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Caracterizacion molecular y fitoquimica de ocho genotipos de papa (Solanum tuberosum L.) y su relacion con la infeccion por Spongospora subterranea (Wallr.) Lagerh.

Molecular and phytochemical characterization of eight potato (Solanum tuberosum L.) genotypes and its relationship with infection by Spongospora subterranea (Wallr.) Lagerh.

INTRODUCCION

Spongospora subterranea (Walls.) Lagerh. es un endoparasito obligado de la familia Plasmodiophoridae (Phylum Cercozoa) (Cavalier-Smith y Chao, 2003), el cual puede sobrevivir en el suelo por muchos anos, a traves de esporas de resistencia, e invadir las celulas de las raices y estolones de la papa, por medio de zoosporas secundarias, en los primeros estadios de desarrollo de la planta (Merz, 1997). No existe un unico metodo de control que por si solo sea eficiente (Merz, 2000a; Wale, 2002), ya que este ha resultado ser particularmente dificil, debido a la longevidad de los esporosoros (Merz, 2000b), el grado de efectividad y/o aplicabilidad de los tratamientos quimicos (Falloon, 2008) y la posibilidad del patogeno de sobrevivir en campo en ausencia de cultivo (Qu y Christ, 2006). Por consiguiente, el manejo de la enfermedad debe realizarse a traves de la integracion de diversas medidas de control, dentro de los cuales el uso de la resistencia del cultivo probablemente represente el componente principal en el manejo sostenible de la enfermedad (Falloon, 2008).

La reaccion diferencial de materiales de papa a S. subterranea ha sido reportada tanto en tuberculos como en raices (Merz et al., 2004; Baldwin et al., 2008; Falloon, 2008). Se ha propuesto que la herencia de la resistencia es del tipo cuantitativa y que existe evidencia de reaccion diferencial de un mismo cultivar a aislamientos del patogeno de diversas procedencias geograficas (Falloon et al., 2003; Merz et al., 2004), lo que ha sugerido la posibilidad de la existencia de patotipos de la especie (Falloon et al., 2003). No obstante, la similitud entre los diversos genotipos y su relacion con la enfermedad no han sido previamente estudiadas.

Tradicionalmente, la evaluacion de la resistencia a S. subterranea ha sido llevada cabo con pruebas de campo, sin embargo, estos suelen resultar costosos, laboriosos y requieren de tiempo, ademas, su exito depende de las condiciones ambientales que permitan el establecimiento de la infeccion (Merz y Falloon, 2009). Debido a ello, se han propuesto ensayos bajo condiciones controladas adecuadas para el desarrollo de la enfermedad (Baldwin et al., 2008). No obstante, el trabajo de seleccion sigue siendo un proceso arduo, por lo que Merz et al. (2004) propusieron un ensayo para la seleccion en laboratorio, basandose en la relacion proporcional de la infeccion en raices y tuberculos, en donde los cultivares con mayor resistencia mostraron un menor nivel de zoosporangios en raices.

Aunque la relacion entre infeccion de raices y tuberculos no esta muy clara (Merz et al., 2004; Falloon, 2008; van de Graaf et al., 2007), Falloon et al. (2003) demostraron que los cultivares resistentes de manera general mostraron un numero menor de zoosporangios de S. subterranea en las raices que los susceptibles, lo cual indico que la resistencia se encuentra expresada en los sitios de penetracion de las zoosporas a las celulas de la raiz y estolon.

Todos estos mecanismos de resistencia se encuentran bajo el dominio de los genes por lo que la identificacion de cualquiera de ellos puede ser de gran utilidad en los programas de mejoramiento genetico (Day, 1974; Laurentin et al., 2003). Las bases bioquimica y fisiologica de la resistencia de las plantas a los hongos, oomycetos y bacterias patogenicas han sido asociadas a compuestos antimicrobianos formados tanto anterior como posterior a la infeccion (Hammerschmidt, 1999). Tales compuestos son de bajo peso molecular y derivados del metabolismo secundario de las plantas, los cuales pueden ser clasificados como: fenoles, flavonoides, antocianinas, aminoacidos no proteicos, glucosidos cianogenicos, poliacetilenos, alcaloides y peptidos (Perez de la Vega, 1993). La relacion de algunos de estos grupos a las reacciones de resistencia/susceptibilidad de S. tuberosum a S. subterranea no ha sido previamente estudiada. El presente estudio fue llevado a cabo con el objeto de caracterizar ocho genotipos de papa (Solanum tuberosum L.) desde el punto de vista molecular y fitoquimico y relacionar estas caracteristicas con su reaccion frente a la infeccion por Spongospora subterranea.

MATERIALES Y METODOS

Infeccion de ocho genotipos de papa por Spongospora subterranea. Se utilizaron plantas de cultivo in vitro de los cultivares 'Granola', 'Esperanza', 'Kennebec', junto a los clones avanzados 393180-32, 393194-1, 393193-16, 392634-21 y 392636-3. Estos clones provienen de la Poblacion B desarrollada por el Centro Internacional de la Papa (CIP) (Landeo et al., 1995). Para el ensayo se empleo el metodo de evaluacion en invernadero, con plantas desarrolladas en bolsas e inoculadas con esporosoros de la peridermis de papa, utilizado por Baldwin et al. (2008).

El experimento fue conducido en un cobertizo, con temperaturas de 14-24[grados]C (min-max). Las vitroplantas fueron trasplantadas a bolsas de polietileno negro (15 x 15 x 15 cm) llenadas previamente con sustrato esteril compuesto por una mezcla de cascara de arroz, aserrin de coco y suelo organico en proporciones 2:1:1, respectivamente; al momento del trasplante se mezclaron 3 g de fertilizante (12-24-12) con el sustrato. Como fuente de inoculo se emplearon esporosoros obtenidos a partir de lesiones de tuberculos del cv. Andinita, en el estado Merida, Venezuela. De estos, 0,2 g de peridermis con lesiones (equivalente a 7,55 x [10.sup.5] esporosoros) fueron aplicados al fondo del hoyo de siembra previo al trasplante. Se coloco una planta por genotipo en cada bolsa. Las plantas fueron regadas por capilaridad, para lo cual, las bolsas plasticas fueron colocadas en bandejas de aluminio de 6 cm de altura y regadas diariamente hasta el nivel maximo de la bandeja (Baldwin et al., 2008).

En la octava semana luego de la siembra se llevo a cabo un muestreo para la cuantificacion de zoosporangios en las raices y la caracterizacion fitoquimica de la planta.

Caracterizacion molecular de los genotipos de papa. Se realizo la caracterizacion molecular, mediante el uso de secuencias sencillas repetidas (SSR) (Milbourne et al., 1998; Mathias et al., 2007). Se utilizaron plantas in vitro de 6 semanas de edad. El ADN se purifico mediante el metodo descrito por Doyle y Doyle (1990).

Se emplearon los siguientes 20 pares de iniciadores, amplificados por PCR: STM1049, STM2022, STM3023, STM1031, STPoA58, STM0031, STM1052, STM2013, STM1104, STM1016, STGBSS, STWAX-2, STM3012, STM1106, STM0037, STM0030, STM2030, STM1064, STM1058 y STM1017 (Milbourne et al, 1998). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 15 [micron]L que contenian 50 ng de ADN total, 1X de buffer de reaccion, 2,5 mM de Mg[Cl.sub.2], 150 [micron]M de cada dNTP, 0,25 [micron]M de cada iniciador y 1 U de Tag polimerasa. La amplificacion fue realizada con una desnaturalizacion inicial a 95[grados]C por 3 min, seguido de 35 ciclos de separacion (95[grados]C por 30 s), alineamiento (temperatura segun iniciador, por 25 s) y extension (72[grados]C por 30 s) con un ciclo final de 72[grados]C por 5 min. Los productos obtenidos fueron separados en geles de poliacrilamida al 10 % en buffer TBE y tenidos con nitrato de plata.

La medida de similitud utilizada vino dada por el coeficiente general de Gower (1971). Por ultimo, se realizo el analisis de los individuos a traves del metodo de agrupamiento de pares no ponderados, usando la media aritmetica (UPGMA). Los datos fueron analizados con el programa PATN version 3.11 (Griffith University, Australia).

Caracterizacion fitoquimica de los genotipos de papa

A. Analisis cualitativo de metabolitos secundarios: Todas las plantas de un mismo genotipo fueron procesadas como una sola muestra y la determinacion de los metabolitos secundarios (MS) fue realizada en tuberculos/estolones, raices y parte aerea de la planta (hojas y tallos). La metodologia de obtencion de los extractos etanolicos y la determinacion de los grupos de MS fue realizada siguiendo la propuesta de Marcano y Hasegawa (2002) y Sanabria et al. (1998). El extracto crudo se obtuvo por maceracion con etanol (96 %) y posterior separacion de este por medio de un rotavapor Buchi. En el analisis, se determino la presencia o ausencia de los siguientes compuestos: 1) Alcaloides: Al extracto etanolico crudo se le anadio acido clorhidrico 10 % y la mezcla se coloco en un embudo de separacion. La primera fase se logro con cloroformo y la segunda, acuosa que permanecio en el embudo, se alcalinizo con hidroxido de amonio y posteriormente se lavo con cloroformo para obtener una segunda fase, lo cual permitio la determinacion de alcaloides debilmente basicos, basicos y sales cuaternarias de amonio. Con la ayuda de un tubo capilar se coloco una gota de cada fase, por separado, en una placa de silica-gel y se rocio con reactivo de Dragendorff. En aquellos casos en los que la fase resultara positiva para la presencia de alcaloides (por la formacion de una mancha oscura), se trataron con el reactivo de Meyer, lo que provoca la formacion de un precipitado blanco en una pequena cantidad del extracto crudo. 2) Antraquinonas: El extracto etanolico, disuelto y filtrado con hidroxido de potasio 0,5 N, fue acidificado con acido acetico y agitado con benceno. Al alcalinizar con hidroxido de amonio, la manifestacion de una coloracion rojiza indico la presencia de antraquinonas. 3) Flavonoides: Al extracto etanolico se le agrego acido clorhidrico concentrado y virutas de magnesio. En aquellos casos positivos, la mezcla tomo una coloracion roja a rojiza. A fin de corroborar los resultados, se colocaron gotas del extracto en papel de filtro y se rociaron con una solucion de cloruro de aluminio; la presencia de flavonoides quedo demostrada por la aparicion de una mancha amarilla fluorescente al observar bajo luz ultravioleta. 4) Polifenoles y taninos: Al extracto etanolico se le anadieron unas gotas de cloruro ferrico 1 %, y luego gelatina 1 % en cloruro de sodio de igual concentracion. La formacion de un precipitado demostro la presencia de polifenoles y taninos. 5) Saponinas: Una pequena porcion del extracto se agito fuertemente en agua; la aparicion de una espuma consistente de unos veinte minutos de duracion despues de dejar reposar la mezcla, demostro la presencia de saponinas. 6) Aceites esenciales: Detectados mediante la presencia del olor caracteristico que le confieren al material vegetal.

B. Analisis cuantitativo de metabolitos secundarios: Luego de realizar el analisis cualitativo, se procedio a cuantificar aquellos MS cuya presencia resulto positiva, mediante el uso de cromatografia en papel de filtro (Filtrak, d = 125 mm; 80 g x [m.sup.-2]). Se registraron los valores de peso fresco de las raices, tuberculos/estolones y parte aerea, asi como los volumenes de etanol empleados. Una gota de 10 [micron]L de extracto crudo fue corrida junto al solvente especifico segun el grupo de estudio (Cuadro 1). Posteriormente, los metabolitos fueron cuantificados empleando la metodologia reportada por Vasquez et al. (2008) y expresados en miligramos de metabolito por mililitro del material vegetal.

C. Analisis e interpretacion de los datos: Para el analisis de los datos se construyo una matriz conjunta con los valores cuantitativos y cualitativos obtenidos de cada MS para cada genotipo y organo de la planta evaluado. El hecho de reportar conjuntamente los resultados correspondientes a los analisis cualitativo y cuantitativo permitio ampliar el numero de variables para la matriz y enriquecer asi la informacion obtenida Para el analisis cualitativo, se utilizo el reporte de presencia/ausencia de alcaloides debilmente basicos, basicos y sales cuaternarias de amonio, antraquinonas, flavonoides, polifenoles y taninos, saponinas y aceites esenciales. Para los datos cuantitativos se emplearon los valores de alcaloides totales, antraquinonas, flavonoides, polifenoles y taninos. Seguidamente, los datos obtenidos fueron transformados utilizando el procedimiento de estandarizacion por rangos con el objeto de dar el mismo peso y tamano a todas las variables MS estudiadas, permitiendo una contribucion homogenea de los caracteres en los analisis posteriores (Sokal y Sneath, 1963).

A continuacion, se realizo el calculo de las relaciones entre los genotipos, a traves de la elaboracion de una matriz de disimilitud empleando para ello el indice o coeficiente general de Gower (1971). El analisis de clasificacion de los individuos se llevo a cabo a traves del metodo de agrupamiento de pares no ponderados usando la media aritmetica (UPGMA), a fin de dar a todos los caracteres incluidos el mismo peso, para de esta forma reflejar las distancias verdaderas entre los individuos (Sokal y Sneath, 1963; Quinn y Keough, 2002). Dicho analisis fue realizado empleando en conjunto y por separado los valores obtenidos en todos los organos analizados.

Por otra parte, con la finalidad de establecer cual de los metabolitos estudiados fue mas discriminatorio en la clasificacion de los genotipos evaluados y determinar la existencia de relaciones entre los metabolitos y la infeccion por S. subterranea, se realizo un analisis de ordenacion de los caracteres mediante la tecnica de escalamiento multidimensional (MDS) y el analisis de correlacion de componentes principales (PCC). Los analisis se llevaron a cabo tomando en cuenta los metabolitos presentes en las raices y tuberculos debido a que estos representan los sitios de infeccion del patogeno; de esta manera, los valores de los metabolitos en dichos organos fueron analizados segun fue descrito previamente. Todos los procedimientos empleados fueron realizados con el programa PATN version 3.11 (Griffith University, Australia)

RESULTADOS Y DISCUSION

Infeccion de los ocho genotipos de papa por S. subterranea

Los sintomas de infeccion se observaron solo en raices a las 8 semanas de iniciado el ensayo. Se encontraron diferencias significativas (P [menor que o igual a] 0,05) entre los genotipos de papa, en cuanto a la cantidad de zoosporangios por milimetro cuadrado de raiz. Los clones 392634-21 y 393194-1 presentaron los mayores contenidos de estos y fueron estadisticamente iguales a 'Kennebec' y al clon 393180-32 (Figura 1); mientras que los clones 392636-31 y 393193-16 mostraron los menores valores y fueron estadisticamente similares a los cultivares Esperanza y Granola.

[FIGURA 1 OMITIR]

Caracterizacion molecular de los genotipos de papa y su relacion a la infeccion por S. subterranea

El analisis de los productos de amplificacion mostro diferencias entre los ocho genotipos estudiados. Los valores del coeficiente de disimilitud de Gower detecto una amplia variabilidad entre los individuos evaluados, con rangos entre 0,1503 y 0,5233 (Cuadro 2). En el dendrograma mostrado en la Figura 2 se observa que se generaron dos grupos principales compuestos por el genotipo 393193-16 (B) y el resto de los individuos (A), lo que indica que el genotipo 393193-16 presenta la menor similitud con el resto de los materiales. Para el grupo compuesto por los siete genotipos restantes es posible evidenciar la formacion de dos subgrupos, uno conformado por los cvs. Esperanza, Granola y Kennebec y otro por los clones avanzados 393194-1, 393180-32, 392636-31 y 392634-21. A su vez, los genotipos Kennebec y 392634-21 representaron los materiales con menor similitud en sus subgrupos respectivos. Con la excepcion del clon 393193-16, el analisis permitio la agrupacion de los genotipos estudiados en clones y variedades. Los cultivares evaluados, a diferencia de los clones avanzados, son clasificados como S. tuberosum ssp. tuberosum, conocido comunmente como papa europea. Dichas diferencias en la especiacion y probablemente los progenitores empleados para la obtencion de estos materiales podrian explicar su agrupacion; no obstante, el clon 393193-16, a pesar de ser un material originado a partir de la poblacion B, mostro el menor grado de similitud con los demas individuos incluidos en este experimento. La poblacion B desciende de la selecciones de la poblacion A, desarrollada por el Centro Internacional de la Papa, y que incluia cultivares primitivos de las especies S. tuberosum ssp. andigena, S. phureja, S stenotomum y cultivares de S. tuberosum ssp. tuberosum (Landeo et al., 1995), por lo que su agrupacion puede responder a los genes predominantes obtenidos a partir de los diversos padres empleados.

[FIGURA 2 OMITIR]

En cuanto a la relacion entre la caracterizacion por SSR y la infeccion de raices por Spongospora subterranea, se encontro que de los 20 iniciadores, el STM-1016 genero una clasificacion de los genotipos muy similar a la obtenida a traves del analisis de varianza y prueba de medias (Figura 3), lo que demuestra la potencialidad de este iniciador para la evaluacion de la infeccion en raices. Se generaron dos grupos principales en la representacion grafica: grupo A, compuesto por los genotipos 393194-1, 393180-32 y 392634-21, 'Kennebec', 'Esperanza' y 'Granola', y grupo B por los clones 393193-16 y 392636-31. De esta manera, el grupo B incluye a los materiales con menor grado de infeccion por S. subterranea. A su vez, el grupo A se encuentra subdivido en dos, el subgrupo A1 donde se incluyen los clones 393194-1, 393180-32, 392634-21 y el cv. Kennebec, y el A2 conformado por los cvs. Granola y Esperanza. Los grupos A1 y A2 mostraron valores de infeccion altos e intermedio, respectivamente.

Los iniciadores STM1049, STM3023, STM3012 y STM0032 ofrecieron la mayor contribucion para la clasificacion del clon 393193-16 como un grupo aparte. Asimismo, el resultado sugiere que el grupo de iniciadores empleados tiene la potencialidad para discriminar entre genotipos de Solanum tuberosum con diversos grados de reaccion a la enfermedad. No obstante, es importante resaltar que los resultados se aplican solo a la infeccion de raices. Debido a que aun no se conoce una relacion concluyente entre la infeccion en la raiz y aquella que puede ser encontrada en el tuberculo (Falloon et al., 2003; Merz et al., 2004; van de Graaf et al., 2007), no es posible la realizacion de inferencias, por lo que deberian llevarse a cabo estudios mas detallados de este aspecto.

[FIGURA 3 OMITIR]

Relacion entre la caracterizacion fitoquimica de los genotipos de papa y la infeccion por S. subterranea.

Las antraquinonas estuvieron ausentes en todos los genotipos estudiados, mientras que los aceites esenciales estuvieron siempre presentes (Cuadro 3). La ausencia de antraquinonas y la presencia de aceites esenciales en algunos de estos materiales fue previamente reportada por Gonzalez et al. (2008) al evaluar en campo, un grupo mayor de genotipos, entre los cuales se incluian 'Esperanza', 'Granola', 'Kennebec' y el clon 392180-32. Marcano y Hasegawa (2002) senalaron que la ausencia de antraquinonas puede ser explicada por ser estas precursoras de otros grupos de MS, por lo que puede ser detectada solo en ciertas etapas del desarrollo de la planta. Ademas, es posible que dicho compuesto pudiese estar presente en concentraciones no detectables por la metodologia empleada para su identificacion.

De forma general, fue posible observar que la distribucion de los grupos de MS vario segun el organo y el genotipo en cuestion (Cuadro 4), donde los flavonoides en tuberculos fueron los compuestos con mayor frecuencia y concentracion. 'Granola' represento el genotipo con mas altos niveles de polifenoles y taninos en hojas y tallos aereos, lo cual concuerda con los resultados reportados por Gonzalez et al. (2008) en la evaluacion de este y otros materiales en condiciones de campo. La relacion de los polifenoles y taninos ha sido asociada a la defensa de la planta contra plagas y enfermedades (Izco, 2004); sin embargo, 'Granola' ha sido reportado como un genotipo altamente susceptible al agente causal de la candelilla tardia Phytophthora infestans (Garcia et al., 2005) por lo que este grupo de MS podria estar relacionado mas bien a otros caracteres.

En la representacion grafica de los individuos evaluados con relacion a los MS (Figura 4) se generaron dos grupos principales compuestos por los clones 393194-1, 392634-21, 393193-16 y 393180-32 (grupo A), y por el resto de los individuos (grupo B). Sin embargo, tal clasificacion agrupo al clon 393193-16 junto a los individuos que mostraron el mayor grado de infeccion por el patogeno (Figura 1), por lo que dicha agrupacion resulto contradictoria a los resultados obtenidos en las pruebas de inoculacion. No obstante, y partiendo del analisis de agrupacion realizado mediante los SSR, fue posible determinar que dicho genotipo resulto poseer un grado de disimilitud suficiente para ser clasificado como un individuo aparte dentro de los ocho materiales evaluados. Por tal razon, y a fin de buscar una mayor homogeneidad de las condiciones establecidas, se procedio a realizar un nuevo analisis de clasificacion considerando al clon 393193-16 como un individuo aparte.

La nueva reclasificacion de los siete materiales restantes en base a los grupos de metabolitos previamente senalados se muestra en la Figura 5. Dicha agrupacion presenta la formacion de dos grupos principales: A, con los clones 393194-1 y 392634-21 y B, el resto de los genotipos. De esta manera, los materiales con mayor grado de infeccion por el patogeno fueron agrupados como un unico grupo (A) y los genotipos con grados de infeccion media y baja en otro grupo (B).

[FIGURA 4 OMITIR]

[FIGURA 5 OMITIR]

A traves del analisis de ordenacion por escalamiento multidimensional (MDS) se pudo constatar el posicionamiento de los individuos; asi, luego del analisis de ajuste de PCC (Cuadro 5), se determino que los individuos que presentaron un mayor grado de infeccion fueron ordenados por los polifenoles y taninos, mientras que aquellos que presentaron menor grado de infeccion estuvieron ordenados por la presencia de flavonoides y alcaloides (Figura 6). Asimismo, se observa que los cultivares Kennebec y Granola se encontraron formando un sugbrupo diferente y mostraron estar ordenados principalmente por la presencia de alcaloides debilmente basicos. De forma general, la asociacion de las variables estudiadas explico de mejor manera la relacion entre la enfermedad y los MS para el grupo de los clones que para los cultivares, sugiriendo que el grado de separacion entre estos influye en los metabolitos que pudiesen estar relacionados con la enfermedad. McKee (1973) senalo que cada variedad, por definicion, debe diferir de otras de su misma especie en una o mas caracteristicas especificas, sean estas quimicas, fisiologicas o morfologicas, por lo que las diferencias en los MS evaluados en cada genotipo puede ser explicada por los mecanismos de regulacion que permiten la presencia de tales compuestos para la defensa en unas plantas y no en otras.

[FIGURA 6 OMITIR]

Falloon et al. (2003) senalaron que, asi como la resistencia por parte de Solanum tuberosum a Spongospora subterranea parece estar determinada por la asociacion de la accion aditiva de varios genes, igualmente es probable que tales genes respondan de manera diferente segun el genotipo y su interaccion con el ambiente. Tal aseveracion puede verse respaldada por los resultados presentados en este trabajo, en donde los clones 393194-1 y 393180-32, a pesar de presentar un alto grado de similitud en base a los estudios moleculares y de composicion de grupos de metabolitos presentes, no respondieron de igual manera a la enfermedad, por lo que otros mecanismos de defensa de la planta podrian estar actuando, como los mecanismos de control en el balance hormonal de la planta hospedante (Ludwig-Muller y Schuller, 2008).

Los mecanismos de resistencia debidos a la accion de los MS en la defensa de las plantas en diferentes patosistemas han sido reportados en otras investigaciones (Swain, 1977; Bell, 1981; Bennett y Wallsgrove, 1994), por lo que la relacion encontrada en nuestro estudio entre aquellos genotipos que presentaron menor grado de infeccion y la presencia de flavonoides sugiere la participacion de estos dentro de tales mecanismos de defensa, particularmente en las raices. Debido a la naturaleza de estos compuestos es necesario determinar su accion en pro de dicha defensa en vista de que tales grupos de MS pueden actuar en los procesos de senalizacion y formacion en las plantas (Hammerschmidt, 1999).

CONCLUSIONES

La reaccion de los genotipos empleados a la infeccion por Spongospora subterranea pudo ser discriminada en raices de Solanum tuberosum. Los clones avanzados 392636-31 y 393193-16 resultaron los genotipos con el menor grado de infeccion y 393194-1 y 393641-21 los de mayor nivel de infeccion radical. No se pudo discriminar para el caso de la parte aerea de la planta o los tuberculos

Se encontraron diferencias en base al estudio de similitud a partir de SSR, y el iniciador STM-1016 logro describir una agrupacion similar a la correspondiente a los resultados para la evaluacion de infeccion en raices

La agrupacion realizada por los metabolitos secundarios mostro diferencias entre los genotipos, y se obtuvo una relacion entre la presencia de flavonoides y los cultivares con menor grado de infeccion.

Recibido: Maizo 28, 2012

Aceptado: Diciembre 3, 2012

AGRADECIMIENTO

Al CDCHT de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado por la subvencion al proyecto 008-AG-2007.

LITERATURA CITADA

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(25.) Milbourne, D., R. Meyer, J. Bradshaw, E. Baird, N. Bonar, J. Provan, W. Powell y R. Waugh. 1997. Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. Molecular Breeding 3: 127-136.

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Francisco Bittara [1], Dorian Rodriguez [1], Alexander Hernandez [1], Maria E. Sanabria [1] y Nayleth Mendez [1]

[1] Postgrado de Fitopatologia. Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado. Apdo. 400. Barquisimeto, Venezuela. e-mail: bittarafco@yahoo.es; rdorian@ucla.edu.ve; mesanabria@ucla.edu.ve; ahernandez@ucla.edu.ve
Cuadro 1. Metabolitos secundarios (MS) analizados a traves de la
cromatografia en papel, solvente empleado, metodo de revelado y
resultado a esperar en positivos

MS              Solvente                   Revelado

Alcaloides      Butanol, acido acetico y   Luz ultravioleta
                  agua destilada (9:2:1)
Antraquinonas   Acido acetico glacial      Hidroxido de amonio
Flavonoides     Benceno, acido acetico y   Luz ultravioleta
                  agua destilada (9:1)
Polifenoles y   Acido acetico glacial y    Cloruro ferrico (1%)
  taninos         agua destilada (9:1)

MS              Resultado esperado

Alcaloides      Coloracion anaranjada
Antraquinonas   Coloracion rojiza
Flavonoides     Coloracion amarilla a
                  verde fosforescente
Polifenoles y   Coloracion parda
  taninos

Cuadro 2. Coeficientes de disimilitud de Gower entre ocho genotipos
de papa analizados a traves de la amplificacion
de secuencias sencillas repetidas (SSR)

Genotipos   393194-1   393193-16   392634-21   392636-31   393180-32

393193-16   0,3938
392634-21   0,3575     0,5233
392636-31   0,3212     0,4560      0,3990
393180-32   0,1503     0,4301      0,3938      0,3057
Esperanza   0,4404     0,4404      0,4249      0,4404      0,4041
Granola     0,3368     0,3886      0,4560      0,3886      0,3523
Kennebec    0,4197     0,4922      0,3938      0,4922      0,4352

Genotipos   Esperanza   Granola

393193-16
392634-21
392636-31
393180-32
Esperanza
Granola     0,3316
Kennebec    0,4249      0,3420

Cuadro 3. Evaluacion cualitativa de metabolitos en los extractos
etanolicos en diferentes organos de ocho genotipos de papa

Genotipo    Seccion   DB   ALC B   SCA   ANT   FLAV   PYT   SAP   AE

            P A       +    -       -     -     +      +     +     +
Esperanza   R         +    +       +     -     +      -     +     +
            T/E       -    -       +     -     +      +     -     +
            P A       +    +       -     -     +      +     +     +
Granola     R         +    +       +     -     -      -     -     +
            T/E       -    -       -     -     +      -     -     +
            P A       +    +       +     -     +      +     +     +
Kennebec    R         +    +       -     -     -      -     -     +
            T/E       -    -       -     -     +      +     -     +
            P A       +    +       +     -     +      +     +     +
393194-1    R         -    -       -     -     +      -     -     +
            T/E       -    -       -     -     +      -     -     +
            P A       +    +       -     -     +      +     +     +
393193-16   R         -    -       -     -     +      -     -     +
            T/E       +    -       -     -     +      +     +     +
            P A       +    +       +     -     +      +     +     +
392634-21   R         -    -       -     -     +      +     -     +
            T/E       -    -       -     -     +      +     +     +
            P A       +    -       +     -     +      +     +     +
392636-31   R         -    +       +     -     +      -     +     +
            T/E       -    -       -     -     +      +     +     +
            P A       +    +       +     -     +      +     +     +
393180-32   R         -    -       -     -     +      -     +     +
            T/E       -    -       -     -     +      +     -     +

PA: tallo aereo+hojas; R: raices; T/E: tuberculos/estolones; ALC:
alcaloides; DB: debilmente basicos; B= basicos; SCA: sales
cuaternarias de amonio; ANT: antraquinonas; FLAV: flavonoides; PYT:
polifenoles y taninos; SAP: saponinas; AE: aceites esenciales.
(+): presente; (-): ausente

Cuadro 4. Contenido (mg x [mL.sup.-1]) de alcaloides, flavonoides y
polifenoles y taninos en diferentes organos de ocho genotipos de papa
inoculados artificialmente con Spongospora subterranea

Genotipos\MS             Alcaloides                 Flavonoides
               PA        R       T/E      PA        R

393194-1       211,61    ND      161,15   1414,13   9408,02
393193-16      369,97    106,6   ND       135,34    5414,62
392634-21      111,34    ND      ND       1764,65   5615,22
392636-31      181,55    ND      101,57   2732,3    1510,54
393180-32      42,97     ND      ND       997,27    801,9
Esperanza      53,88     23,48   93,53    2200,48   524,47
Granola        1873,28   ND      529,59   8204,54   ND
Kennebec       99,52     ND      293,9    1261,77   ND

Genotipos\MS              Polifenoles y taninos
               T/E        PA         R         T/E

393194-1       15563,44   521,15     ND        ND
393193-16      13790,42   124,74     ND        58,05
392634-21      1849,54    88,5       2556,71   4178,66
392636-31      11100,81   2078,76    ND        607,78
393180-32      10226,15   105,73     ND        433,99
Esperanza      20742,12   377,16     ND        8620,09
Granola        19129,02   29605,95   ND        ND
Kennebec       5282,49    165,19     ND        7234,78

MS: metabolito secundario; PA: parte aerea (tallo + hojas); R: raiz;
T/E: tuberculo y estolon. ND: No detectado

Cuadro 5. Valores del analisis de correlacion de componentes
principales (PCC) a partir del estudio de grupos de metabolitos
secundarios presentes en raices de siete genotipos de papa inoculados
artificialmente con Spongospora subterranea

Variable     Eje X    Eje Y    Eje Z    r-cuadrado

ALC R1       -0,405   -0,584   -0,703       0,564
PYT R1        0,466    0,301    0,832       0,662
ALC DB R2    -0,951    0,150   -0,271       0,899
ALC B R2     -0,340    0,019    0,940       0,906
ALC SCA R2   -0,045   -0,370    0,928       0,743
SAP R2        0,338   -0,833    0,438       0,921
FLAV R2       0,491   -0,740   -0,461       0,939

ALC: alcaloides, DB: debilmente basicos, B: basicos, SCA: sales
cuaternarias de amonio, FLAV: flavonoides; PYT: polifenoles y taninos;
SAP: saponinas; R: raiz; 1: analizado cuantitativamente;
2: analizado cualitativamente
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Author:Bittara, Francisco; Rodriguez, Dorian; Hernandez, Alexander; Sanabria, Maria E.; Mendez, Nayleth
Publication:BIOAGRO
Date:Jan 1, 2013
Words:6116
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