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Caracterizacion molecular de los genes pri y tptl en especies y variedades cubanas de tabaco (Nicotiana tabacum l.).

Molecular characterization of pri and tptl proteins in cuban tobacco species and varieties (Nicoatiana tabacum L.)

Introduccion

El tabaco es uno de los productos de mayor demanda en el mundo y es objeto de gran intercambio comercial. En Cuba, la produccion tabacalera ocupa un lugar destacado en la economia por ser una de las principales fuentes de ingreso con un gran reconocimiento internacional al considerarse entre los mejores del mundo (Basulto, 2005).

El desarrollo de tecnologias moleculares permite un salto cualitativo en las investigaciones de la fisiologia y la defensa de las plantas (Vidhyasekaran, 2008). El microarreglo es una novedosa tecnologia molecular que posibilita el analisis de expresion con una alta sensibilidad al monitorear el genoma con un fragmento de ADN, por lo que se obtiene un mejor esquema de las interacciones simultaneas entre miles de genes y las etiquetas de secuencias expresadas (ESTs) son cadenas cortas de ADN (alrededor de 500-800 pares de bases) que forman parte de un ADNc (Adams et al., 1991). La secuenciacion parcial de ADNc para generar ESTs se utiliza para la obtencion rapida y eficaz de un perfil detallado de genes expresados en varios tejidos, tipos de celulas o fases de desarrollo. Los conocimientos sobre la biologia de las plantas se enfocan en las respuestas fisiologicas y bioquimicas a nivel microscopico; sin embargo, aun es insuficiente lo que se conoce sobre los cambios en los niveles de expresion de los genes (Ranz y Machado, 2006; Gilad y Borevitz, 2006).

Desde el punto de vista genomico funcional, la combinacion de las ESTs con los microarreglos, permiten la identificacion de nuevos genes relacionados con las respuestas defensivas de las plantas (Lee y Hwang, 2006). El estudio de estos genes y de su expresion en el tiempo puede contribuir a la comprension de la resistencia de la planta y es el punto de partida para su aplicacion practica en el control de enfermedades (Que et al., 2006).

Los genes tptl y prl codifican para la proteina tumoral controlada durante la traduccion y la proteina relacionada con la patogenesis, respectivamente; estas proteinas intervienen en procesos como el crecimiento vegetal y la tolerancia a diferentes tipos de estres (Perez et al., 2006). Numerosos estudios han demostrado la presencia de estos genes en varias especies vegetales de importancia economica, por lo que este trabajo tiene como objetivo detectar la presencia de los genes tptl y prl en el genoma de algunas especies y variedades cubanas de tabaco.

Materiales y metodos

Se sembraron semillas de cuatro variedades de tabaco provenientes de la provincia de Yunnan (R. P China) en bolsas con suelo ferralitico rojo. Las variedades utilizadas fueron 'Hongda', (tabaco Negro) susceptible al TMV y 'NC82', 'YH05' y 'YUN201' (tabaco Burley) resistentes al virus (Comunicacion personal Dong Haitao, 2005). Las plantas crecieron en un semillero a una temperatura de 25oC y una humedad relativa del 70% hasta los 45 dias de edad. Luego, se tomaron las muestras (5g) provenientes de las hojas, tallos y raices, y se trituraron en un mortero con nitrogeno liquido para la extraccion y purificacion del acido ribonucleico total (ARN total).

La primera cadena de ADNc fue sintetizada mediante el Sistema de Sintesis RiboClone[R] ADNc (Promega 2005) con la pareja de cebadores oligo(dT)16 (5'-[AACATATGCGGCCGCATTATGGCCTTT.sub.16]-3' y 5'-GATCTTCCACGCGTCGAC[(T).sub.16] 3') y a partir de las condiciones de amplificacion recomendadas en el prospecto del juego de reactivos Marathon[TM]. Para la sintesis de la segunda cadena de ADNc se combinaron 2 [micron]g.[mL.sup.-1] de la primera cadena de ADNc, 76 mL de [H.sub.2]O desionizada, 10 [micron]g.[mL.sup.-1] de solucion de PCR 10x, una mezcla de 20 mM de dNTP 50x, 3 Pmol. mL-1 de cada cebador utilizado en la sintesis de la primera cadena de ADNc, 25 mM [Mg.sup.2+] y 2 [micron]g.[mL.sup.-1] 50 x mezcla de la enzima transcriptasa reversa AMV. Se utilizo el programa GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se emplearon 5 mL del producto amplificado para la separacion a traves de la electroforesis en gel de agarosa al 1 % tenido con bromuro de etidio con el patron de peso molecular 1 kb (Promega 2005).

Las secuencias se editaron con el programa SEQUENCE NAVIGATOR (Perkin Elmer/Applied Biosystems) y los programas BLASTX y BLASTN se utilizaron para buscar similitudes con las proteinas y los acidos nucleicos en la base de datos dbEST del NCBI de los EUA. Las secuencias de los genes provenientes de los ADNc se depositaron en la base de datos Genbank de EST (www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/species=tobacco).

El analisis de la expresion se realizo mediante el microarreglo de ADNc en membranas de nylon/Amersham Ltd.) segun lo descrito por Perez et al. (2006). La hibridacion se realizo toda la noche a 60[grados]C en un horno de hibridacion. La validacion de los resultados de la hibridacion con microarreglos se realizo mediante la RT-PCR cuantitativa en tiempo real y se utilizo el metodo SYBR[R] Green (Invitrogen life technologies 2003).

Para determinar la presencia de los genes tptl y pr1 en las especies N. glutinosa L., N. tomentosiformis Goodsp., N. debneyi Domin., N, exigua H-M Wheeler, N. excelsior (J. M. Black) J. M. Black., N. megalosiphon van Heurck & Mull. Arg. y las variedades de N. tabacum L. Habana-2000, Corojo 99, Criollo 98, Habana 2.1.1, Burley Habana-13 (BH-13), BHmN, Corojo, San Luis 21 y Virginia Resistente-14 se sembraron semillas en casas de cultivo protegido, bajo condiciones semicontroladas, en el Instituto de Investigaciones del Tabaco (IIT). Se tomaron muestras de 5 g de hojas de cada especie y variedad en estudio y se realizo la extraccion de ADN genomico mediante el metodo CTAB California segun el protocolo de Sabater y Vilumara (1988) y se purifico siguiendo el protocolo de Ausubel (1995).

Los cebadores se disenaron mediante el programa Vector NTI (Invitrogen) a partir de las secuencias identificadas en este trabajo y teniendo en cuenta los resultados del alineamiento, las secuencias de los cebadores son para tpt1 (5'-TGTCTGGTGGAGTGCTTCTG-3', 3'-TCATTTGCTGTGTCCCACAT-5') y para pr1 (5'-GGGAGTTTTGAGCTTTGGATGAG-3', 3'-GACACCTAACGGGACTGCTTTCC-5').

Los fragmentos de ADN genomico se amplificaron mediante la tecnica PCR en un termociclador Tpersonal (Biometra[R]). El programa consistio en 5 min iniciales de desnaturalizacion a 92[grados]C, a continuacion 36 ciclos de desnaturalizacion, alineamiento y extension a 92[grados]C por 30 s, 55[grados]C por 45 s, 72[grados]C por 45 s y 10 min de extension final a 72[grados]C. La visualizacion de los resultados se realizo mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% tenido con bromuro de etidio.

Resultados y discusion

Se generaron 5927 secuencias desde ambos extremos de los clones seleccionados de la genoteca de ADNc de N. tabacum (tabla 1).

Las ESTs se utilizan para profundizar en los procesos moleculares que tienen lugar en las plantas y en otros organismos asi como para la identificacion de genes nuevos. Ji et al. (2006) realizaron un estudio en plantas de soya (G. soja) para analizar posibles respuestas fisiologicas bajo condiciones de estres; Jantasuriyarat et al. (2005) obtuvieron mas informacion sobre los mecanismos de defensa de la planta de arroz (O. sativa) contra el hongo Magnaporthe grisea, al obtener ESTs de las cuales el 13% fueron secuencias unicas.

Como resultado del microarreglo construido en el presente trabajo, se obtuvieron 359 ESTs. En la tabla 2 se presentan las que resultaron ser novedosas y las que pueden tener mayor importancia o interes para el mejoramiento del tabaco.

La evaluacion de la expresion a traves del microarreglo de ADNc de las secuencias unicas identificadas permitio el examen simultaneo de un gran numero de secuencias y el analisis de su relacion con funciones biologicas.

Las 245 ESTs que resultaron ser novedosas al no encontrarse homologia en la dbEST del NCBI, sugirieron la posibilidad de ser genes importantes especificos para N. tabacum. Analisis futuros de estas secuencias podrian contribuir a una mejor comprension de la funcion y organizacion del genoma de esta planta.

Los genes que codifican para la TCTP y la PR1 fueron seleccionados para detectar su presencia en variedades cubanas y especies de tabaco (N. tabacum), ya que en el caso del gen tpt1 no ha sido muy estudiado en plantas, y el pr1 es un gen relacionado con respuestas de defensa. La deteccion de estos genes en variedades y especies seria de gran utilidad para el mejoramiento genetico del tabaco en Cuba.

De las 359 secuencias obtenidas despues del microarreglo, se seleccionaron seis para validar los resultados a traves de la PCR cuantitativa en tiempo real (figura 1). La Ub y el factor de elongacion se utilizaron como controles internos por ser genes de mantenimiento y por participar en procesos celulares, como sostenimiento de la estructura celular o metabolismo primario (Radonic et al., 2004; Nicot et al., 2005). Segun Vandesompele et al. (2002) deben utilizarse al menos dos o tres genes de mantenimiento como controles internos para la normalizacion, porque el uso de un solo gen pudiera conllevar a errores.

Como se observa en la figura 1, los valores globales de las expresiones de los genes entre el microarreglo y la cuantificacion relativa mediante la amplificacion con la RT-PCR cuantitativa en tiempo real, no variaron considerablemente, lo que demuestra la confiabilidad de los resultados obtenidos en el microarreglo construido.

La mayoria de las secuencias probadas mostraron un comportamiento similar entre un experimento y otro, solo la Ub y la PR-1 muestran una pequena diferencia en la variedad Hongda y aunque la Ub se considera como un gen de mantenimiento estable en varias especies de plantas como O. sativa y A. thaliana (Czechowski et al., 2005; Jain et al., 2006) existen informes que senalan su expresion inestable en tres cultivares de O. sativa entre un experimento y otro (Caldana et al., 2007).

[FIGURA 1 OMITIR]

La figura 2 muestra el dendrograma construido a partir de los resultados del alineamiento de la secuencia del gen tptl en la base de datos dbEST (GenBank). En el arbol se definen dos grupos principales (1 y 2). El agrupamiento 1 incluye ocho secuencias identificadas en varias especies de angiospermas; estas fueron agrupadas en varios subgrupos; mientras que en el agrupamiento 2 solo se ubica una secuencia identificada en N. tabacum.

Los resultados obtenidos en el alineamiento confirmaron lo planteado por varios autores, que el gen tptl es un gen eucariotico altamente conservado (Arcuri et al., 2005; Thierry-Mieg y Thierry-Mieg, 2006). La secuencia en estudio (CV016945) se ubico en uno de los subgrupos del agrupamiento 1 y resulto geneticamente similar a una secuencia homologa identificada en A. thaliana. Esta observacion resulta muy interesante, teniendo en cuenta que otras secuencias significativas fueron identificadas en especies de la familia Solanaceae (S. tuberosum y S. lycopersicon). Estas dos secuencias son geneticamente similares entre si, pero no lo son respecto a N. tabacum CV016945, pues aunque se encuentran en el mismo agrupamiento principal, se ubicaron en un subgrupo diferente.

Los resultados de la amplificacion del gen tptl evidenciaron su presencia en las especies N. glutinosa y N. tomentosiformis (figura 3). En estas especies se obtuvieron fragmentos de ~850 pb que se corresponden con el tamano del fragmento esperado segun la secuencia conocida (828 pb) a partir de la cual se disenaron los cebadores.

[FIGURA 2 OMITIR]

Khan y Narayan (2007) plantearon que la reorganizacion de las secuencias de ADN, la perdida de secuencias de bases, asi como el aislamiento geografico, fueron procesos fundamentales en el origen y diferenciacion de las especies de Nicotiana. Al analizar los resultados obtenidos en la amplificacion teniendo en cuenta este planteamiento, es posible que este gen haya sido eliminado del genoma de N. debneyi, N. exigua, N. excelsior y N. megalosiphon. Estas especies pertenecen a la seccion Suaveolentes, la que segun Chase et al. (2003) es de origen monofiletico y ha evolucionado aisladamente en Australia y el Pacifico Sur.

Se demostro que la especie N. tabacum se origino por la hibridacion natural de N. sylvestris y N. tomentosiformis por lo que resulto interesante que el gen tptl no se haya detectado en ninguna de las cuatro variedades de tabaco estudiadas.

La amplificacion del gen prl mediante la tecnica de la PCR, resulto en un fragmento de aproximadamente 600 pb en todas las variedades estudiadas; estos resultados coinciden con los planteados por Freitas et al. (2003) quienes realizaron estudios genomicos sobre estos genes prly no encontraron diferencias entre los distintos genotipos de trigo estudiados.

El estudio de este gen resulta importante ya que ofrecio informacion que puede servir no solo para la especie en estudio, sino tambien para otras especies de plantas, sobre todo las pertenecientes a la familia Solanaceae. Con respecto a esto, algunos autores como Kyu et al. (2006), reportan que estos genes pr1 se identificaron en los genomas de diversas especies de organismos dentro de las que se incluyen ademas de algunas plantas, nematodos y humanos.

[FIGURA 3 OMITIR]

A pesar de observarse los mismos patrones de amplificacion en las ocho variedades en estudio, estos presentan diversos comportamientos ante las enfermedades que atacan el cultivo de tabaco en Cuba; por tanto, se realizo a estos productos de amplificacion una digestion con la enzima de restriccion Hind III S-400 Matrix, para buscar polimorfismos, cuyos resultados se muestran en la figura 4.

Como se observa en la figura anterior, las dos bandas de restriccion de las variedades Corojo, Habana 2000, San Luis 21, Virginia Resistente-14 (5-8) presentan un tamano aproximado de 350pb y 250pb, respectivamente. El producto de amplificacion que fue sometido a la digestion enzimatica, en el caso de estas variedades, contenia un solo sitio de restriccion. Este resultado coincide con lo esperado, ya que la secuencia a partir de la cual se disenaron los cebadores para la amplificacion tambien contenia un solo sitio de restriccion. Por otra parte, las tres bandas de restriccion de las variedades Criollo 98, Habana 2.1.1, BH-13, BHmN (1-4) son de aproximadamente 100pb, 200pb y 300pb, respectivamente, mostrando este fragmento de amplificacion dos sitios de restriccion.

[FIGURA 4 OMITIR]

Estos resultados pudieran indicar que en las ultimas variedades analizadas se amplifico un fragmento de ADN genomico que presenta una variacion en su secuencia de nucleotidos, lo cual trajo como consecuencia que apareciera un nuevo sitio de restriccion para la enzima Hind III. A su vez, estos resultados concuerdan con los obtenidos por Rowland et al. (2003), quienes trabajaron con Vaccinium ssp. Dichos autores encontraron polimorfismos al realizar amplificaciones a varios genes de interes y luego digerir estos fragmentos de amplificacion con la enzima de restriccion Alu I, obteniendo para algunos genotipos de esta especie, diferentes patrones de bandas de restriccion.

Como aspecto practico de las investigaciones de los genes pr1 , a partir de su utilizacion se han encontrado variedades resistentes a diversas enfermedades (Edreva, 2005). Por estas razones se pudiera afirmar que es importante haber encontrado en el germoplasma analizado, la secuencia que pertenece al gen que codifica para la PR-1, aunque las variedades muestren caracteristicas diferentes al ser tratados sus respectivos productos de amplificacion con la enzima de restriccion.

Se realizo ademas para esta secuencia (PR1) un analisis filogenetico entre esta y secuencias afines en otros organismos, cuyos resultados se muestran en la figura 5.

Al analizar filogeneticamente la PR-1 de N. tabacum utilizada en esta investigacion para el diseno de los cebadores, esta se ubico en el primer grupo de los cuatro existentes, hallandose distante del resto de las PR-1 informadas. La mayor similitud fue con el ARNm del tabaco, aunque las distancias geneticas son muy diferentes (0.90 y 0.45, respectivamente). De manera general, se puede apreciar que todas las PR-1 son de especies dicotiledoneas coincidiendo este resultado con Liu y Xue (2006) quienes al analizar la PR-1 de Oriza sativa encontraron grupos de PR-1 para especies mono y dicotiledoneas, concluyendo que la divergencia de las proteinas PR fue subsecuente a la divergencia de las plantas mono y dicotiledoneas.

[FIGURA 5 OMITIR]

En el grupo 2 la mayoria de las PR son de plantas que pertenecen a la familia Solanaceae lo que coincide con los resultados publicados por Freitas et al. (2003) donde los dos agrupamientos observados estuvieron formados por proteinas pertenecientes a especies de la misma familia. La similitud de la PR de A. thaliana con las PR de especies de la familia Solanaceae tambien se informo por estos autores.

Conclusiones

Se demostro la efectividad de los cebadores especificos disenados para la amplificacion de los genes tpt1 y pr1.

Se detecto la presencia del gen tpt1 en las especies N. glutinosa y N. tomentosiformis.

Se detectaron diferencias con respecto a la secuencia del gen pr1, que permitieron caracterizar ocho variedades utilizadas en el Instituto de Investigaciones del Tabaco en el programa de mejoramiento genetico de este cultivo.

Recibido: enero 20 de 2011

Aprobado: abril 24 de 2012

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Sandra Perez Alvarez, PhD *, Daniel Cabezas Montero, PhD *; Yoannys Dominguez Rodriguez, MSc *, Orlando Coto Albelo, PhD **, Humberto Garcia Cruz, PhD ***

* Universidad Agraria de la Habana--C.P. 32700--Habana--Cuba.

** Instituto de Fruticultura Tropical--C. P. 11300--Habana--Cuba.

*** Instituto de Investigaciones del Tabaco, San Antonio de los Banos, Habana, Cuba.
Tabla 1. Analisis de las secuencias marcadas
expresadas en tabaco (N. tabacum)

Resumen de EST

Total de ESTs                         5 927
Largo de la EST (nt)                   351
Numero de secuencias contiguas (1)     521
Redundancia (%) (2)                   48.1
Numero de secuencias sencillas        3 079
Contenido de G + C (%)                43.6

(1) Grupo de clones que representan regiones
superpuestas del geno ma.

(2) Redundancia = ESTs agrupadas en secuencias
contiguas/total ESTs.

Tabla 2. Secuencias marcadas expresadas mas novedosas
y de mayor interes para el mejoramiento del tabaco
(N. tabacum) obtenidas en el microarreglo

Variedades (1)      EST           Anotaciones (2)

Hongda-NC82      TBT026C05   PR-1
                 TBT046G07   -
Hongda-YH05      TBT040D03   Proteina de union
                             probable a esteroides
                 TBT108H08   Proteina serina-treonina
                 TBT112A12   Metalotioneina tipo 2
Hongda-YUN201    TBT012G08   PR-1
                 TBT087G01   Ubiquitina
                 TBT069F05   Proteina tumoral
                             controlada en la
                             traduccion (TCTP)
                 TBT018C04   -
NC82-YH05        TBT080G07   Proteina de choque termico
                 TBT081C03   Proteina serina-treonina
                 TBT115D05   -
                 TBT112A12   Metalotioneina tipo 2
NC82-YUN201      TBT012G08   PR -1
                 TBT047H04   Proteina de union
                             probable a esteroides
                 TBT053F03   Ubiquitina SMT3
                 TBT087G01   Ubiquitina
YH05-YUN201      TBT083H01   TCTP
                 TBT033C05   Ubiquitina SMT3
                 TBT055D02   -
                 TBT026C05   Quinasa ciclina
                             dependiente

Variedades (1)      EST           Taxonomia (3)

Hongda-NC82      TBT026C05   N. tabacum
                 TBT046G07   -
Hongda-YH05      TBT040D03   -

                 TBT108H08   Solanum tuberosum
                 TBT112A12   -
Hongda-YUN201    TBT012G08   N. tabacum
                 TBT087G01   Ascomicetos
                 TBT069F05   Oriza sativa

                 TBT018C04   -
NC82-YH05        TBT080G07   Solanum lycopersicon
                 TBT081C03   Solanum tuberosum
                 TBT115D05   -
                 TBT112A12   -
NC82-YUN201      TBT012G08   N. tabacum
                 TBT047H04

                 TBT053F03   A. thaliana y O. sativa
                 TBT087G01   Ascomicetos
YH05-YUN201      TBT083H01   Oriza sativa
                 TBT033C05   A. thaliana y O. sativa
                 TBT055D02   -
                 TBT026C05   -
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Title Annotation:ARTICULO CORTO
Author:Perez Alvarez, Sandra; Cabezas Montero, Daniel; Dominguez Rodriguez, Yoannys; Coto Albelo, Orlando;
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2012
Words:4066
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