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Caracterizacion y evaluacion de virulencia en aislamientos de Rhizoctonia solani Kuhn, causante de la mancha bandeada en maiz.

SUMMARY

In Venezuela, banded leaf spot caused by Rhizoctonia solani Kuhn is a widely distributed disease in the most important maize growing areas, causing important yield losses. In 2004, experiments were conducted with the purpose of characterizing and evaluating the virulence of 25 isolates of R. solani. Characterization tests were performed throughout cultural, microscopic, and molecular evaluations, the latter using a specific ribosomal internal transcribed spacer region (rADN-ITS). Virulence tests were performed on the maize inbred lines CML-254 y L-8220122-1-1, both in the laboratory using KIN solution (6-furfurilaminopurine), and in a greenhouse inoculating seedlings. Cha racterization tests demonstrated that all isolates belong to R. solani, although differences were observed in colony color, mycelial growth and sclerotia size, among others. Molecular analysis classified all isolates within the R. solani anastomosis group AG1-IA. Virulence tests performed in the laboratory showed that the isolates G1SOM1 and P2TUR3 had the highest virulence index. In greenhouse tests B1TOR1, P2TUR6, and B2SAB1 resulted more virulent. In both virulence tests, the line CML-254 showed the highest level of resistance to disease. The isolates identified and characterized in this study may be used by maize breeding programs looking for resistant sources and improved cultivars.

RESUMEN

En Venezuela la mancha bandeada del maiz, causada por Rhizoctonia solani Kuhn, tiene una alta incidencia y distribucion en las principales zonas maiceras, causando disminucion de los rendimientos. En 2004 se condujeron ensayos con el objetivo de caracterizar y evaluar la virulencia de 25 aislamientos de R. solani. Para la caracterizacion se realizaron evaluaciones culturales, microscopicas y moleculares, estas ultimas utilizando una secuencia de amplificacion especifica de la transcrita region espaciadora interna del ADN ribosomal (rADN-ITS). Para la evaluacion de la virulencia se realizaron pruebas de inoculacion en las lineas de maiz CML-254 y L-82201-22-1-1, tanto en laboratorio, usando una solucion de cinetina (6-furfuril-amino-purina), como en invernadero, inoculando plantulas. Las pruebas de caracterizacion demostraron que los aislamientos efectivamente correspondian a R. solani, aun cuando hubo diferencias en el color de las colonias, crecimiento micelial y tamano de esclerocios, entre otras. El analisis molecular demostro que los aislamientos pertenecen al grupo de anastomosis AG1-IA. En la prueba de inoculacion en laboratorio los aislamientos G1SOM1 y P2TUR3 tuvieron mayor Indice de virulencia. En invernadero los aislamientos mas virulentos fueron B1TOR1, P2TUR6 y B2SAB1. La linea CML-254 mostro el mayor nivel de resistencia a la enfermedad en ambas pruebas de virulencia. Los resultados permitieron identificar y caracterizar aislamientos que pueden ser utilizados en programas de mejoramiento genetico para la identificacion de posibles fuentes de resistencia y en la evaluacion del germoplasma mejorado.

PALABRAS CLAVE / Grupo de Anastomosis / Maiz / Mancha Bandeada / Rhizoctonia solana / Virulencia / Zea mays /

RESUMO

Na Venezuela a mancha bandeada do milho, causada por Rhizoctonia solani Kuhn, tem uma alta incidencia e distribuicao nas principais areas de plantio de milho, causando diminuicao do rendimento. Em 2004 foram conduzidos ensaios com o objetivo de caracterizar e avaliar a virulencia de 25 isolamentos de R. solani. Para a caracterizacao se realizaram avaliacoes culturais, microscopicas e moleculares, estas ultimas utilizando uma sequencia de amplificacao especifica da regiao espacadora transcrita interna do DNA ribossomal (rDNA-ITS). Para a avaliacao da virulencia se realizaram provas de inoculacao nas linhas de milho CML-254 e L-82201-22-1-1, tanto em laboratorio, usando uma solucao de cinetina (6- furfuril-amino-purina), como em estufa, inoculando plantulas. As provas de caracterizacao demonstra ram que os isolamentos efetivamente correspondiam a R. solani, ainda quando houve diferencas na cor das colonias, crescimento micelial e tamanho de esclerocios, entre outras. A analise molecular demonstrou que os isolamentos pertencem ao grupo de anastomosis AG1-IA. Na prova de inoculacao em laboratorio os isolamentos G1SOM1 e P2TUR3 tiveram maior indice de virulencia. Em estufa, os isolamentos mais virulentos foram B1TOR1, P2TUR6 e B2SAB1. A linha CML-254 mostrou o maior nivel de resistencia a enfermidade em ambas provas de virulencia. Os resultados permitiram identificar e caracterizar isolamentos que podem ser utilizados em programas de melhoramento genetico para a identificacao de possiveis fontes de resistencia e na avaliacao do germoplasma melhorado.

Introduccion

En el ambito mundial el cultivo de maiz ocupa el tercer lugar de produccion despues del arroz y el trigo. En Venezuela el maiz se encuentra ubicado en segundo lugar despues del arroz y, debido a su alto valor nutritivo y el gran impacto socioeconomico, es considerado de gran importancia como alimento estrategico en la poblacion y como subproducto en la elaboracion de alimentos concentrados para animales (Bastidas, 2003).

La planta de maiz, aunque de reconocida adaptabilidad, frecuentemente sufre enfermedades que alteran su funcionamiento normal, modificando su desarrollo y reduciendo o anulando su produccion (Fontana y Gonzalez, 2000). Durante los ultimos anos se han agudizado los problemas ocasionados por el hongo Rhizoctonia solani Kuhn en plantaciones de maiz, provocando reducciones importantes en los niveles de productividad. En Venezuela la enfermedad se ha sefialado desde el ano 1995, afectando severamente hojas, tallos y mazorcas en estado de madurez en siembras de maiz en la colonia agricola de Turen, estado Portuguesa (Cardona et al., 1999).

Este problema ha ganado la atencion de investigadores en diferentes areas del cultivo, asi como tambien de los productores, quienes demandan una respuesta rapida para superarlo, llegando incluso a considerarse potencialmente mas importante que las limitantes abioticas y de manejo agronomico, por la dificultad en encontrar a corto plazo medidas culturales, controles quimicos o resistencia genetica para combatir el patogeno (Cabrera y Garcia, 2000).

R. solani, estado anamorfo de Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk., es un usual habitante del suelo con un amplio rango de hospedantes, caracteristicas que lo convierten en un enemigo peligroso y dificil de controlar, porque ademas sobrevive como saprofito y ano tras ano su presencia se incrementa (Cabrera, 2002; Bastidas, 2003). Se ha establecido que las cepas de R. solani que afectan al maiz, pertenecen al grupo de anastomosis AG1-IA (Hernandez et al., 2003a).

El objetivo del presente estudio fue caracterizar y evaluar la virulencia de 25 aislamientos de R. solani AG1-IA, obtenidos de plantaciones de maiz en diferentes localidades de Venezuela, a fin de identificar los aislamientos mas virulentos para posteriormente orientar programas de mejoramiento dirigidos hacia la busqueda de cultivares de maiz resistentes al patogeno.

Materiales y Metodos

Origen de los aislamientos. Los 25 aislamientos de R. solani fueron obtenidos de una seleccion de esclerocios tomados de materiales infectados que fueron colectados durante los anos 2002 y 2003 por investigadores de la Fundacion Agricola DANAC, en diferentes localidades de los estados venezolanos de Portuguesa, Guarico, Yaracuy y Barinas (Tabla I). El cultivo patron del grupo de anastomosis AG1-IA de R. solani fue donado por Nelly Delgado, del Instituto Nacional de Investigaciones Agricolas (INIA), Portuguesa, Venezuela.

Obtencion de los aislamientos. Para la desinfeccion de los esclerocios, estos fueron sumergidos por 3min en solucion de cloro al 1%; luego fueron lavados con agua destilada esteril, secados en papel absorbente, sembrados asepticamente en placas con agar-agua (AA) y colocados en condiciones de laboratorio (22-24[grados]C). Cada aislado se purifico por transferencia de apices hifales a placas de Petri con agar-papa-dextrosa (PDA). Los aislamientos fueron caracterizados en funcion de la morfologia hifal y la condicion nuclear. Los inoculos utilizados en todas las pruebas fueron discos de agar-micelio (6mm diametro) extraidos del margen de cultivos de 4-5 dias en placas con PDA incubadas en condiciones de laboratorio.

Caracterizacion nuclear. Se utilizaron cultivos producidos durante 4-5 dias en placas de Petri que contenian 15ml de AA, bajo condiciones de laboratorio. Se extrajeron circulos delgados de agar-micelio (12mm diametro) que fueron colocados sobre portaobjetos y tenidos con safranina O y azul de anilina al 0,5%, para contabilizar el numero de nucleos por celula y medir el grosor de las hifas (Johansen, 1940).

Crecimiento y caracterizacion hifal. Los aislamientos fueron subcultivados en placas con PDA y mantenidos incubados en condiciones de laboratorio. Por cada tratamiento (25 cepas) se usaron tres repeticiones en un diseno aleatorio. Se medio el crecimiento micelial en [cm.sup.2] a las 48h. La caracterizacion se hizo durante cuatro semanas, sobre la base del color de la colonia, caracteristicas del micelio e inicio de la formacion, maduracion, color y tamano de los esclerocios.

Evaluacion de Virulencia. Se realizaron dos pruebas, una a nivel de laboratorio utilizando placas Petri con solucion de cinetina y otra en invernadero. Los analisis de la variancia y la discriminacion de las medias, en ambos ensayos, fueron realizados empleando el programa SAS JMP 5.012.

Ensayo de virulencia en solucion de cinetina. Dos lineas de maiz (CML-254 y L-82201-22-1-1) del banco de germoplasma de la Fundacion DANAC fueron sembradas y mantenidas en invernadero. Para tales propositos se usaron envases plasticos con 2kg de sustrato previamente esterilizado. Los 25 aislamientos de R. solani se multiplicaron sobre granos de atroz esterilizados en autoclave a 121[grados]C y 151b durante 15min. De plantas de maiz con 30-35 dias de edad, se cortaron hojas completas y se dividieron en segmentos de 8cm de largo que fueron lavados con agua y colocados en capsulas de Petri que contenian 8ml de solucion de cinetina (6-furfuril-amino-purina) a 2ppm. Los segmentos foliares fueron inoculados aplicando en la superficie adaxial un grano de arroz colonizado por el correspondiente aislamiento. Seguidamente, las placas se incubaron a 22-24[grados]C por tres dias.

El desarrollo de la enfermedad se evaluo a las 24h de inoculacion, utilizando la escala de Ahuja y Payak (1981), que consiste de grados de 0 a 5 segun el porcentaje de area afectada de la hoja, a saber 1: 3,4%; 1.5: 10,8%; 2: 11,4%; 2.5: 23,6%; 3: 32,0%; 3.5: 38,0%; 4: 39,2%; 4.5: 45,0%; y 5: 53,4% de area afectada. La prueba se establecio en un diseno completamente aleatorio con 3 repeticiones y en arreglo factorial con los siguientes factores: horas, cepa, genotipo y sus interacciones.

Ensayo de virulencia en invernadero. De las lineas CML-254 y L-82201-22-1-1 se sembro una semilla por punto sobre tierra esterilizada. Se emplearon 13 mesones de 60x120cm y 20cm de espesor. Cada meson fue dividido en dos partes iguales, para utilizar un total de 25. Cada mitad tenia 14 hileras con 12 plantas, repartidas entre los dos genotipos, donde cada hilera representa una repeticion. Cada parte fue inoculada con un aislamiento, para lo cual se coloco un circulo de PDA colonizado de cada uno de los aislamientos en la primera hoja verdadera entre la vaina y el tallo de la planta a los 12 dias de edad (dde; Figura 1a). La evaluacion se realizo 7 dias despues de la inoculacion (ddi), utilizando para ello una escala de cinco pasos, basada en la altura relativa o avance de la lesion, a saber 1: <5% de la altura de la planta, 2: 5-15%, 3: 16-35%, 4: 36-65%; y 5: >66% de la altura de la planta y muerte de las mismas (Figura 1b).

[FIGURA 1 OMITIR]

El experimento se establecio mediante un diseno completamente aleatorio, con un arreglo factorial y siete repeticiones. El factor genotipo se analizo en dos niveles, susceptible y resistente, y el factor cepa en 25 niveles correspondientes a los diferentes aislamientos.

Identificacion del grupo de anastomosis mediante rADN-ITS. Este metodo permite la identificacion de manera precisa y rapida de los grupos de anastomosis de los aislamientos (Hernandez et al., 2003a). Para la extraccion de ADN de cada aislamiento y del patron AG1-IA usado como control, se utilizaron cultivos puros multiplicados en medio liquido. El micelio fue filtrado y lavado con agua esteril para la obtencion de la masa que fue macerada en [N.sub.2] liquido y luego sele agrego buffer de extraccion (CETAB 2%, 750[micron]l; Mercaptoetanol, 15[micron]l). El extracto con ADN fue transferido a tubos de microcentrifuga e incubados por 30min a 65[grados]C, mezclando por inversion cada 8min. Se agrego 300[micron]l de acetato de potasio 3M (pH 4,8) e inmediatamente fue incubado en hielo por 15min y luego centrifugado a 12000rpm por 9min. El sobrenadante fue transferido a tubos de microcentrifuga y se le agrego 200[micron]l de cloroformo isoamilico (24:1), mezclando por inversion; despues fue centrifugado a 12000rpm por 9min a 4[grados]C. El sobrenadante fue transferido a tubos de microcentrifuga donde se afiadio 750[micron]l de etanol 100%, se incubo sobre hielo por 10min y se centrifugo a 18000rpm por 9min. Tras descartar el sobrenadante, se lavo 2 veces con 500[micron]l de etanol 70%, para luego centrifugar a 9000rpm por 9min por cada lavado. El sobrenadante fue desechado y se dejo secar en papel de filtro. El precipitado fue resuspendido en 100[micron]l de tampon TE y almacenado a 40[grados]C.

La amplificacion rDNA-ITS fue realizada usando los primers ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') y ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Cada 30[micron]l de reaccion de PCR tuvo 2,0[micron]1 de ADN, 3[micron]l de buffer 10X, 19[micron]l de agua destilada, 0,6[micron]l de dNTP'S 10mM, 1,8[micron]l de [Mg.sup.+2] 25mM, 3[micron]l de primers (10X) y 0,6[micron]l de Taq DNA polimerasa. Se amplifico durante 35 ciclos a una temperatura de alineacion de 58[grados]C. El producto de amplificacion fue digerido con la mezcla de las enzimas AluI y HaeIII, en donde 6[micron]l del producto del PCR fue mezclado con 1,5[micron]l de tampon-2, 5,5[micron]l de agua destilada y 1[micron]l de cada enzima y se incubo a 37[grados]C por 3h. Se corrio una electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% (PAGE), para luego realizar la tincion con plata al 0,2%. Posteriormente se analizo el patron de bandas.

Resultados y Discusion

Caracterizacion microscopica de los aislamientos

En todos los materiales examinados se observaron hifas formando angulos rectos, constricciones en el punto de origen de las ramificaciones e inmediatamente por encima de este sitio presentaban un septo. La caracterizacion nuclear de los aislamientos tenidos con azul de anilina permitio la observacion de celulas somaticas con 3-6 nucleos. Para la caracterizacion del genero Rhizoctonia es necesario determinar el numero de nucleos que presentan las celulas vegetativas y en funcion de ello se pueden diferenciar Rhizoctonia binucleadas o multinucleadas (Parmeter y Whitney, 1970).

Entre las observaciones microscopicas realizadas (Tabla II) se puede senalar que el grosor de hifas estuvo comprendido entre valores promedio de 8,0 y 12,5[micron]m. Los aislamientos P1VP1, G1SOM1, P2TUR3 y P1VP3 mostraron un mayor grosor de hifas, con valores de 12,5; 10,8; 10,5 y 10,5[micron]m, respectivamente; mientras que el menor grosor de hifas correspondio al aislamiento P2TUR4, con 8,0[micron]m. Los aislamientos restantes mostraron valores intermedios.

La evaluacion morfologica de las colonias producidas en PDA de cada uno de los aislamientos, permitio tambien la caracterizacion cualitativa de este patogeno. Las caracteristicas mas resaltantes fueron: a) micelio blanco en colonias jovenes, tornandose posteriormente amarillentas a marron en todo el plato; b) formacion de esclerocios, al principio de color blanco y posteriormente se tornan de color marron y sin forma definida, apreciandose esclerocios semiesfericos, globosos o sencillamente de forma irregular con base aplanada; c) esclerocios de diferentes tamanos, y en ciertas ocasiones aparecieron como masas de mayor tamano; d) ocasionalmente se observo un exudado color ambar sobre los-esclerocios. Todas las caracteristicas descritas coinciden con las reportadas por otros investigadores (Carling y Summer, 1992; Cedeno et al., 1996; Cardona et al., 1999; Da Silveira et al., 2000).

El analisis de varianza aplicado a las variables morfologicas evaluadas (grosor, dias de aparicion y dias de maduracion de los esclerocios) detecto diferencias altamente significativas entre los aislamientos (Tabla III). La prueba de comparacion de medias realizada para la variable grosor de esclerocios, permitio separar cuatro grupos que presentaron valores estadisticamente similares. Los aislamientos G1SOM1 y B1TOR1 presentaron un mayor grosor, con valores de 4,68 y 4,50mm respectivamente. La mayoria presento esclerocios de tamano intermedio, con valores que oscilaron entre 3,80 y 1,80mm. Para los aislamientos P2TUR1 y P2TUR5 no se presentan valores porque no desarrollaron esclerocios.

En relacion al tiempo de formacion de esclerocios, la prueba permitio separar siete grupos. Aislamientos con valores entre 3,33 y 6,33 dias, fueron los que desarrollaron esclerocios en un menor tiempo, y entre estos se destacaron G2TIZ1 con valor promedio de 3,33 dias, y P1VP1 y G1SOM1 con 3,67 dias. El aislamiento P2AB2 fue el que tardo mas en formar esclerocios (14 dias). Con respecto al tiempo de maduracion, existe una relacion directamente proporcional a la formacion de esclerocios. El estudio de las caracteristicas de los esclerocios se realizo con el fin de evaluar el comportamiento de los 25 aislamientos de R. solani en busqueda de diferencias que permitan relacionar la capacidad de la cepa para desarrollar la enfermedad y colonizar areas (suelos o plantas) en forma agresiva o severa, dependiendo del caso. En tal sentido, las cepas que producen esclerocios maduros en menor tiempo, tienen mayor posibilidad de escapar a cualquier medida de control, de incrementar ciclo tras ciclo la cantidad de inoculo y una mayor probabilidad de diseminacion.

En lo que respecta al desarrollo micelial, los resultados mostraron diferencias altamente significativas entre los aislamientos probados (Tabla IV). Los aislamientos con mayor desarrollo micelial a las 48h fueron P2TUR4, P1VP1, P1VP2, P2TUR2, P1VP3, G2TIZ3, con valores promedios entre 63,62 y 55,24[cm.sup.2]; grupos de desarrollo micelial intermedios, con intervalos entre 45,57 y 16,17[cm.sup.2], y el grupo con menor desarrollo, entre 14,18 y 1,07[cm.sup.2], estuvo conformado por Y2SP1 y P1VP4. La mayor capacidad de crecimiento micelial pudiera relacionarse con la virulencia, es decir, con la capacidad de causar mas dano sobre el hospedante.

Evaluacion de la Virulencia

Los modelos utilizados para el analisis de los datos correspondientes a las pruebas de virulencia en invernadero y en solucion de cinetina, estan registrados en la Tabla V, donde se aprecia un alto grado de confiabilidad y de significacion, detectando diferencias para todas las fuentes estudiadas, excepto para las interacciones hora x linea y horas x cepa x lineas. En ambas pruebas, el comportamiento de la virulencia de las cepas fue variable, al igual que el de las lineas de maiz. Hubo diferencias en agresividad entre las cepas, por cuanto la interaccion cepa x hora fue significativa y, ademas, se observo que no todas las cepas causan el mismo grado de dano en igual tiempo.

Virulencia en solucion de cinetina

Las observaciones realizadas permiten sefialar que los aislamientos de R. solani comienzan su crecimiento sobre el tejido foliar de manera casi inmediata y al termino de 12h ya es posible apreciar sintomas de infeccion. La linea CML-254 fue significativamente menos afectada por los aislamientos que la L-82201-22-1-1.

Los resultados indican diferencias altamente significativas en la virulencia o nivel de dano de los aislamientos (Tabla VI). Los mas virulentos fueron G1SOM1, P2TUR3, Y2SP1, P2TUR2 y P2TUR5, con valores en la escala de Ahuja y Payak (1981) de 2,78; 2,69; 2,58; 2,47; y 2,47, respectivamente, mientras que los menos virulentos fueron G2TIZ2, P2TUR7 y P1VP2, con medias de 1,69; 1,69 y 1,64, respectivamente. Los aislamientos restantes tuvieron valores intermedios.

La alta significacion estadistica observada en la interaccion cepasxlineas indica que cada cepa se comporta de manera diferente dependiendo de la linea, lo que dificulta aun mas el estudio de los aislamientos (Figura 2).

[FIGURA 2 OMITIR]

Al examinar la interaccion existente entre cepas y lineas (Figura 2b) se observo que 16 cepas mostraron mayor grado de virulencia sobre la linea L-82201-22-1-1 en comparacion con los danos causados sobre la linea CML-254. Los 9 aislamientos restantes (lineas discontinuas) mostraron una tendencia Contraria.

Para R. solani, la formacion del cojin de infeccion es de gran importancia para la invasion y posterior in feccion del tejido y la opinion mas comun es que los exudados de la planta estimulan la formacion de esas estructuras. Las diferencias en formacion posiblemente determinaron el nivel de virulencia y el comportamiento diferencial entre los aislamientos (Armentrout et al., 1987). La severidad de las enfermedades esta directamente relacioiaada con la formacion de estructuras de infeccion y esta habilidad es estimulada por el hospedante (Marchall y Rush, 1980).

Los diferentes modos de penetracion empleados por los hongos fitopatogenos dependen del aislamiento, del grupo de anastomosis, las especies de plantas y la parte afectada de la planta (Dodman et al., 1968a, b). Es por eso que las respuestas de virulencia difieren, en algunos casos, cuando se compara el ensayo de invernadero y el de la solucion de cinetina; en uno el dano es a nivel del tallo y en el otro en el tejido foliar, tratandose de dos mecanismos de penetracion.

Virulencia en condiciones de invernadero

El sintoma inicial pudo ser apreciado en el punto de inoculacion; al comienzo se observo una decoloracion del tejido, que se torno color crema y posteriormente marron. Con el desarrollo de la enfermedad, las lesiones se hicieron de mayor tamano hasta cubrir, en la mayoria de los casos, todo el perimetro del tallo, alcanzando posteriormente la vaina y la lamina foliar. Esta sintomatologia es similar a la descrita por otros investigadores (Ahuja y Payak, 1978; Bastidas, 2003; Cabrera y Garcia, 2000; De Leon, 1995).

Al igual que el ensayo anterior, se detecto diferencias altamente significativas entre los aislamientos (Cuadro VI), siendo los mas virulentos B1TOR1, P2TUR6, B2SAB1 y Y2SP1, con valores promedio del indice de infeccion de 4,93; 4,88; 4,86 y 4,83, respectivamente, seguidos de los grupos de virulencia intermedia, con medias entre 4,71 y 2,38. De igual manera se pudo apreciar que solamente dos aislamientos G1SOM2 y P2TUR2 presentaron los promedios de virulencia menores, con indices de 2,14 y 2,08, respectivamente. La linea CML-254 se mostro significativamente menos afectada que L-82201-22-1-1, coincidiendo estos resultados con los del ensayo anterior (Figura 3).

[FIGURA 3 OMITIR]

Segun los resultados obtenidos en este ensayo, aislamientos pertenecientes a los estados Batinas, Portuguesa y Yaracuy, cuyas siglas comienzan por la respectiva inicial, presentaron un alto nivel de virulencia, lo que sugiere que R. solani AG1-IA posee habilidad para adaptarse a diferentes condiciones agroecologicas. En Portuguesa, uno de los principales productores de maiz, posiblemente el patogeno se ve obligado a cambiar frecuentemente su composicion genetica a causa de la presion de seleccion generada por siembras consecutivas y cambios en los cultivares comerciales utilizados, convirtiendolo en un enemigo potencialmente peligroso, capaz de distribuirse en parcelas comerciales de manera rapida y facil y manifestandose en intensidades considerables.

R. solani es una especie heterogenea Conformada por numerosas cepas que difieren en las caracteristicas de crecimiento in vitro y en patogenicidad (Ogoshi, 1987). Se ha determinado que la capacidad parasitica y saprofitica es diferente para cada aislamiento de R. solani (Papavizas, 1970). En relacion con la expresion dei sintoma de la enfermedad, se ha determinado que el hongo posee una toxina especifica, un carbohidrato que contiene glUcosa, manosa y N-acetylgalactosamina, la cual es producida en mayor cantidad por aislamientos altamente virulentos (Vidhasekaran et al., 1997).

Evaluaciones de cultivares comerciales en Venezuela indican que todos los materiales evaluados fueron susceptibles a R. solani (Cabrera y Garcia, 2000; Bastidas, 2003). Adicionalmente, debido a las caracteristicas de este patogeno de ser polifago y con un amplio rango de hospedantes, se hace dificil encontrar genotipos con caracteristicas de resistencia a la enfermedad (Zambrano et al., 2002). El hongo posee gran capacidad de sobrevivencia y adaptacion a diferentes ambientes agroecologicos, lo que implica serias dificultades en el establecimiento de estrategias para su combate, particularmente mediante variedades resistentes (Nass y Rodriguez, 1994).

Entre los factores involucrados en la respuesta de resistencia y/o susceptibilidad a R. solani se encuentra el potencial de inoculo y los factores edaficos. Cabe destacar que en la busqueda de materiales de maiz que presenten algun grado de resistencia a R. solani es necesario disponer de aislamientos que presenten un grado de virulencia media-alta, con el objeto de determinar el comportamiento de estos materiales ante el patogeno. En tal sentido se recomienda utilizar primero, en los programas de mejoramiento, las pruebas de cinetina con aislamientos de grado 2 a 2,5 que representan entre un 11,4 hasta 23,6% de dano. Aquellos que resultasen promisorios en estas evaluaciones pasarian a ser evaluados en invernadero, utilizando aislamientos que tengan grado 4 de avance de la enfermedad, entre 36 y 60% de avance. Utilizar aislamientos mas virulentos cuando se inicia la busqueda de materiales promisorios puede enmascarar posibles candidatos fuentes de resistencia por la utilizacion de una alta presion de seleccion. Se podria utilizar grandes cantidades de materiales a evaluar utilizando la prueba de cinetina para luego proceder a evaluar en invernadero. Los seleccionados con estas pruebas pasarian a ser evaluados en campo. Esto permite avanzar mas eficazmente, al ahorrar recursos y evaluar mayor cantidad de materiales en la busqueda de la fuente de resistencia.

Identificacion del grupo de anastomosis de aislamientos

La amplificacion efectuada origino un producto de 700pb. La digestion conjunta de las enzimas de restriccion AluI y HaeIII dio como resultado un patron de bandas que fueron visualizadas en PAGE (Figura 4). La comparacion del patron de bandas de la cepa AG1-IA utilizada como probador, con el mostrado por los diferentes aislados ademas de las pruebas de anastomosis, permitio la identificacion de estos. Los 10 aislamientos provenientes de la colecta 2003 mostraron similitud de bandas entre ellos y con el probador del grupo AGI-IA. Igual comportamiento fue descrito por Hernandez et al. (2003b) al realizar el mismo analisis en 15 de los aislamientos utilizados en este estudio, provenientes de zonas productoras de maiz en la colecta 2002 y utilizando diferentes probadores, como testigos, de 9 grupos de anastomosis. El analisis en conjunto de las dos colectas realizadas confirma que el grupo de anastomosis que esta afectando la produccion de maiz en Venezuela, es del grupo intraespecifico AG1-IA.

[FIGURA 4 OMITIR]

Conclusiones

Las caracteristicas descritas para cada uno de los aislamientos evaluados se corresponden con las de la especie Rhizoctonia solani, encontrandose rangos variables entre los diferentes aislamientos.

El metodo de amplificacion especifica del espaciador interno ribosomal (rADN-ITS), permitio verificar que los aislamientos de R. solani evaluados pertenecen al grupo de anastomosis AG1-IA

En la prueba de virulencia en cinetina, los niveles de virulencia de los aislamientos fueron variables, encontrandose dentro del grupo de mayor virulencia las cepas G1SOM1, P2TUR3, Y2SP1, P2TUR2 y P2TUR5.

La evaluacion de virulencia en condiciones de invernadero mostro que los niveles de virulencia de los aislamientos fueron variables, encontrandose dentro del grupo de mayor virulencia las cepas B1TOR1, P2TUR6, B2SAB1 y Y2SP1.

El comportamiento diferencial existente entre los aislamientos de R. solani y las dos lineas de maiz, indica que cada aislamiento tiene un comportamiento particular de virulencia, el cual se corresponde con la variabilidad mostrada en las caracteristicas estudiadas en cada uno de los 25 aislamientos.

Recibido: 03/10/2005. Modificado: 13/12/2006. Aceptado: 14/12/2006.

REFERENCIAS

Ahuja S, Payak M (1978) A field inoculation technique for evaluating maize germplasm to banded leaf and sheath blight. Indian Phytopathol. 31: 517-520

Ahuja S, Payak M (1981) A laboratory method for evaluating maize germplasm to banded leaf and sheath blight, Indian Phytopathol. 34: 34-37.

Armentrout V, Downer A, Grasmick D, Weinhold A (1987) Factors affecting infection cushion development by Rhizoctonia solani on cotton. Phytopathology 77: 623-630.

Bastidas RO (2003) Comportamiento de cincuenta lineas de maiz (Zea mays L.) ante la incidencia de Rhizoctonia solani Kuhn, en las condiciones de Agua Blanca, estado Portuguesa. Tesis. Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado. Venezuela.

Cabrera S (2002) Practicas de manejo para el control de la mancha bandeada de la hoja (Rhizoctonia solani). Determinacion de los niveles de incidencia, severidad y efecto sobre el peso de la mazorca en siembras comerciales de maiz. INIA-CIAE. Portuguesa, Venezuela. 315 pp.

Cabrera S, Garcia P (2000) Incidencia, severidad y efecto sobre el peso de la mazorca de maiz (Zea mays L.) de la mancha bandeada Rhizoctonia solani, en siembras comerciales en el estado Portuguesa. V Jornadas Cientificas Nacional del Maiz. Guanare, Venezuela. p. 101.

Cardona R, Rodriguez H, Nass H (1999) Manchas bandeadas en maiz causadas por Rhizoctonia solani en Portuguesa, Venezuela. Fitopatol. Venez. 12: 32-33.

Carling D, Summer D (1992) Rhizoctonia. En Singleton LL, Mihail JD, Rush CM (Eds.) Methods for research on soilborne phytopathogenic fungi. The American Phythopathological Society. St. Paul, MN, EEUU. pp. 155-165.

Cedeno L, Nass H, Carrero CH, Cardona R, Rodriguez H, Aleman L (1996) Rhizoctonia solani AG1-1A, causa principal del anublo de la vaina del arroz en Venezuela. Fitopatol. Venez. 9: 6-9.

Da Silveira SF, Alfenas AC, Ferreira FA, Sutton JC (2000) Characterization of Rhizoctonia species associates with foliar necrosis and leaf scorch of clonally-propagated eucalyptus in Brazil. Eur. J. Plant Pathol. 106: 27-36

De Leon C (1995) Banded leaf and sheath blight of maize. The situation in Asia. FLCGNET Newsletter 33: 5-6.

Dodman R, Barker K, Walker J (1968a) Modes of penetration by differents isolates of Rhizoctonia solani. Phytopathology 58: 31-33.

Dodman R, Barker K, Walker J (1968b) A detailed study of the different modes of penetration by Rhizoctonia solani. Phytopathology 58: 1271-1276.

Fontana H, Gonzalez C (2000) El cultivo de maiz en Venezuela. la ed. Fundacion Polar. Caracas, Venezuela. 530 pp.

Hernandez A, Galindo I, Sanchez B, Pineda J, Barrientos V, Gonzalez A, Gil E (2003a) Amplificacion de rADN y posterior analisis del producto de digestion como un metodo de identificacion de grupos de anastomosis de Rhizoctonia solani. I Cong. Venez. Mejoramiento y Biotecnologia Agricola. Maracay, Venezuela.

Hernandez A, Galindo I, Sanchez B, Pineda J, Gonzalez A, Gil E (2003b) Identificacion de grupos de anastomosis de Rhizoctonia solani mediante rDNA, ITS en diferentes aislados provenientes de las zonas productoras de maiz en Venezuela. Fitopatol. Venez. 16: 57.

Johansen D (1940) Plant Microtechnique. McGraw-Hill. Londres, RU. 523 pp.

Marchall D, Rush M (1980) Infection cushion formation on rice sheaths by Rhizoctonia solani. Phytopathology 70: 947-950.

Nass H, Rodriguez H (1994) Efecto de la 1amina de agua y la densidad de siembra sobre el desarrollo de Rhizoctonia solani en arroz. Bioagro 6: 31-34.

Ogoshi A (1987) Ecology and pathogenicity of anastomosis intraespecific groups of Rhizoctonia solani Kuhn. Annu. Rev. Phytopathol. 25: 125-143.

Papavizas G (1970) Colonization and growth of Rhizoctonia solani in soil. En Parmeter J Jr (Ed.) Rhizoctonia solani Biology and Pathology. University of California Press. Berkeley, CA, EEUU. pp. 108-121.

Parmeter J, Whitney H (1970) Taxonomy and nomenclature of the perfect stage. En Parmeter J Jr (Ed.) Rhizoctonia solani Biology and Pathology. University of California Press. Berkeley, CA, EEUU. pp. 7-19.

Vidhasekaran P, Ponmalar R, Samiyappan T, Velazhahan R, Vimala R, Ramanathan V, Muthukrishnan S (1997) Host-specific toxin production by Rhizoctonia solani, the rice sheath blight pathogen. Phytopathology 87: 1258-1263.

Zambrano C, Molina N, Cabrera S (2002) Manejo integrado de la mancha bandeada (Rhizoctonia solani Kuhn) de la hoja del maiz. INIACIAE Portuguesa, Venezuela.

Rosaura D. Perdomo R. Ingeniero Agronomo, Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA), Venezuela. Asistente de Investigacion, Fundacion Agricola Danac (DANAC), Venezuela.

Alexander J. Hernandez J. Ingeniero Agronomo, Universidad de Oriente (UDO), Venezuela. M.Sc. en Mejoramiento Genetico de Plantas, Universidad Central de Venezuela (UCV). Profesor, UCLA, Venezuela, e Investigador, DANAC, Venezuela. Direccion: Post-grado de Fitopatologia. Decanato de Agronomia, UCLA. Cabuda re, Lara, Venezuela. e-mail: alexander.hernandez @ danac. org.ve

Juan Bautista Pineda P. Ingeniero Agronomo y M.Sc. en Fitopatologia, UCLA, Venezuela. Profesor, UCLA, Venezuela.

Alex D. Gonzalez V. M.Sc. en Agronomia y Estudiante de Doctorado, UCV, Venezuela. Investigador, DANAC, Venezuela.

Jesus M. Alezones G. Ingeniero Agronomo y Estudiante de MaestrIa, UCV, Venezuela. Investigador, DANAC, Venezuela.
TABLA I
PROCEDENCIA Y CODIGO DE AISLAMIENTOS DE R. solani COLECTADOS
EN ZONAS MAICERAS DE VENEZUELA

No         Aislamiento                  Localidad             Codigo

1    INIA Barinas              Sector Torunos, Barinas        B1TOR1
2    Sabaneta--Barinas         Sabaneta, Barinas              B2SAB1
3    D-2002 (Guacamaya)        El Sombrero, Guarico           G1SOM1
4    QPM-1 Las Guacamayas      El Sombrero, Guarico           G1SOM2
5    C- 580 Las Guacamayas     El Sombrero, Guarico           G1SOM3
6    QPM-1 Las Guacamayas      El Sombrero, Guarico           G1SOM4
7    Sefloarca (Santa Lucia)   San Jose de Tiznado, Guarico   G2TIZ2
8    Pioner 30R92              San Jose de Tiznado, Guarico   G2TIZ1
9    Sefloarca 108             San Jose de Tiznado, Guarico   G2TIZ3
10   D-QPM-1 (Aguilar)         Via el Playon Portuguesa       P1VP1
11   D-QPM-1 (Aguilar)         Via el Playon Portuguesa       P1VP2
12   DK- 491(Aguilar)          Via el Playon Portuguesa       P1VP3
13   Chicho Landini            El Playon, Portuguesa          P1VP4
14   Chicho Landini            El Playon, Portuguesa          P1VP5
15   INIA Agua Blanca 1        Agua Blanca, Portuguesa        P2AB1
16   INIA Agua Blanca 2        Agua Blanca, Portuguesa        P2AB2
17   Colonia--El Playon        Colonia Agricola Turen,        P2TUR1
                                 Portuguesa
18   Parcela 197 UEN-P         Colonia Agricola Turdn,        P2TUR2
                                 Portuguesa
19   Parcela 197 UEN-P         Colonia Agricola Turen,        P2TUR3
                                 Portuguesa
20   INIA                      Colonia Agricola Turen,        P2TUR4

                                 Portuguesa
21   Parcela 197 UEN-P         Colonia Agricola Turen,        P2TUR5
                                 Portuguesa
22   Parcela 197 UEN-P         Colonia Agricola Turen,        P2TUR6
                                 Portuguesa
23   INIA- Turen               Colonia Agricola Turen,        P2TUR7
                                 Portuguesa
24   DANAC San Javier          San Javier, Yaracuy            Y1SJ1
25   Pulido                    Sabana de Parra, Yaracuy       Y2SP1

TABLA II
VALORES MEDIOS PARA LA CARACTERISTICA
GROSOR DE HIFAS ([my]m) DE LOS 25 AISLAMIENTOS
DE R, solani

Aislamientos   Media   Desviacion   Maximo   Minimo

P2TUR4          8,0       3,3        12,5      2,5
P2TUR7          8,5       1,3        10,0      7,5
Y1SJ1           8,9       1,9        12,5      6,3
B2SAB1          8,9       1,9        12,5      6,3
P2AB2           9,0       1,7        12,5      7,5
P1VP2           9,0       1,3        10,0      7,5
G1SOM4          9,0       1,7        12,5      7,5
Y2SP1           9,0       1,3        10,0      7,5
P1VP4           9,0       1,7        12,5      7,5
G2TIZ3          9,3       1,7        12,5      7,5
P2TUR1          9,3       1,7        12,5      7,5
P1VP5           9,5       1,6        12,5      7,5
G2TIZ2          9,8       1,8        12,5      7,5
G1SOM2          9,8       1,8        12,5      7,5
P2TUR2          9,8       1,4        12,5      7,5
P2TUR6          9,8       1,8        12,5      7,5
B1TOR1          9,8       2,2        12,5      7,5
P2AB1          10,0       1,7        12,5      7,5
G2TIZ1         10,0       2,0        12,5      7,5
P2TUR5         10,0       1,2        12,5      7,5
G1SOM3         10,3       0,8        12,5     10,0
P1VP3          10,5       1,6        12,5      7,5
P2TUR3         10,5       1,1        12,5     10,0
G1SOM1         10,8       2,1        12,5      7,5
P1VP1          12,5       1,7        15,0     10,0

TABLA III
PRUEBA DE COMPARACION DE MEDIAS (TUKEY HSD)
PARA DIFERENTES CARACTERISTICAS DE
ESCLEROCIOS EN LOS 25 AISLAMIENTOS DE R. solani

Aislamientos   Grosor (mm)   Formacion (Dias)   Maduracion (Dias)

G1SOM1           4,68 a          3,67 g              9,33 d
B1TOR1           4,50 a          6,00 g              7,67 d
Y2SP1            3,81 b          6,00 g              9,33 d
P1VP4            3,31 b          5,33 g              7,67 d
P2TUR7           3,28 b         13,33 a             13,33 d
P2TUR6           3,22 b          9,00 f             10,00 d
P1VP2            3,01 b          4,00 g              8,33 d
GlSOM2           2,82 c          4,00 g             10,00 d
P1VP1            2,71 c          3,67 g              8,33 d
P2TUR2           2,62 c         12,00 b             14,00 c
P2TUR3           2,60 c          9,33 f             12,33 d
P2TUR4           2,50 c         11,33 c             13,67 d
P1VP5            2,43 c          4,00 g              9,33 d
P2AB2            2,38 c         14,00 a             18,33 a
G2TIZ3           2,37 c          4,67 g             10,00 d
B2SAB1           2,33 c         10,00 e             14,33 c
Y1SJ1            2,29 c          6,33 g             11,67 d
G2T1Z2           2,19 c          4,67 g              8,67 d
G1SOM4           2,18 c         11,00 d             14,00 c
G1SOM3           2,18 c          9,33 f             15,00 b
G2T1Z1           1,92 c          3,33 g              6,67 e
P1VP3            1,82 c          4,00 g              8,67 d
P2AB1            1,81 c          5,00 g              9,33 d
P2TUR1           0,00 d          0,00 g              0,00 e
P2TUR5           0,00 d          0,00 g              0,00 e

* Promedios con las mismas letras son estadisticamente iguales al
5% de probabilidad

TABLA IV
PRUEBA DE
COMPARACION DE
MEDIAS (TUKEY-KRAMER)
PARA EL DESARROLLO
MICELIAL ([cm.sup.2]) DE 25
AISLADOS DE R. solani

Aislamientos     Crecimiento
               ([cm.sup.2]/48h)

P2TUR4            63,62 a
P1VP1             63,62 a
P1VP2             61,05 a
P2TUR2            60,61 a
P1VP3             59,73 ab
G2TIZ3            55,24 ab
P2AB2             45,57 b
G2TIZ2            39,99 c
P2AB1             39,41 c
G1SOM4            34,07 cd
P2TUR6            21,12 de
G2TIZ1            19,70 def
P2TUR7            19,65 def
G1SOM1            16,17 efg
B1TOR1            14,19 efgh
P1PV5             13,90 efgh
P2TUR1            12,51 efgh
G1SOM2            11,23 efgh
P2TUR3             9,95 efgh
B2SAB1             8,25 efgh
Y1SJ1              7,79 efgh
P2TUR5             7,02 efgh
G1SOM3             5,40 fgh
Y2SP1              2,37 gh
P1VP4              1,07 h

* Promedios con las mismas letras
son estadisticamente iguales al 5%
de probabilidad.

TABLA V
ANALISIS DE LA VARIANZA DE LA SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD
EN INVERNADERO (a) Y MEDIANTE EL USO DE CINETINA (b)

a Fuente      GL      SC        F

  Modelo       49    358,2     58,1 **
  Error       299     37,6
  Total       348    395,8                [R.sup.2] = 0,9

  CEPA         24    332,7    110,2 **
  LINEA         1      9,2     72,7 **
  CxL          24     15,5      5,2 **    CV(%) 3,5

b Fuente      GL      SC        F

  Modelo      149   1002,7     28,7**
  Error       300     70,1
  Total       449   1072,8                [R.sup.2] = 0,9

  HORA          2    891,3   1905,4 **
  CEPA         24     47,6      8,4 **
  LINEA         1      1,9      8,3 **
  H x C        48     18,8      1,7 *
  H x L         2      1,2      2,7ns
  C x L        24     29,8      5,3 **
  H x C x L    48     11,8      1,0ns     CV(%) 11,0

TABLA VI
COMPARACION DE MEDIAS DE SEVERIDAD DE LA
ENFERMEDAD (TUKEY HSD) PARA EL FACTOR CEPA
DE LA PRUEBA EN INVERNADERO Y EN CINETINA
INDEPENDIENTE DE LA LINEA EVALUADA

Aislamientos             indice de infeccion (1)

               Solucion de cinetina *   Invernadero **

B1TOR1             2,25 defg              4,93 a
P2TUR6             2,03 fghij             4,88 a
B2SAB1             1,94 ghijk             4,86 a
Y2SP1              2,58 abc               4,83 a
G2TIZ3             1,78 ijk               4,71 ab
P2AB2              1,86 ijk               4,68 abc
G1SOM3             2,39 bcde              4,48 abc
Y1SJ1              2,19 defgh             4,44 abc
P1VP4              1,81 ijk               4,26 be
P1VP1              2,28 cdef              4,19 cd
P2AB1              2,19 defgh             3,72 d
G2TIZ2             1,69 k                 3,14 e
G2TIZ1             1,78 ijk               3,13 ef
P1VP2              1,64 k                 3,10 ef
P1VP3              1,92 hijk              3,05 ef
P2TUR5             2,47 abcd              2,99 ef
G1SOM1             2,78 a                 2,97 ef
G1SOM4             2,22 defgh             2,77 efg
P1VP5              2,39 bcde              2,71 efg
P2TUR3             2,69 ab                2,64 fg
P2TUR7             1,69 k                 2,45 gh
P2TUR1             2,08 efghi             2,41 gh
P2TUR4             2,08 efghi             2,38 gh
G1SOM2             1,75 jk                2,14 h
P2TUR2             2,47 abcd              2,08 h

(1.) Promedios con las mismas letras son estadisticamente iguales al
5% de probabilidad.

* Indice de infeccion (Ahuja y Payak, 1981) evaluado en escala que se
indica en la descripcion del ensayo de virulencia en solucion de
cinetina.

** Indice de infeccion evaluado en escala que se indica en la
descripcion del ensayo de virulencia en invernadero.
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Title Annotation:REPORTS/COMUNICACIONES/COMUNICACOES
Author:Perdomo, Rosaura; Hernandez, Alexander; Gonzalez, Alex; Pineda, Juan; Alezones, Jesus
Publication:Interciencia
Date:Jan 1, 2007
Words:6573
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