo natural del area vs el logaritmo del perimetro de cada agregado (Kenkel y Walker, 1996; Katz, 1988).

Dinamica no lineal dei crecimiento de agregados de B. vulgaris

Los cambios de forma de los agregados de B. vulgaris fueron medidos a lo largo de 31 dias. Las formas de los agregados se caracterizaron utilizando los valores de [D.sub.A] y [D.sub.P]. Para analizar la dinamica de los cambios de forma durante los 31 dias del experimento, se aplico un sistema matematico que consiste en el desfase del tiempo, que sirve para diferenciar intervalos de cambios estables e intervalos caoticos. Si durante la dinamica de crecimiento los valores graficados de [D.sub.A] y [D.sub.P] muestran periodicidad y ocurren alrededor de un patron definido, es decir, tienen un atractor, se puede considerar un intervalo cuasi-estable. Si, por otra parte, estos valores de [D.sub.A] y [D.sub.P] no muestran ningun comportamiento periodico, se puede considerar un intervalo caotico. En este sistema matematico, primero se grafico [D.sub.A] vs t en donde, a cada tiempo t le corresponde un valor [D.sub.A]. Despues, se desfaso el tiempo en un dia usando los mismos valores de [D.sub.A], y se grafico [D.sub.A] vs t-1, donde t-1 es el tiempo t menos un dia, o tiempo desfasado. Las dos graficas, [D.sub.A] vs t Y [D.sub.A] VS t-1, se sobreponen en el mismo cuadro grafico y de esta manera se muestran mas evidentes las regiones periodicas y las regiones caoticas durante el crecimiento de los agregados (Johnson et al., 1999).

Resultados y Discusion

El tamano de los agregados de Beta vulgaris L. en cultivo se incremento a lo largo de todo el intervalo de tiempo que se estudio (31 dias), al termino del cual los agregados incrementaron su tamano en promedio casi tres veces respecto a los agregados del tiempo cero. En la Figura 1 se muestra el aumento del area de los agregados durante 31 dias de culti vo y la variacion de tamanos correspondiente a cada dia. Se puede observar que la variabilidad de los tamanos aumenta Al aumentar el tamano de los agregados. Ademas del incremento de tamano, se observo una amplia variedad de formas, lo que se debio probablemente a la multiplicacion de celulas en forma agregada (sin orden aparente). Como las celulas son indiferenciadas la duplicacion no sigue una orientacion coherente, como sucede en el caso de la formacion de tejidos. Como resultado, los agregados tienen formas irregulares (Trejo-Tapia et al., 2003). La medicion del factor de compacidad (Fc) proporciona una medida de irregularidad de los agregados. Cuando el agregado se vuelve mas irregular, el perimetro es mayor que el area. En la Tabla I se presentan algunos resultados dei area y su factor de compacidad correspondiente, observandose un aumento de irregularidad de los agregados hasta el final de la cinetica (31 dias). Los valores de compacidad indican que tan compactos fueron los agregados como una relacion dei perimetro entre el area (Sanchez y Bribiesca, 2003). Cuando el agregado es mas compacto, Fc es cercano a 12, pero cuando el agregado es irregular Fc es >12.

La relacion perimetro / diametro de Feret tambien proporciona un referente acerca de la compactacion de los agregados. Se puede observar que con el paso del tiempo los agregados pierden compactacion y se vuelven irregulares, por lo que el perimetro es mucho mayor que su diametro. Cabe senalar que los datos mostrados en la Tabla I son los promedios de 61 imagenes de agregados celulares que se obtuvieron para cada dia, por lo que se considera que el numero de observaciones es una muestra representativa de una poblacion con distribucion normal. La irregularidad de los agregados puede atribuirse principalmente a la expansion celular. Esta caracteristica ya ha sido descrita para celulas vegetales. Algunos autores (Bidwell, 1979; Leboeuf et al., 2004) consideran que la duplicacion celular tiende a formar extensiones relativamente alargadas en el agregado y entre cada extension se generan espacios vacios. Posteriormente, la duplicacion celular llena los espacios vacios. A esta caracteristica, se le conoce como 'expansion'.

[FIGURA 2 OMITTED]

[FIGURA 3 OMITTED]

Las formas irregulares de los agregados fueron analizadas como objetos complejos, determinando su dimension fractal de area DA y de perimetro [D.sub.P]. En la Figura 2 se presentan algunos contornos de agregados y sus correspondientes valores de [D.sub.A] y [D.sub.P] para diferentes dias de crecimiento. Se puede apreciar que cuando el agregado es mas rugoso o sinuoso tiene valores mayores de [D.sub.P], mientras [D.sub.A] caracteriza la irregularidad global de la forma del agregado. En la Figura 2, se observa que conel tiempo la forma de los agregados se vuelve mas irregular hasta formar extensiones alargadas y los valores de DA son mayores.

[FIGURA 4 OMITTED]

Analisis del crecimiento de los agregados de B. vulgaris como dinamica no lineal

Los datos de [D.sub.A] y [D.sub.P] de los agregados de B. vulgaris correspondientes a cada dia del cultivo se graficaron respecto al tiempo ([D.sub.A] vs t; donde t es el tiempo de crecimiento de los agregados, en dias). Adicionalmente se grafico DA vs t-1 (donde t-1 es el tiempo desfasado en dias). Las graficas [D.sub.A] vs t y [D.sub.A] VS t-1 se presentan en la Figura 3, donde DA tiene comportamiento irregular en distintos intervalos de la cinetica de crecimiento, pero tambien presenta regiones estables (periodicas) en dos intervalos de tiempo: del dia 3 al 11 y del dia 21 al 26. Esta caracteristica tambien se observa en la dinamica de [D.sub.P] vs t y [D.sub.P] vs t-1. En la Figura 4, se observa que los valores [D.sub.P] el tiempo y en el tiempo desfasado, tienen intervalos estables e intervalos caoticos con un patron similar al de la Figura 3. De acuerdo a lo mostrado en la Figura 4 se pueden distinguir tres regiones de cambios de forma durante el crecimiento de los agregados: un intervalo estable hasta el dia 8, despues un intervalo caotico desde el dia 9 hasta el dia 22, y al final un intervalo cuasi-caotico desde el dia 22 hasta el 31.

En el intervalo estable es posible que los agregados cambien de una forma relativamente lisa a otra irregular y nuevamente a liso. Las formas irregulares se pueden deber a la multiplicacion celular formando extensiones radiales dejando espacios vacios entre las extensiones. Despues, las nuevas divisiones celulares llenarian los espacios vacios, y el agregado tendria una superficie mas lisa. A esta caracteristica se le conoce como 'expansion' (Leboeuf et al., 2004).

Despues, en el intervalo caotico (dia 9 al 22 en la Figura 4), se muestran valores altos y bajos de [D.sub.P] sin un patron de orden aparente. En este caso, la division celular del agregado no parece tener un mecanismo de control o regulacion. Tambien, se pueden observar en este intervalo los valores mas altos de irregularidad perimetral ([D.sub.P]= 1,798; perimetro sinuoso).

Finalmente, en un tercer intervalo (desde el dia 22 hasta el dia 31) se observo un relativo regreso al comportamiento oscilatorio, donde se presento un cuasi atractor que reduce el espacio de variaciones de [D.sub.P]. Se espera que al mantener por mas tiempo esta cinetica, ocurra un comportamiento similar a este intervalo, si se mantienen las condiciones de cultivo. Es posible que este comportamiento se deba a la formacion de celulas nuevas que tienden a ser mas diferenciadas y tienden a formar tejidos de raiz, tallo u boja.

El comportamiento oscilatorio en el crecimiento de celulas ha sido referido por Cosgrove (2000), quien lo atribuye a los diferentes cambios en el medio ambiente de la pared celular, tales como potencial redox, pH y especies reactivas de [O.sub.2] (ERO's). Sin embargo, de acuerdo a la bibliografia disponible, estos cambios oscilatorios no habian sido cuantificados, particularmente aplicando el concepto de fractalidad y de dinamica no lineal, por lo que ambos aspectos resultan ser un aporte original.

La determinacion de la dimension fractal permite asignar un valor numerico a objetos complejos, como es el caso de los agregados celulares. Se considera que esta medicion tiene mayor consistencia porque puede caracterizar estructuras complejas independientemente de su tatuano o de la forma aparente, a diferencia de las mediciones que realizan otros descriptores como es el caso del factor de forma, el factor eliptico, etc.

A su vez, la medicion del perimetro y el area esta influenciada por el metodo de observacion y medicion del objeto, por lo que puede establecer una medicion ajustada a un objeto de dimensiones regulares y cuya forma es ideal, es decir, parecido a figuras geometricas euclidianas imposibles de concebir en el crecimiento de un agregado celular.

El desfase del tiempo (Figura 4) permitio evidenciar los intervalos en los que la dinamica de crecimiento ocurria, es decir, los puntos extremos en que fluctuaban los procesos celulares del agregado. De esta manera, el intervalo de crecimiento de los agregados que produjo menos cambios muestra una dinamica de comportamiento estable, en donde es posible establecer patrones celulares de division y crecimiento. Por el contrario, cuando el intervalo de fluctuacion de las mediciones de la [D.sub.A] o [D.sub.P] es amplio, el sistema impide por su propia naturaleza ser predecible, es decir, tiene un comportamiento caotico. En este caso, los procesos celulares de crecimiento son asincronos.

Conclusiones

Los cultivos de Beta vulgaris L. mostraron un aumento de tamano de los agregados durante 31 dias. El aumento de tamano pudo determinarse con ADI y sus medidores de area y perimetro. Durante este crecimiento, la forma de los agregados fue cambiando en el tiempo. En general, los agregados tienen formas irregulares, lo cual fue mostrado por el factor de compacidad. Las diferentes formas tambien fueron caracterizadas con la dimension fractal de area (DA) y perimetro ([D.sub.P]). Los valores de [D.sub.A] y [D.sub.P] obtenidos durante el crecimiento sugirieren cambios de tamano y forma con una dinamica no lineal. Este comportamiento puede ser originado por procesos de expansion y extension de los agregados. Fue posible establecer tres intervalos en la dinamica de crecimiento y cambios de forma: a) un intervalo estable o periodico; b) un intervalo caotico o de crecimiento desordenado; y c) un intervalo cuasi-periodico. La primera etapa muestra la existencia de un atractor. Es posible que en esta etapa la multiplicacion celular y el aumento de volumen celular se den en forma sincronizada. De esta manera, el analisis de la dinamica de crecimiento utilizando el diagrama de desfase del tiempo permitio evidenciar las etapas sincronizadas de crecimiento y las etapas de crecimiento desorganizado.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo es parte de los Proyectos CONACYT 39562 y SIP-IPN 20060394.

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Lino Sanchez Segura. Maestro en Ciencias, Centro de Desarrollo de Productos Bioticos (CEPROB1), Instituto Politecnico Nacional (IPN). Estudiante de Doctorado, Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (ENCB)-IPN.

Jose Jorge Chanona Perez. Doctor en Ciencias, ENCB-IPN, Mexico. Investigador, ENCB-IPN, Mexico.

Roberto Campos Mendiola. Doctor en Ciencias, ENCB-IPN, Mexico. Investigador, CeProBi-IPN, Mexico.

Martha Lucia Arenas Ocampo. Doctora en Ciencias, CEPROBI-IPN, Mexico. Investigadora, CEPROBI-IPN, Mexico.

Antonio Ruperto Jimenez-Aparicio. Doctor en Ciencias, ENCB-IPN, Mexico. Investigador, CEPROBI-IPN, Mexico. Direccion: Apartado Postal 24. Yautepec, Morelos, Mexico. C.P.62731. e-mail: aaparicio@ipn.mx
TABLA I
AREA, FACTOR DE COMPACIDAD Y RELACION PERIMETRO ENTRE DIAMETRO DE
FERET DE LOS AGREGADOS DE B. vulgaris L. TRAS DIFERENTES PERIODOS
DE CRECIMIENTO

                                                         Perimetro /
                      Area                Factor de       Diametro
Dias de           ([mm.sup.2])          compactacion        Feret
crecimiento
                  (X [+ o -] DE)       (X [+ o -] DE)

1              174,6 [+ o -] 38,6    23,4 [+ o -] 4,1      4.28
6              213,7 [+ o -] 53,7    22,3 [+ o -] 3,3      4.19
11             293,2 [+ o -] 96,1    22,3 [+ o -] 4,0       4.2
16             403,1 [+ o -] 164,9   23,1 [+ o -] 3,6       4.2
21             689,9 [+ o -] 288,7   26,3 [+ o -] 6,3       4.5
26             873,1 [+ o -] 350,2   26,5 [+ o -] 4,6       4.6
31            1071,7 [+ o -] 412,3   27,8 [+ o -] 5,3       5.6

X: media, DE: desviacion estandar de 60 mediciones por dia.
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Author:Sanchez Segura, Lino; Jorge Chanona Perez, Jose; Campos Mendiola, Roberto; Arenas Ocampo, Martha L.;
Publication:Interciencia
Date:May 1, 2011
Words:4469
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