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Caracterizacion molecular y resistencia antimicrobiana de aislamientos de Clostridium perfringens de diferentes origenes en Costa Rica.

Molecular characterization and antimicrobial resistance of Clostridium perfringens isolates of different origins from Costa Rica.

Clostridium perfringens es un bacilo Gram positivo, esporulado, anaerobio, que con frecuencia se encuentra en suelos y aguas negras y en tracto gastrointestinal de animales y humanos como miembro de su microbiota intestinal (Petit et al.1999). Es responsable de una variedad de enfermedades en seres humanos y animales (Labbe 2001). Su patogenicidad se asocia con la produccion de muchas toxinas, de las cuales las principales son la alfa ([alfa]), beta ([beta]), epsilon ([epsilon]) e iota ([iota]). C. perfringens se clasifica en cinco toxinotipos (A-E) de acuerdo con los tipos de toxina que produzca; el tipo A produce solo toxina a, el B produce [alfa], [beta] y [epsilon], el C produce [alfa] y [beta], el D produce [alfa] y [epsilon], el tipo E produce [alfa] y [iota] (Petit et al. 1999). Cada toxinotipo se asocia con una enfermedad en particular, por lo que su determinacion es importante para el diagnostico y el estudio epidemiologico de los cuadros clinicos (Petit et al. 1999).

Ademas de estas toxinas, algunas cepas de C. perfringens, que generalmente pertenecen al tipo A, producen una enterotoxina (CPE) que causa diarrea en seres humanos y en algunos animales y que es codificada por el gen cpe (Baums et al. 2004). Tradicionalmente la clasificacion de las cepas de C. perfringens se ha realizado por seroneutralizacion utilizando ratones o cobayos (Heinkinheimo & Korkeala 2005). Sin embargo, estos metodos son costosos, toman tiempo y son cuestionados eticamente por utilizar animales, por lo que en los ultimos anos han sido reemplazados por metodos moleculares (Baums et al. 2004), a pesar de que la demostracion de los genes que codifican por las diferentes toxinas no implica necesariamente, que la proteina codificada este siendo producida (Van Asten et al. 2009).

La produccion de la CPE por parte de C. perfringens solo ocurre durante la esporulacion y debido a que esta bacteria esporula mal en los medios de cultivo, su deteccion se dificulta (Petit et al. 1999). El uso de tecnicas moleculares ha permitido, por lo tanto, solventar estos inconvenientes y poder determinar cuales cepas son las que tienen el gen (Baums et al. 2004).

Por otra parte, el conocimiento del perfil de sensibilidad a los antibioticos de C. perfringens de diferentes origenes, incluyendo suelos, alimentos, animales y seres humanos, puede contribuir a una utilizacion mas racional de los antibioticos tanto para tratamiento clinico, como para usos agropecuarios, y la deteccion de cepas con resistencia antimicrobiana podria alertar sobre una posible transferencia de genes entre bacterias de diferentes origenes.

En Costa Rica, C. perfringens ha sido aislado de numerosos ambientes: del 88% de suelos aledanos a plantas procesadoras de carne, del 93% de contenidos intestinales de ganado, del 55% de la carne en canal, del 75% de carnes molidas, del 36% de carnes en trozos para la venta al detalle y de 3% de carnes cocidas mantenidas en banos termo-regulables (Rodriguez et al. 2002). Sin embargo, en ausencia de conocimientos mas especificos, este estudio aborda una caracterizacion fenotipica y genotipica de cepas costarricenses de diferentes origenes, con el fin de contribuir al conocimiento de su distribucion epidemiologica.

MATERIALES Y METODOS

Cepas de C. perfringens: De la coleccion de bacterias anaerobias del Laboratorio de Investigacion en Bacteriologia Anaerobia (LIBA), Universidad de Costa Rica se analizaron 81 cepas de C. perfringens: 20 de suelos, 20 de origen animal, 20 de origen humano y 21 de alimentos cocidos no relacionados con brotes alimentarios. Todas habian sido aisladas previamente siguiendo las metodologias estandar y se habian conservado a -80[grados]C (Rodriguez et al. 2002). Cada una de las cepas se recupero en medio carne picada PRAS (Holdeman et al. 1977), el cual se incubo a 35[grados]C por 24-48hr y posteriormente se inoculo en agar sangre para verificar su pureza.

Aislamiento del ADN total: El ADN se purifico segun la metodologia de Murray & Thompson (1980). Brevemente, cada cepa se crecio en medio carne picada PRAS a 35[grados]C por 24hr. Las bacterias por se concentraron centrifugacion a 6 000g por 10min, se resuspendieron en 567[micron]L de buffer TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) y se incubaron a 37[grados]C por 1hr despues de anadir 30[micron]L de duodecil sulfato de sodio al 10% y 3[micron]L de proteinasa K (20mg/ mL en agua destilada). Luego se agrego 100[micron]L de solucion de NaCl5M y 80[micron]L de solucion CTAB-NaCl (cetiltrimetil bromuro de amonio al 10% en NaCl0.7M) y se incubo a 65[grados]C por 10min. Con solucion de fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) se hizo una extraccion de ADN y se precipitacio con etanol absoluto por incubacion a -20[grados]C toda la noche; luego se centrifugo a 12 000g por 20min, se lavo con alcohol de 70% y se resuspendio en 100[micron]L de buffer TE, despues de que fue secado a 37[grados]C. El ADN se mantuvo a -20[grados]C hasta su uso.

Caracterizacion molecular por PCR: Para detectar las toxinas alfa ([alfa]), beta ([beta]) y epsilon ([epsilon]) se empleo un PCR multiple y los primers disenados por Yoo et al. (1997). La mezcla contenia 12.5[micron]L de Master Mix (Fermentas[R]), 7.5[micron]L de agua para PCR, 1.0[micron]L de cada uno de los 5 primers (10[micron]M) y 1.0[micron]L de ADN. El Master Mix (2X) contenia Taq polimerasa (0.05U/[micron]L), Mg[Cl.sub.2] (4mM) y una mezcla de dNTPs (0.4mM de cada uno). Para la amplificacion del ADN se incubo 5min a 94[grados]C, seguido de 30 ciclos de 1min a 55[grados]C, 1min a 72[grados]C y 1min a 94[grados]C, y un paso final de extension de 5min a 72[grados]C. Como controles se utilizaron las cepas C. perfringens tipo A ATCC 13124 y C. perfringens tipo B ATCC 3226. El analisis de los productos de amplificacion se hizo por electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Para detectar el gen cpe se siguio la metodologia asi como los primers P145 y P146 descritos por Fach & Popoff (1997), los cuales amplifican un fragmento de 426pb; se empleo la mezcla para PCR Master Mix (2X). El programa de amplificacion consistio de 5min a 94[grados]C, seguido de 30 ciclos de 30s a 94[grados]C, 30s a 55[grados]C y 30s a 72[grados]C y por ultimo se realizo una extension de 72[grados]C por 10min. Como controles se utilizaron las cepas C. perfringens LIBA 89 ([cpe.sup.+]) y C. perfringens ATCC 13124 ([cpe.sup.-]).

Pruebas de sensibilidad a los antibioticos: La galeria comercial ATB ANA de la casa Biomeriux[R] se utilizo siguiendo todas las recomendaciones del fabricante para su inoculacion, incubacion e interpretacion.

RESULTADOS

Las 81 cepas de C. perfringens de diferentes origenes: animales, humanos, alimentos cocidos y suelos, fueron clasificadas como C. perfringens tipo A, debido a que solo se les detecto el gen de la toxina alfa ([alfa]), mientras que el gen de la enterotoxina (cpe) se encontro solamente en dos de las 81 cepas estudiadas (2.5%), las cuales habian sido aisladas de alimentos cocidos.

El 44% de todas las cepas fue resistente a algun antibiotico; en el Cuadro 1 se muestran los resultados de resistencia a los antibioticos que presentaron las cepas de C. perfringens. Respecto a la clindamicina el 41% fue resistente: 70% de las cepas de origen humano, 40% de las de suelo, 29% de las de alimentos y 25% de las de origen animal. Ademas, el 20% de todas las cepas fue resistente al metronidazol: las del suelo presentaron el mayor porcentaje de resistencia (50%), seguidas de las cepas de origen animal y de alimentos (15% y 14%, respectivamente), mientras que ninguna de las de origen humano fue resistente. Con respecto al cloranfenicol, el 25% de todas las cepas fue resistente, y segun el origen de las cepas, la resistencia oscilo entre el 20 y el 30%. El 22% de las cepas fue resistente a penicilina, el mayor porcentaje de resistencia lo presento las cepas provenientes de suelo (40%), mientras que solo el 15% de las cepas de origen animal y el 20% de origen humano fue resistente.

En general, al comparar las cepas provenientes de diversos origenes, las de suelos presentaron los mayores porcentajes de resistencia a casi todos los antibioticos (Cuadro 1). Incluso algunos antibioticos (cefoxitina, cefotetan, piperacilina, amoxicilina, ticarcilina y ticarcilina con acido clavulanico) a los cuales no se les detecto resistencia en las cepas de animales, de humanos y de alimentos, si se les detecto en las de cepas de suelo (del 5 al 20%, Cuadro 1).

El 40% de las cepas de suelo fue multiresistente (a tres o mas grupos de antibioticos), incluso tres cepas fueron resistentes a cinco de los siete grupos de antibioticos evaluados (penicilina, cefalosporinas, clindamicina, cloranfenicol y metronidazol). Aunque la multiresistencia de las cepas de origen humano fue del 30%, solo una cepa fue resistente a cuatro de los siete grupos de antibioticos evaluados (penicilina, clindamicina, cloranfenicol y metronidazol). La multiresistencia de las cepas de alimentos y de origen animal fue mucho menor (14% y 5%, respectivamente), y solo un aislamiento de cada uno de estos origenes fue resistente a cuatro de los siete grupos de antibioticos.

DISCUSION

En el presente trabajo se demostro una distribucion ecologica de C. perfringens similar a la de otras regiones, con un predominio del toxinotipo A (Petit et al. 1999), tanto en sedimentos marinos como suelos (Fach & Popoff 1997); Li et al. (2007) informaron que el 98.8% de las cepas de suelos en Estados Unidos eran tipo A. Este toxinotipo predomina en la flora intestinal de muchos animales, incluyendo el ser humano (Heikinheimo & Korkeala 2005, Heikinheimo et al. 2006) y es responsable de muchos cuadros clinicos en humanos, tales como gangrena, diarrea asociada a antibioticos (Joshy et al. 2006), asi como cuadros gastrointestinales en otros animales (Petit et al. 1999, Baums et al. 2004). Finalmente, numerosos estudios realizados en Estados Unidos y Japon han demostrado que la mayoria de las cepas de C. perfringens provenientes de alimentos, relacionados o no con brotes alimentarios, son del tipo A (Lin & Labbe 2003, Wen & McClane 2004, Miki et al. 2008) tal como se encontro en este trabajo.

El gen de la enterotoxina (cpe) solo se encontro en dos de las cepas estudiadas (2.5%), las cuales habian sido aisladas de alimentos. La frecuencia de este gen en cepas de origen alimentario generalmente es baja, del 0 al 4% en alimentos de origen animal (Lin & Labbe 2003, Wen & McClane 2004, Miki et al. 2008, Rahmati & Labbe 2008). En contraste con estos bajos porcentajes, Miwa et al. (1998) determinaron que el 17% de las cepas aisladas de muestras de carne y pollo tenian el gen cpe. En el presente estudio el 10% de las cepas provenientes de alimentos contenian el gen de la enterotoxina, mientras que previamente en Costa Rica se encontro que el 15% de cepas de alimentos cocidos eran toxigenicas (Gutierrez et al. 1999), desconocemos si esto obedece a razones metodologicas o a cambios reales en el tiempo.

La mayoria de los estudios senalan que las cepas enterotoxigenicas son poco frecuentes en diferentes tipos de muestras; en cepas de heces de individuos asintomaticos varian desde 0 hasta 7.5% (Joshy et al. 2006), en cepas de origen animal desde 0 hasta 22% (Tschirdewahn et al. 1992, Heikinheimo & Korkeala 2005) y en cepas de suelos desde 0 hasta 7% (Kuske et al. 2006, Li et al. 2007). A pesar de que la incidencia de cepas enterotoxigenicas de C. perfringens sea baja, estas representan un riesgo porque pueden dar origen a cuadros clinicos o brotes.

Aunque era de esperar que el porcentaje de cepas toxigenicas fuera bajo, es posible que las cepas hayan correspondido, por azar, a cepas no toxigenicas, porque en una misma muestra puede coexistir un pequeno numero de celulas cpe-positivas con un gran numero de celulas cpe-negativas (Miwa et al. 1997, Heikinheimo et al. 2004, Heikinheimo et al. 2006).

En el presente estudio el porcentaje de cepas resistentes a algun antibiotico fue del 44%. Aunque existen pocos estudios sobre el perfil de susceptibilidad a los antimicrobianos de cepas de C. perfringens de diferentes origenes, en Tailandia el 62.7% de cepas de heces de humanos y de cerdos, alimentos y del ambiente fue resistente a uno o varios antibioticos (Tansuphasiri et al. 2005), lo que indica que en ambos paises la resistencia es frecuente y podria explicarse por el uso que se le da a los antibioticos.

La clindamicina es uno de los antibioticos mas utilizados para el tratamiento de infecciones por anaerobios, por lo que es preocupante que el 41% de las cepas fuera resistente, y particularmente alarmante que el 70% de las cepas de origen humano lo fuera (Cuadro 1). Tambien los otros grupos de cepas presentaron altos porcentajes de resistencia: 40% de las de suelo, 29% de las de alimentos y 25% de las de origen animal (Cuadro 1). Aunque la resistencia a clindamicina de cepas de origen clinico humano es poco frecuente en otras latitudes (Alexander et al. 1995, Citron et al. 2005), los porcentajes de resistencia obtenidos en este estudio sugieren que en Costa Rica podria ser alto, por lo que deberia corroborarse con aislamientos de cuadros clinicos.

Respecto al metronidazol, otro de los tratamientos de eleccion contra los anaerobios, el 20% de todas las cepas fue resistente, mientras que ninguna de origen humano fue resistente (Cuadro 1). La resistencia a metronidazol no es muy frecuente (Alexander et al. 1995, Citron et al. 2005), pero se ha reportado que en Tailandia y en Costa Rica un 13.5 y un 10.4%, respectivamente, de cepas de origen humano eran resistentes (Tansuphasiri et al. 2005, Camacho et al. 2008).

En un estudio previo con cepas de heces humanas en Costa Rica (Camacho et al. 2008), no se detecto resistencia al cloranfenicol, lo que contrasta con el porcentaje de cepas resistentes de origen humano que se detecto (30%) en el presente trabajo. Tampoco se detectaron cepas resistentes en alimentos en Tailandia (Tansuphasiri et al. 2005), aunque en el presente estudio el 24% de la cepas fue resistente. Estas diferencias podrian deberse a que se emplearon metodologias diferentes en ambos estudios o a que esta resistencia es de reciente aparicion en nuestro pais. La resistencia de cepas de C. perfringens si ha sido descrita en cepas aisladas de suelo en Grecia (Voidarou et al. 2006), y concuerda con la deteccion de un 25% de cepas resistentes provenientes de suelos en el presente estudio.

Tambien se detecto un alto porcentaje de resistencia a la penicilina (22%), particularmente en las cepas provenientes de suelo (40%), situacion que tambien fue descrita en un estudio en Grecia (Voidarou et al. 2006). Las diferencias en las practicas terapeuticas y veterinarias de los paises podrian explicar que en el presente estudio el 15% de las cepas de origen animal y el 20% de origen humano fueran resistentes a la penicilina, mientras que ninguna de las cepas de intestino de pollos de otro estudio (Silva et al. 2009) y solo el 10% de las cepas de heces humanas fuera resistente (Tansuphasiri et al. 2005).

En general, los mayores porcentajes de resistencia para casi todos los antibioticos se presentaron en cepas provenientes de suelos, tal como ha sido descrito en Grecia (Voidarou et al. 2006), y esto puede ser un reflejo del uso indiscriminado de antibioticos en la agricultura (Tansuphasiri et al. 2005).

En concordancia con lo anterior, el mayor porcentaje de cepas multiresistentes provenia de suelo (40%), incluso las cepas resistentes a cinco de los siete grupos de antibioticos evaluados, provenian de suelo. Esta multiresistencia es preocupante por la posibilidad de que estas cepas puedan actuar como un reservorio de genes de resistencia por el uso tan difundido de antimicrobianos como promotores de crecimiento de plantas y animales para el consumo humano.

Aunque se observo multiresistencia en cepas de origen humano y de alimentos (30 y 14%, respectivamente), esta fue menor a la observada en Tailandia, donde las cepas de flora intestinal humana y de alimentos presentaron porcentajes mas altos de multiresistencia (33.7 y 20%, respectivamente, Tansuphasiri et al. 2005); esto podria deberse a diferencias en el uso de los antibioticos en ambos paises.

La demostracion de que el 10% de las cepas de C. perfringens aisladas de alimentos poseen el gen de la enterotoxina refuerza la importancia de investigar los posibles reservorios que puedan favorecer la aparicion de brotes de cuadros clinicos causados por esta bacteria. Ademas el presente estudio ha permitido conocer por primera vez en Costa Rica, el perfil de resistencia a los antibioticos de C. perfringens, el patogeno mas distribuido en la naturaleza, lo que contribuira a mejorar el manejo de pacientes con este tipo de infecciones. Finalmente, este estudio puso de manifiesto la amplia distribucion de cepas resistentes a los antibioticos a partir de diferentes origenes, lo que probablemente refleja el uso indiscriminado de antibioticos y plantea la posibilidad de transferencia de esos genes de resistencia entre bacterias de diversos ambientes.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Pablo Vargas y Martin Quesada por su ayuda tecnica y a la Vicerrectoria de Investigacion de la Universidad de Costa Rica por el financiamiento otorgado.

Recibido 25-X-2010.

Corregido 20-II-2011.

Aceptado 23-III-2011.

REFERENCIAS

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Maria del Mar Gamboa-Coronado *, Silvia Mau-Inchaustegui, Evelyn Rodriguez-Cavallini

Laboratorio de Investigacion en Bacteriologia Anaerobia y Centro de Investigacion en Enfermedades Tropicales, Facultad de Microbiologia, Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, San Pedro de Montes de Oca 2060, San Jose, Costa Rica; maria.gamboa@ucr.ac.cr, silvyamau@gmail.com, evelyn.rodriguez@ucr.ac.cr

* Correspondencia
CUADRO 1

Porcentaje de resistencia a los antimicrobianos de cepas
costarricenses de Clostridium perfringens aisladas de
animales (n = 20), humanos (n = 20), alimentos (n = 21) y
suelos (n = 20)

TABLE 1

Antimicrobial resistance percentage of Costa Rican
Clostridium perfringens strains isolated from animals
(n = 20), humans (n = 20), food (n = 21) and soils (n = 20)

                     Cepas de    Cepas de     Cepas de     Cepas de
                    animales %   humanos %   alimentos %   suelos %

Clindamicina            25          70           29           40
Metronidazol            15           0           14           50
Cloranfenicol           20          30           24           25
Penicilina              15          20           14           40
Amoxicilina             0            0            0           10
Amoxicilina/            0            0            0           0
  ac. clavulanico
Piperacilina            0            5            0           10
Piperacilina/           0            0            0           0
  Tazobactam
Ticarcilina             0            0            0           5
Ticarcilina/            0            0            0           5
  ac. clavulanico
Cefoxitina              5            0            5           20
Cefotetan               5            0            5           20
Imipinem                0            0            0           0

                    Total
                      %

Clindamicina         41
Metronidazol         20
Cloranfenicol        25
Penicilina           22
Amoxicilina           2
Amoxicilina/          0
  ac. clavulanico
Piperacilina          4
Piperacilina/         0
  Tazobactam
Ticarcilina           1
Ticarcilina/          1
  ac. clavulanico
Cefoxitina            7
Cefotetan             7
Imipinem              0
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Author:del Mar Gamboa-Coronado, Maria; Mau-Inchaustegui, Silvia; Rodriguez-Cavallini, Evelyn
Publication:Revista de Biologia Tropical
Date:Dec 1, 2011
Words:4171
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