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Catuama and bilobalide on peripheral nerve regeneration in rats following sciatic nerve section/A Catuama e o bilobalide na regeneracao nervosa periferica de ratos submetidos a seccao do nervo isquiatico.

INTRODUCAO

Diferentes substancias neuroestimulantes tem sido usadas para investigar o crescimento axonal entre os segmentos nervosos apos seccao transversal. Essas substancias incluem o fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrofico derivado do encefalo (BDNF), colageno, gel com laminina e outros (CHEN et al., 2004).

A Catuama[R] e a associacao de quatro extratos hidroalcoolicos obtidos das seguintes plantas brasileiras: Paullinia cupana (guarana; Sapindaceae) 40,31%; Trichilia catigua (catuaba; Meliaceae) 28,23%; Ptychopetalum olacoides (muirapuama; Olacaceae) 28,23%; e Zingiber officinale (gengibre; Zingiberaceae) 3,26% (CAMPOS et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2005). A Catuama[R], administrada oralmente a ratos por longos periodos, interferiu nos niveis de serotonina e dopamina, sugerindo-se que pode ser usada clinicamente em estagios de depressao leve e moderada, sozinha ou em associacao com farmacos antidepressivos tradicionais (CAMPOS et al., 2004). PONTIERI et al. (2007) observaram que a Catuama[R] reverteu a fibrilacao ventricular, prevenindo sua reinducao e prolongando a conducao intraventricular quando testada em coracao de coelhos. Por outro lado, parece haver seguranca no uso prolongado desse medicamento, tanto e que OLIVEIRA et al. (2005) nao encontraram reacoes adversas severas ou mudancas hematologicas ou bioquimicas em pacientes humanos que receberam a administracao cronica de 25mL de Catuama[R] duas vezes ao dia, por 28 dias.

O bilobalide, extraido das folhas do Ginkgo biloba, apresenta multiplos mecanismos de acao associados a neuroprotecao, incluindo preservacao da sintese de ATP mitocondrial e inibicao de danos induzidos por apoptose e deterioracao de membranas, induzida por isquemia no cerebro (DEFEUDIS, 2002; CHANDRASEKARAN et al., 2003). O bilobalide tambem tem sido utilizado com sucesso na reparacao nervosa periferica por CHEN et al. (2004). Esses autores mostraram que o bilobalide apresentou alta taxa de formacao de cabo de regeneracao e maior numero de axonios mielinizados, quando comparados ao controle. Assim, o presente estudo teve por objetivo verificar, funcional e morfologimente, a acao sistemica da Catuama[R] administrada via oral e a acao local do bilobalide sobre a regeneracao do nervo isquiatico de ratos apos transeccao completa.

MATERIAL E METODOS

Foram utilizados 40 ratos Wistar (Rattus norvegicus), machos, clinicamente sadios, pesando entre 250 e 350g. Os animais foram acomodados em gaiolas individuais, em ambiente controlado a temperatura de 22[degrees]C, em ciclos diarios de 12h de luz. Agua e racao comercial foram oferecidas ad libitum.

Para a realizacao da neurotomia, os animais foram anestesiados com associacao de cetamina (75mg.[kg.sup.-1] IM) e xilazina (10mg.[kg.sup.-1] I.M.), segundo OLIVEIRA, (2010). Apos antissepsia, foi realizada a incisao de pele na face lateral da coxa direita. Fascias e grupos musculares foram separados por disseccao romba. Apos a exposicao do nervo isquiatico direito, foi realizada sua transeccao completa. Em seguida, os segmentos nervosos, proximal e distal, foram introduzidos e fixados ao tubo de silicone com ponto unico em "U" ao epineuro utilizando nailon 9-0, deixando um espaco de 10mm entre os segmentos. O espaco entre os segmentos foi preenchido com solucao contendo uma parte de colageno em fase liquida (Vitrogen 3mg. [ml.sup.-1]) para uma parte de solucao fisiologica com o auxilio de agulha 26G, inserida no lumen da camara de silicone, evitando a formacao de bolhas. Esses procedimentos foram baseados em DELISTOIANOV et. al. (2008). A camada muscular foi reaproximada com fio de nailon 4-0 e a sutura de pele em pontos simples separados com fio de nailon 2-0 (CHEN et al., 2004; HSU et al., 2004).

Os animais foram divididos em quatro grupos, com dez animais cada. Nos grupos A e D, os animais receberam solucao salina via oral (10ml.[kg.sup.-1]) nos primeiros 28 dias apos a cirurgia. Nos grupos B e C, os animais foram tratados, respectivamente, com 100mg.[kg.sup.-1] e 400mg.[kg.sup.-1] de Catuama[R] (Laboratorio Catarinense, Joinville, SC, Brasil) nos primeiros 28 dias de pos-operatorio (VAZ et al., 1997; CAMPOS et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2005). Nos animais do grupo D, foram adicionados 200gM de bilobalide (Sigma) a solucao de colageno (Vitrogen) (CHEN et al., 2004).

A avaliacao funcional foi realizada no preoperatorio, na primeira, quinta e decima semanas de pos-operatorio, por meio da analise do teste de marcha, introduzido por DE MEDINACELI et al. (1982), segundo ABREU et al. (2002). Na decima semana do pos-operatorio todos os animais foram submetidos a anestesia para exposicao dos nervos no local das intervencoes cirurgicas. Para avaliar a recuperacao motora, foram realizadas, com eletroestimulador, modelo AP585 (VMV Biotherapy), estimulacoes dos segmentos nervosos proximais e distais e do cabo de regeneracao formado entre os segmentos nervosos, conforme descrito por DELISTOIANOV et al. (2008). Apos o exame eletrofisiologico, foi realizada a eutanasia dos animais, seguindo-se remocao das porcoes dos nervos isquiaticos do local do implante com tubo de silicone, com as margens (5mm) proximal e distal do nervo. Fragmentos dos musculos gastrocnemios direito e esquerdo foram colhidos e fixados em formalina a 10%, tamponada com fosfatos, pH 7,2. Apos periodo de fixacao, foram incluidos em parafina e obtidos cortes transversais, que foram corados com Hematoxilina e Eosina (HE) e tricromico de Masson (TM), segundo rotina do laboratorio. As amostras foram avaliadas em microscopio de luz. As alteracoes morfologicas dos musculos gastrocnemios foram utilizadas para determinar o grau de atrofia muscular em escala de I a III, correspondendo a atrofia muscular leve, moderada e severa.

As amostras dos nervos foram igualmente fixadas e processadas para inclusao em parafina, obtendo-se cortes transversais de 3[micro]m de espessura, tambem corados pelo HE e TM. Amostras semelhantes tambem foram fixadas em glutaraldeido, pos-fixadas em tetroxido de osmio e incluidas em historesina a base de metacrilato, cortadas com 1[micro]m de espessura, coradas com azul de toluidina (AT) e avaliadas em microscopio de luz.

Os cortes transversais dos segmentos nervosos foram avaliados quanto a presenca de axonios mielinizados, proliferacao axonal, infiltrado de celulas inflamatorias e degeneracao walleriana. Os cortes transversais dos cabos de regeneracao formados entre os segmentos nervosos foram avaliados quanto a area e contagem de axonios mielinizados, utilizando o microscopio Leica DM 5000B com o software Leica Application Suite (LAS) 2.5.1R1.

A analise estatistica foi realizada utilizando o software SAS (Statistical Analisys System), aplicando-se o teste de Tukey para dados parametricos e o teste de Kruskal-Wallis para os dados nao parametricos. O nivel de significancia foi estabelecido em P<0,05.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Foram excluidos da avaliacao do teste de marcha 16 animais: 14 individuos que apresentaram amputacao total ou parcial de um dos digitos (35% do total), e 2 animais (5% do total), que apresentaram lesoes no membro nao operado, provavelmente, devido a aplicacao intramuscular da anestesia, realizada na face caudal da coxa esquerda. O indice de funcao do nervo isquiatico (IFI) variou entre os tempos observados, mantendo o mesmo padrao de distribuicao entre os grupos, nao havendo diferenca entre eles, segundo a tabela 1, exceto na semana 0, antes dos animais serem submetidos ao procedimento cirurgico. Os cabos de regeneracao (CR) formados apresentavam diametro visivelmente inferior aos segmentos nervosos de origem. Houve formacao de cabo de regeneracao em todos os animais do grupo B, enquanto 80% dos animais formaram cabo de regeneracao no grupo controle, todavia essa diferenca nao foi significativa (tabela 2).

Os resultados da avaliacao da resposta de contracao muscular a eletroestimulacao (tabela 2) foram positivos em todos os animais que apresentaram cabo de regeneracao, exceto em um animal do grupo A (controle), que apresentou cabo de regeneracao nao responsivo a estimulacao eletrica. A resposta a estimulacao eletrica nao apresentou diferenca entre os grupos experimentais. A presenca de resposta positiva em todos os animais que formaram cabo de regeneracao, exceto um, demonstrou que, na decima semana de pos-operatorio, o cabo de regeneracao formado pelo segmento nervoso proximal foi capaz de alcancar seu orgao alvo e transmitir o estimulo eletrico, levando a contracao muscular. Os cabos de regeneracao formados foram avaliados em relacao as suas areas em corte transversal, nao demonstrando diferenca (P<0,05) entre os grupos (Tabela 2).

Pela analise histologica dos cabos de regeneracao, notou-se a presenca de grande quantidade de axonios, axonios mielinizados e em processo de mielinizacao. Presenca de grande quantidade de vasos sanguineos e hemossiderina (Figura 1A e B). Esse pigmento e derivado do metabolismo de ferro e e um indicativo de hemorragia pos-seccao nervosa. Quanto a proliferacao axonal, os cabos de regeneracao foram avaliados pela contagem do numero de axonios mielinizados por area ([micro][m.sup.2]). Os resultados estao apresentados na tabela 2 e indicam nao haver diferenca (P<0,05) entre os grupos experimentais. A presenca de axonios mielinizados (Figura 1E e F) e um indicio histologico de reparacao nervosa periferica e esta de acordo com os achados da avaliacao funcional e avaliacao eletrofisiologica, demonstrando que os cabos de regeneracao formados foram capazes de alcancar seus orgaos-alvo e transmitir estimulo eletrico, causando contracao muscular e melhorando a qualidade da pegada.

Os segmentos nervosos proximais apresentaram a microscopia de luz, em corte transversal, aspecto tipico de um nervo periferico, constituido por varios fasciculos, cada qual com muitas fibras nervosas. O epineuro do feixe nervoso e o perineuro de cada fasciculo apresentaram-se caracteristicos. Observaram-se ainda, fibras nervosas em espessuras diferentes, com revestimento mielinico e morfologia muito proxima do normal. A mielina ficou muito bem evidenciada na cor vermelha pelo TM.

Os segmentos nervosos distais foram avaliados em relacao ao grau de degeneracao nervosa (GDSD), em uma escala de I a IV. A diferenca foi nitida entre os animais que nao apresentaram cabo de regeneracao (Figura 1C) e os animais em que houve a formacao do cabo (Figura 1D). Nao houve diferenca (P<0,05) entre os grupos em relacao ao GDSD, entretanto, o grupo B apresentou a menor media de GDSD, seguido dos grupos C e D, que tambem tiveram desempenho superior ao grupo controle (Tabela 2). O unico animal que formou cabo de regeneracao entre os segmentos nervosos e teve resposta negativa ao estimulo eletrico, apresentou grande quantidade de tecido conjuntivo e poucos axonios mielinizados no cabo de regeneracao. Apresentou, ainda, grau IV de degeneracao do segmento distal, semelhante aos animais que nao formaram cabo de regeneracao. A atrofia do musculo gastrocnemio, diretamente relacionada ao processo de desnervacao do musculo pelo nervo isquiatico, apresentou-se mais acentuada nos animais que nao formaram cabo de regeneracao (Figura 1G), quando comparada aos animais que formaram cabo de regeneracao e tinham resposta positiva de contracao muscular a eletroestimulacao. Todavia, nao houve diferenca (P<0,05) com relacao ao grau de atrofia muscular entre os grupos experimentais.

A regeneracao nervosa periferica e um assunto amplamente estudado por diversos grupos de pesquisa em todo o mundo. A recuperacao funcional de um nervo lesado continua sendo um desafio clinico em diferentes especies. A hipotese avaliada foi a potencial acao neuroprotetora da Catuama[R] no SNP e sua interferencia no processo de regeneracao nervosa periferica. Os achados encontrados na avaliacao pelo teste da funcao do nervo isquiatico foram compativeis com os encontrados por MONTE-RASO et al. (2008). Nas primeiras semanas de avaliacao, as pegadas analisadas tinham qualidade insatisfatoria, entretanto, nas avaliacoes seguintes, a analise das pegadas foi realizada com mais facilidade. Todas as avaliacoes foram realizadas pelo mesmo examinador, que nao conhecia a origem dos grupos. Os achados do teste de funcao do nervo isquiatico foram compativeis com os achados histologicos, histomorfometricos e eletrofisiologicos, indicando viabilidade de execucao do experimento e fidedignidade de resultados.

A avaliacao eletrofisiologica, segundo a tecnica de DELISTOIANOV et al. (2008), foi adequada para a avaliacao dos efeitos da catuama e do bilobalide na regeneracao nervosa periferica, apesar de ser uma analise qualitativa, dando como resultado apenas positivo ou negativo. Entretanto, LABRADOR et al. (1998) e de MURAKAMI et al. (2003), utilizando mensuracao do potencial evocado, realizaram uma analise quantitativa da capacidade de condutividade eletrica do nervo. A analise das biopsias nervosas demonstrou que o periodo de 10 semanas foi suficiente para a formacao de um cabo de regeneracao com presenca de grande quantidade de axonios mielinizados e em processo de mielinizacao. Esses achados foram compativeis com o retorno da capacidade de transmissao do estimulo eletrico e contracao muscular e com a melhora da qualidade da pegada no teste de funcao do nervo isquiatico, observado em todos os grupos experimentais.

O grupo bilobalide apresentou uma porcentagem de formacao de cabo de regeneracao de 88,89%, nao apresentando diferenca em relacao ao controle, que obteve 80% de formacao. CHEN et al. (2004) obtiveram 50% de formacao de cabo de regeneracao quando utilizaram a mesma dose de 200pg, mas com um intervalo entre os segmentos nervosos de 15mm, num periodo de oito semanas. No experimento citado, a porcentagem de formacao do cabo de regeneracao do grupo controle foi de apenas 10%. O tamanho do intervalo entre os segmentos nervosos e o tempo de observacao posoperatoria pode ter sido responsavel pela divergencia de resultados encontrada entre os experimentos. Talvez o efeito benefico do bilobalide tenha ficado evidente no modelo de CHEN et al. (2004), por haver um intervalo maior entre os segmentos nervosos e, portanto, em condicoes de maior adversidade a regeneracao. Assim, a hipotese da Catuama[R] e seus componentes que tem acao no sistema nervoso central (CAMPOS et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2005) terem acao sobre a regeneracao nervosa periferica, talvez, possa ser demonstrada por modelos experimentais que aumentem o desafio a reparacao nervosa periferica por meio de intervalos mais longos entre os segmentos nervosos.

A Catuama[R] e o bilobalide podem ter apresentado algum efeito nas fases iniciais da reparacao nervosa durante as primeiras semanas de pos-operatorio. Todavia, esse possivel efeito so foi analisado pela avaliacao funcional, que apresenta baixa confiabilidade, como demonstrado por MONTE-RASO et al. (2008), justamente nas primeiras semanas apos a cirurgia. Uma proposta para a avaliacao deste possivel efeito seria aumentar os grupos experimentais, fazendo a analise histologica e histomorfometrica destes novos grupos durante as primeiras semanas de pos-operatorio.

CONCLUSAO

A regeneracao do nervo isquiatico em camara de silicone, acrescido de colageno liquido, pode ser considerada satisfatoria, servindo de subsidio para outros estudos. Por outro lado, a Catuama[R] nas doses avaliadas e o bilobalide nao demonstraram efeitos significativos sobre a regeneracao do nervo, tanto em termos funcionais quanto estruturais.

AGRADECIMENTO

A Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP), pela concessao de recursos.

COMITE DE ETICA E BIOSSEGURANCA

O trabalho foi aprovado pela Comissao de Etica e Bem Estar Animal da Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias da Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho", protocolo no. 021338-06, e os estudos em animais foram realizados de acordo com normas eticas.

Recebido 20.07.13

Aprovado 09.09.13

Devolvido pelo autor 19.03.14

CR-2013-0972.R1

REFERENCIAS

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Rodrigo Norberto Pereira (I) Nadia Delistoianov (II) Joao Henrique Perotta (III) Georgia Mode Magalhaes (IV) Samantha Mesquita Favoretto (V) Antonio Carlos Alessi (VI)

(I) Departamento de Medicina Veterinaria, Universidade Federal de Lavras (UFLA), CP 3037, 37200-000, Lavras, MG, Brasil. E-mail: rodrigonor4ertopereira@gmail.com. Autor para correspondencia.

(II) Profissional autonoma, Jaboticabal, SP, Brasil.

(III) Centro de Ciencias Agrarias, Ambientais e Biologicas (CCAAB), Universidade Federal do Reconcavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas, BA, Brasil.

(IV) Programa de Pos-graduacao em Medicina Veterinaria de Pequenos Animais, Universidade de Franca (Unifran), Franca, SP, Brasil.

(V) Programa de Pos-graduacao em Ciencia Animal, CCA, UFPB, Areia, PB, Brasil.

(VI) Departamento de Patologia Veterinaria, Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias (FCAV), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal, SP, Brasil.

Tabela 1--Medias dos valores do indice de funcao do isquiatico (IFI)
de ratos Wistar (Raitus norvegicus), submetidos a seccao de nervo
isquiatico, seguida da reparacao com tubo de silicone preenchido por
colageno liquido e tratados com solucao fisiologica (grupo A,
controle), Catuama[R] nas doses de 100mg [kg.sup.-1] (grupo B) e 400mg
[kg.sup.-1] (grupo C) e bilobalide na dose de 200 [micro]M (grupo D).

Semana                              Grupo
              A              B              C              D

0        -0,501 (aA)    -9,599 (aAB)   -6,216 (aAB)   -20,827 (aB)
1        -48,422 (bA)   -53,023 (bA)   -54,495 (bA)   -64,769 (bA)
5        -69,089 (bA)   -78,299 cA     -67,892 (bA)   -80,596 (bA)
10       -68,498 (bA)   -65,35 bcA     -68,777 (bA)   -65,941 (bA)

Medias seguidas de letras minusculas distintas na mesma coluna e
maiusculas distintas na mesma linha diferem entre si pelo teste Tukey
(P<0,05). A: grupo controle, B: grupo Catuama[R] 100mg, C: grupo
Catuama[R] 400mg e D: grupo bilobalide 200[micro]M.

Tabela 2--Numero de axonios por area em [[mu].sup.2](NA), presenca de
cabo de regeneracao (CR), eletroestimulacao positiva (EE), area do
cabo de regeneracao (ACR), grau de degeneracao do segmento distal
(GDSD) e grau de atrofia do musculo gastrocnemio do membro operado
(GAM) de ratos Wistar (Rattus norvegicus), submetidos a seccao de
nervo isquiatico, seguida da reparacao com tubo de silicone preenchido
por colageno liquido e tratados com solucao fisiologica (grupo A,
controle), Catuama[R] na dose de 100mg [kg.sup.-1] (grupo B) e 400mg
[kg.sup.-1] (grupo C) e bilobalide na dose de 200[micro]M (grupo D).

Parametro                               Grupo                  CV(%)
                          A         B         C         D

NA (1)                 0,0546    0,0523    0,0598    0,0629    19,15
CR(%)*                 80        100       88,89     90        --
EE(%)*                 70        100       88,89     90        --
ACR (1)                256558    274068    223276    252259    3,43
  ([micro][m.sup.2])
GDSD                   2,7 (a)   1,5 (a)   2,0 (a)   2,1 (a)   --
GAM                    2,2 (a)   2,0 (a)   2,1 (a)   2,3 (a)   --

(1) Nao houve diferenca significativa pelo este Tukey (P>0,05). A:
grupo controle, B: grupo Catuama[R] 100mg, C: grupo Catuama[R] 400mg;
e D: grupo bilobalide 200[micro]M. CV: coeficiente de variacao. *
Valores referentes a percentagem de presenca de CR ou EE.
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Author:Pereira, Rodrigo Norberto; Delistoianov, Nadia; Perotta, Joao Henrique; Magalhaes, Georgia Mode; Fav
Publication:Ciencia Rural
Article Type:Report
Date:May 1, 2014
Words:3690
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