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Caracterizacion molecular mediante rep-PCR de aislados nativos de Bacillus thuringiensis, obtenidos de muestras de suelo.

Molecular characterization using rep-PCR of native isolates of Bacillus thuringiensis, obtained from soil samples.

INTRODUCCION

El empleo de insecticidas quimicos ha permitido disminuir de forma rapida y eficiente los problemas causados por insectos que actuan como vectores de enfermedades o como plagas en cultivos agricolas. Sin embargo el uso irracional y excesivo de quimicos genera problemas como la contaminacion del ambiente, la perdida de efectividad de los insecticidas y la reduccion de la biodiversidad, entre otros (Bernal 2011).

Bacillus thuringiensis es el insecticida mas utilizado para el control de insectos, ya que ha representado aproximadamente el 90% del mercado de biopesticidas, el cual asciende a 600 millones de dolares. B. thuringiensis tiene diversas ventajas que se derivan principalmente de su alta especificidad contra los insectos susceptibles, su inocuidad hacia el medio ambiente, la entomofauna benefica y demas organismos vivos, incluyendo el hombre, ademas de una incidencia escasa de fenomenos de resistencia (Lopez y Ceron 2010).

B. thuringiensis es una bacteria Grampositiva formadora de esporas que produce una proteina cristal insecticida, compuesta por delta-endotoxinas que son toxicas para un alto numero de insectos plaga y son biodegradables e inocuas para otras especies (Ramirez et al. 2010). La resistencia presentada por los insectos y la poca persistencia de los biopreparados en el suelo por su escasa adaptabilidad al medio, sugieren la realizacion de investigaciones que permitan la identificacion de nuevos aislados nativos con mayor toxicidad y mayor permanencia en el campo.

Para la produccion de biopreparados se recomienda seguir un control de calidad aplicando los parametros de identidad, concentracion y pureza; la identificacion especifica del microorganismo permitira la reproduccion de los resultados y evitaria la diseminacion en el ambiente de patogenos estrictos u oportunistas del hombre y otros organismos. Para la identificacion de B. thuringiensis se siguen procedimientos simples como la descripcion de su morfologia celular, coloracion Gram, analisis de su capacidad para crecer en condiciones aerobias o anaerobias y requerimientos de sustratos especiales para su cultivo. La serotipificacion es la tecnica mas aceptada para la clasificacion de subespecies de B. thurigiensis. Estas tecnicas permiten una identificacion hasta la especie, pero la clasificacion de subespecies, serovariedades o cepas, requiere de metodos mas especificos, como el uso de marcadores moleculares.

Las tecnicas de tipificacion basadas en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se fundamentan en la amplificacion de secuencias de ADN polimorficas y la separacion por electroforesis de los productos de amplificacion. Estas tecnicas poseen un elevado poder de discriminacion, son menos laboriosas, mas rapidas y mas flexibles que las pruebas tradicionales de identificacion. La tecnica rep-PCR nos permite caracterizar subespecies, serovariedades y cepas de una forma mas simple, rapida y reproducible en una gran variedad de microorganismos, incluido B. thuringiensis (Lupski y Weinstock 1992).

Esta investigacion consistio en la caracterizacion molecular mediante rep-PCR de 10 aislados nativos identificados inicialmente con pruebas microbiologicas y bioquimicas, a partir de muestras de suelo de los municipios de Cucuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia.

MATERIALES Y METODOS

Aislamiento e identificacion. Se tomaron muestras de 200 g de suelo de pastizales y rizosferas de arboles, a una profundidad de 5 a 10 cm, provenientes de los municipios de Cucuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander. De cada muestra se registro in situ, la localizacion y las caracteristicas fisicas del sitio de muestreo; y ex situ, se determino el pH y la textura del suelo. Las muestras fueron secadas a temperatura ambiente (24[grados]C) durante un dia. Para el aislamiento de B. thuringiensis se utilizo el metodo descrito por Galvis (2013); la determinacion macroscopica y microscopica se hizo con la descripcion propuesta por Realpe et al. (2002); y la identificacion bioquimica se realizo con el kit BBL CRYSTAL Gram Positivo/GP (Becton Dickinson) y los parametros presentados por Dworkin et al. (2006). Como controles positivos para las pruebas bioquimicas y moleculares se utilizaron variedades de B. thuringiensis donadas por Corpoica Tibaitata y la Corporacion para la Investigaciones Biologicas (CIB): aizawai, darmstadiensis, kenya, tenebrionis, sandiego, israelensis.

Caracterizacion molecular mediante rep-PCR. El ADN de los aislados y las cepas control se obtuvo por medio del kit Wizard Genomic DNA Purification de Promega. Los marcadores y cebadores utilizados fueron Bc-Rep-1 (5'-ATTAAAGTTTCACTTTAT-3'), Bc-Rep-2 (5'-TTTAATCAGTGGGG-3') (Bartoszewicz et al. 2013) y M-B1 (5'-TGTACATA AGACGA AGCCC-3') (Brumlik et al. 2001). Las muestras de ADN fueron amplificadas en un volumen final de 50 [micron]l con 200 [micron]M de dNTPs, 2U de Taq Polimerasa, 5 mM de Mg[Cl.sub.2], 1 [micron]M de cada oligonucleotido y 2 pl del ADN aislado. Los ciclos de amplificacion usados para la rep-PCR fueron: desnaturalizacion inicial a 94[grados]C por 5 min, seguidos de 32 ciclos de 94[grados]C por 1 min, 42[grados]C por 1 min, y 72[grados]C por 1 min y 30 s; y una extension final de 72[grados]C por 7 min. Los perfiles de bandas se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,4% por 3 h a 50 V, y tenidos con bromuro de etidio. Los perfiles de ADN fueron analizados con el software estadistico NTSYS 2.0.

RESULTADOS Y DISCUSION

Aislamiento e identificacion. Se recolectaron 45 muestras de suelo de los municipios de Cucuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander. Los suelos muestreados fueron de textura predominante arcillosos-arenosos y con un rango de pH entre 4,5 y 9,7. Se seleccionaron 10 aislados por presentar las siguientes caracteristicas: 1. Morfologia predominante para B. thuringiensis (colonia mediana a grande, plana de borde irregular lobulado y/o arborescente, consistencia blanda, aspecto opaco/ mate, pigmentacion blanco cremoso) 2. Bacilos Gram positivos. 3. Esporas cilindricas u ovoides no deformante del cuerpo del bacilo en posicion terminal o subterminal. 4. Y por presentar cristal.

Los 10 aislados se identificaron como B. cereus con BBL CRYSTAL, y debido a que B. cereus y B. thuringiensis son bioquimicamente identicos, diferenciandose unicamente por la produccion del cristal parasporal, se confirma que estos aislados pertenecen a esta especie. En la caracterizacion bioquimica a nivel de variedad de B. thuringiensis, los aislados BtNS2, BtNS4, BtNS6, BtNS7, BtNS9 y BtNS10 poseen un 100% de similitud bioquimica con B. thuringiensis var. Kurstaki; el aislado BtNS8 mostro relacion con B. Thuringiensis, var. Israelensis; y los aislados BtNS1 y BtNS3 no presentan relacion con las variedades comparadas.

Caracterizacion molecular. Las amplificaciones con el marcador Bc-Rep mostraron patrones con pocas bandas que variaron en numero de 1 a 5, con un tamano aproximado entre 4000 y 400 pb. (Figura 1). Las bandas ubicadas a 1700 y 1100 pb presentan mayor similitud entre los aislados, pero estan ausentes en algunos de ellos, por esta razon tambien se consideran polimorficas.

Los patrones observados en la amplificacion con el marcador MB1 presentaron mayor cantidad de bandas que los obtenidos con los cebadores Bc-Rep. El numero de bandas amplificadas en los diferentes aislados y controles vario entre 4 y 12 y con un tamano aproximado de 2500 a 150 pb. (Figura 2). Todos los aislados, menos BtNS1 y BtNS2, comparten una banda de 1400 pb, que tambien esta presente en los controles B. thuringiensis var. Tenebrionis, B. Thuringiensis var. Berliner, B. Thuringiensis var. San diego y B. Thuringiensis var. Israelensis. Las bandas de 1000 y 500 pb estan presentes en todos los aislados menos en el BtNS1.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Analisis filogenetico. El analisis con el marcador Bc-Rep genero 4 clusters, donde los clusters I, II y III se agrupan con una similitud de 18%. El aislado BtNS7 no tiene ninguna similitud con todos los demas aislados y controles. En el cluster I los aislados BtNS4, BtNS5, BtNS6 y el control B. thuringiensis var. Darmstadiensis comparten un 100% de similitud. En el cluster II los aislados BtNS1 y BtNS2 tienen una similaridad de 80%. Los controles B. thuringiensis var. Tenebrionis y B. thuringiensis var. Berliner presentan un 86% de similitud; y un 54% de similaridad con los aislados BtNS1, BtNS2 y BtNS3. El cluster III agrupa los aislados BtNS9 y BtNS11 con una similitud del 100%, y estos 2 comparten un 73% de similitud con el control B. thuringiensis var. San diego (Figura 3).

[FIGURA 3 OMITIR]

El analisis filogenetico para los aislados nativos y controles con el marcador MB1 genero 4 clusters. Todos los aislados presentan una similaridad de 58%. En el cluster I el aislado BtNS6 y el control B. thuringiensis var. Aizawai comparten un 72% de similaridad. En el cluster II se agrupan 10 muestras con un coeficiente de similitud del 77%. Los aislados BtNS1 y BtNS8 comparten una similaridad de 97% entre si, y un 89 y 87% con los controles B. thuringiensis var. Berliner y B. thuringiensis var. San diego, respectivamente. Los aislados BtNS4 y BtNS5 tienen un 100% de similitud, y los 2 comparten un 94% con el aislado BtNS3. En el cluster III los aislados BtNS9 y BtNS11 comparten 100% de similitud; y estos 2 con B. thuringiensis var. Israelensis tienen un 82% de similaridad. En el cluster IV solo se encuentra el aislado BtNS10 que comparte un 71% de similitud con los clusters II y III. (Figura 4).

[FIGURA 4 OMITIR]

La rep-PCR es una tecnica util para estudios de variabilidad genetica en aislados de B. thuringiensis provenientes de diversas fuentes, que ofrecen multiples ventajas como la universalidad de los cebadores, reproducibilidad relativa de los resultados, y sencillez en su procedimiento y equipos requeridos (Katara et al. 2012).

En este trabajo la rep-PCR mostro claramente distintos patrones de amplificacion para todas las cepas, con pocas bandas comunes entre algunos aislados y controles. El analisis filogenetico con Bc-Rep mostro un indice de similaridad bajo (18%), debido posiblemente a la alta variabilidad genetica dentro de este grupo, detectada por este marcador, de alli su posibilidad de adaptarse a diferentes ambientes y presentar efectos toxicos hacia varios ordenes de insectos. Lo anterior tambien ha sido reportado por diversos autores, al observar un alto grado de polimorfismos entre diferentes aislados de B. thuringiensis inclusive, provenientes de un mismo sitio (Katara et al. 2012). En un estudio realizado por Reyes e Ibarra (2005), donde caracterizaron diferentes variedades de B. thuringiensis mediante rep-PCR con el marcador Bc-Rep, obtuvieron una similitud de 12% entre las variedades israelensis y aizawai de B. thuringiensis. Este porcentaje de similitud es semejante al obtenido en este trabajo, 18%, a partir de los mismos cebadores y entre las mismas variedades de B. thuringiensis.

El marcador MB1 permitio mayor confiabilidad en el agrupamiento de los aislados, y genero una similitud del 58%. Brumlik et al. (2004) tambien utilizaron MB1 para caracterizar diferentes especies del grupo de B. cereus (B. cereus, B. anthracis y B. thuringiensis) y obtuvieron un coeficiente de similitud entre todos los aislado del 30%. En este trabajo el porcentaje de similitud con MB1 fue mayor, 58%, debido a que solo fueron caracterizados aislados de B. thuringiensis, identificados bioquimicamente.

Finalmente este trabajo mostro que la mayoria de los aislados presentaron diferentes patrones de bandas a pesar de haber sido aislados en la misma region, lo que demuestra la gran variabilidad genetica de B. thuringiensis y el alto poder de discriminacion que poseen los marcadores Bc-Rep y MB1, que permiten establecer diferencias a nivel interespecifico. A pesar de esta variabilidad genetica, presentada entre los aislados de B. thuringiensis, se observo que tanto el marcador Bc-Rep como MB1, permitieron el agrupamiento de los aislados BtNS4 y BtNS5 con el control B. thuringiensis var. Darmstadiensis. Estos aislados podrian ser analizados mediante bioensayos o caracterizacion de genes cry y cyt, para probar su potencial como bioinsecticidas contra dipteros.

Recibido: 02/05/13

Aceptado: 10/09/13

LITERATURA CITADA

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BERNAL E. 2011. Comparacion socioeconomica de las empresas agrarias de produccion ecologica y convencional en Aragon, Espana: Problemas y oportunidades. Mundo Agr. 11(2): 1-28.

BRUMLIK M.J., BIELAWSKA A., ZAKOWSKA D., LIANG X., SPALLETTA R.A., PATRA G., DELVECCHIO V.G. 2004. Genetic diversity among

Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains using repetitive element polymorphism-PCR. Polish Journal of Microbiology 53(4):215-225.

BRUMLIK M.J., SZYMAJDA U., ZAKOWSKA D., LIANG X., REDKAR R.J., PATRA G., DEL VECCHIO V.G. 2001. Use of long-range repetitive element polymorphism-PCR to differentiate Bacillus anthracis strains. Appl. Environ. Microbiol. 67:3021-3028.

DWORKIN M., FALKOW S., ROSENBERG E., SCHLEIFER K.H., STACKEBRANDT E. 2006. The Prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria (Third Edition), Springer. Chapt. 16. 4:530-563.

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LOPEZ S., CERON J. 2010. Proteinas Cry de Bacillus thuringiensis y su interaccion con coleopteros. NOVA 8(14):183-194.

RAMIREZ L., RAMIREZ N., FUENTES L.S., JIMENEZ J., HERNANDEZ J. 2010. Estandarizacion de un bioensayo y evaluacion preliminar de tres formulaciones comerciales de Bacillus thuringiensis sobre Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae). Rev. Colomb. Biotecnol. 12(1):12-21.

REALPE M., HERNANDEZ C., AGUDELO C. 2002. Especies del genero Bacillus. Morfologia macroscopica y microscopica. Biomedica 22:106-109.

REYES A., IBARRA J.E. 2005. Fingerprinting of Bacillus thuringiensis type strains and isolates by using Bacillus cereus Group-Specific Repetitive Extragenic Palindromic Sequence-Based PCR analysis. Appl. Environ. Microbiol. 71:1346-1355.

Fabian Galvis (1)/*, Laura Yolima Moreno **

(1) Autor para correspondencia. Correo electronico: he.galvis@mail.udes.edu.co

* Grupo de Investigacion Biogen, Universidad de Santander, Cucuta, Norte de Santander, Colombia.

** Grupo de Investigacion Majumba, Universidad Francisco de Paula Santander, Cucuta, Norte de Santander, Colombia.
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Title Annotation:Nota tecnica
Author:Galvis, Fabian; Yolima Moreno, Laura
Publication:Agronomia Costarricense
Date:Jan 1, 2014
Words:2497
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