Printer Friendly

Caracterizacion fenotipica de aislamientos de Malassezia spp., de origen canino.

Phenotypic characterization of canine Malassezia spp., isolates

INTRODUCCION

Las levaduras del genero Malassezia son microorganismos que se encuentran como microbiota comensal en la piel de los seres humanos, y en la piel y el conducto auditivo externo de los caninos; sin embargo, bajo condiciones de humedad, sudoracion, obstruccion, desordenes en la queratinizacion e inmunosupresion, entre otros, pueden causar diferentes patologias (1-4). En caninos las principales enfermedades asociadas a estos microorganismos son otitis externa (OE) y dermatitis, siendo M. pachydermatis la especie mas frecuentemente reportada, aunque tambien se ha reportado a M. furfur en el conducto auditivo de pacientes con sintomatologia otica (5,6).

Los datos de prevalencia reportados para OE en caninos estan entre el 10-20% (7-9) y su diagnostico se realiza generalmente de acuerdo con el cuadro clinico que presenta el paciente, basados principalmente en los antecedentes y en algunos casos por hallazgos citologicos (7,10). El cultivo, considerado como la prueba de oro, no se constituye en una prueba de rutina; sin embargo, el apoyo del diagnostico microbiologico es fundamental para precisar la etiologia asociada a estos procesos, asi como para contribuir al conocimiento de la epidemiologia y clinica de esta patologia.

Por la condicion no lipido-dependiente de M. pachydermatis, a diferencia de las demas especies, esta tiene la capacidad de crecer en medios de cultivo sin suplementos lipidicos como agar Sabouraud (1,11-13). Los medios utilizados para el aislamiento de las especies lipidodependientes son el agar Dixon modificado y el Leeming & Notman que contienen tween, glicerol y acido oleico como fuentes lipidicas para el desarrollo de estas levaduras (11,12).

La identificacion hasta especie se realiza mediante caracterizacion morfologica macroscopica (tamano, color, textura, superficie y borde de las colonias), microscopica (micrometria), pruebas bioquimicas y fisiologicas como: catalasa, ureasa, [beta]-glucosidasa, crecimiento en agar Sabouraud sin suplementos lipidicos, asimilacion de tween y Cremophor-EL, evaluacion de la actividad fosfolipasa y produccion de pigmento en medios con triptofano como unica fuente de nitrogeno, asi como su crecimiento a 37[grados]C y 40[grados]C (2,12,13).

Dentro de las pruebas bioquimicas estan, la ureasa cuya reaccion positiva permite clasificar las levaduras del genero Malassezia dentro del filo Basidiomycota (14). La catalasa cuya reaccion negativa permite la diferenciacion de M. restricta de las demas especies del genero (3,4,12). Otras pruebas que se basan en la actividad enzimatica son la determinacion de fosfolipasa que hidroliza enlaces ester de glicerofosfolipidos (15,16) y la triptofano aminotransferasa (TAM 1) que se encarga de transaminar el triptofano para formar indol piruvato, que reacciona espontaneamente con moleculas del triptofano restante produciendo pigmento (17). Esta ultima enzima ha sido ampliamente estudiada en el hongo Ustilago maydis, por Zuther et al (18), quienes demostraron que los pigmentos indolicos producidos son identicos a los producidos por M. furfur, con lo que se puede sugerir que esta enzima podria estar involucrada en la produccion del pigmento en esta especie. Pruebas como la asimilacion de lipidos evaluan la capacidad de la levadura de metabolizar suplementos de mayor o menor complejidad estructural como tween 20, 40, 60, 80 y Cremophor-EL (3,12,13,19,20).

Adicionalmente, como pruebas fisiologicas, una condicion para el desarrollo de estas levaduras es la temperatura de crecimiento, con un optimo de 32[grados]C; sin embargo, algunas especies asociadas a patologias cutaneas en caninos pueden crecer a mayor temperatura, por ejemplo M. pachydermatis tiene la capacidad de crecer a 37[grados]C y 40[grados]C y M. furfur a 41[grados]C (12,21).

Teniendo en cuenta que para el diagnostico de la OE canina, no se ha establecido el cultivo como prueba de rutina, se propuso como objetivo identificar morfologica y bioquimicamente los aislamientos de Malassezia spp., obtenidos a partir de muestras de hisopados en caninos con otitis externa.

MATERIALES Y METODOS

Microorganismos. A partir de una coleccion de levaduras conservadas a -80[grados]C, obtenidas del canal auditivo de caninos con diagnostico clinico de OE, provenientes de cuatro clinicas veterinarias de Bogota, fueron caracterizados 105 aislamientos de Malassezia. Todos los resultados fueron comparados con las reacciones obtenidas para las cepas de referencia del "Centraal Bureau voor Schimmelcultures" (CBS): Malassezia furfur CBS 7019, Malassezia pachydermatis CBS 1879, Malassezia sympodialis CBS 7222, Malassezia slooffiae CBS 7956, Malassezia globosa CBS 7966. Las cepas control positivo para la prueba de actividad fosfolipasa fueron Candida albicans ATCC 90028, Candida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosis ATCC 22019.

Caracterizacion morfologica. Para la evaluacion de las caracteristicas morfologicas, los aislamientos fueron descongelados y reactivados en agar Dixon modificado (dos repiques) en incubacion a 32[grados]C durante 5-7 dias. Para la caracterizacion macroscopica se realizaron mediciones del diametro de 10 colonias aisladas en la estria de agotamiento. Adicionalmente, se describieron las caracteristicas de las colonias teniendo en cuenta el color, textura y los bordes. La evaluacion microscopica se realizo a partir de una suspension de levaduras, con un montaje en fresco y una tincion de Gram. Mediante micrometria se realizaron mediciones en dos direcciones (largo y ancho) de 30 levaduras por preparacion, con objetivo de 100X, se incluyeron levaduras sin gemacion y con gemacion, para las cuales se registro el tamano de la celula madre. Los datos obtenidos fueron multiplicados por el factor obtenido para el microscopio de trabajo (22).

Caracterizacion bioquimica y fisiologica. Se realizaron las pruebas bioquimicas y fisiologicas para la identificacion y caracterizacion de levaduras del genero Malassezia, como asimilacion de suplementos lipidicos (Cremophor-EL y Tween), pruebas enzimaticas como catalasa, ureasa, p-glucosidasa y fosfolipasa (2,3,12,15,16,19). Adicionalmente se determino la produccion de pigmento en medios de cultivo con triptofano como unica fuente de nitrogeno (23).

A excepcion de M. pachydermatis, las especies restantes del genero Malassezia utilizan lipidos como fuente de carbono. Por lo tanto, la asimilacion de suplementos lipidicos como Cremophor EL (Sigma--EE.UU.) y diferentes Tween 40 y 20 (Merck--Alemania); Tween 60 y 80 (Sigma--EE.UU.) fueron utilizados para definir las distintas especies. El crecimiento dependiente de la temperatura se evaluo a 37[grados]C y 40[grados]C.

Para la evaluacion de la actividad fosfolipasa, se utilizo agar Sabouraud con 10% (v/v) de yema de huevo, el medio fue inoculado de forma directa en cuatro puntos de la caja a partir de cultivos frescos e incubados a 32[grados]C durante 21 dias. Para determinar la actividad fosfolipasa se calculo el indice Pz, que equivale al valor resultante de la relacion del tamano de la colonia y el tamano de la colonia mas el halo de hidrolisis que se genera alrededor de la misma (15,16,24). Fue considerada actividad fosfolipasa nula cuando Pz=1, actividad fosfolipasa alta con valores Pz entre 0.64-0.99 y actividad fosfolipasa muy alta con Pz inferiores a 0.64 (15,24), la lectura se realizo al dia 21 promediando los valores Pz de los cuatro puntos de siembra.

Para la produccion de pigmento en medios con triptofano, se utilizo agar Dixon + 0.6% de L-trp (Sigma--USA)(23). Las cajas fueron incubadas a 32[grados]C durante 15 dias y la prueba fue considerada positiva al observarse la presencia de pigmento marron oscuro difundido en el medio.

Analisis estadistico. Los datos obtenidos a partir de la caracterizacion morfologica fueron registrados y analizados mediante estadistica descriptiva teniendo en cuenta medidas de tendencia central y de dispersion como media (X), desviacion estandar (DS) y coeficiente de variacion (CV), donde en esta ultima medida, un valor inferior al 15% fue considerado aceptable (25), indicando que los datos no presentaron amplia diferencia entre ellos.

RESULTADOS

Caracterizacion morfologica. Las caracteristicas macroscopicas para todos los aislamientos del genero Malassezia determinadas en el presente estudio se detallan en la tabla 1.

Los aislamientos descritos con caracteristicas variables corresponden a colonias con centro plano, brillantes y bordes lisos o irregulares, las cuales no permitieron una agrupacion con los otros patrones de descripcion.

La caracterizacion microscopica de los aislamientos clinicos no mostro diferencias entre las mediciones realizadas con tincion de Gram y el montaje en fresco, razon por la cual en la tabla 2, solo se presentan las mediciones con tincion de Gram.

Caracterizacion bioquimica. El metabolismo enzimatico frente a la prueba de la urea fue positivo para todas cepas de referencia CBS y para el 100% (n = 105) de los aislamientos (Tabla 3), lo que confirma su pertenencia al filo Basidiomycota (14). Los resultados de la caracterizacion bioquimica de los 105 aislamientos se resumen en la tabla 3; el perfil bioquimico permitio clasificar 38 aislamientos como M. pachydermatis, 8 aislamientos como M. furfur y los 59 restantes no pudieron ser clasificados a nivel de especie. En las tablas 1-3, se discrimina la caracterizacion morfologica y bioquimica para cada una de las especies identificadas.

DISCUSION

El analisis de los resultados de las diferentes pruebas permitio la identificacion del 36.19% (n=38) de los aislamientos como M. pachydermatis y el 7.62% (n=8) como M. furfur. El 56.19% (n = 59) de los aislamientos no pudieron ser clasificados a nivel de especie, dado que su perfil no coincidio con lo reportado en la literatura (11,14,19), ni con las reacciones que presentaron las cepas de referencia CBS.

Caracterizacion morfologica macroscopica y microscopica. La caracterizacion macroscopica de los aislamientos identificados como M. pachydermatis, en el 78.3% (n=29) (Tabla 1) mostro concordancia con las caracteristicas de las colonias reportadas por Torres et al (4), quienes describen colonias opacas de color crema, a veces umbilicadas y de tamano promedio de 4-5 mm (4), estos datos tambien coinciden con los reportes de Gueho-Kellermann et al (12) y Gueho et al (13), quienes describen bordes enteros o ligeramente ondulados. Sin embargo, se encontraron algunas diferencias con la cepa de referencia M. pachydermatis CBS 1879 las cuales presentan colonias opacas, convexas de color crema, con superficie lisa, bordes regulares y enteros con un tamano promedio de 4 mm (DS= 0.25% y CV= 6.45%).

En los aislamientos identificados como M. furfur, un primer grupo, 37.5% (n=3), coincidieron con la morfologia observada en la cepa de referencia M. furfur CBS 7019 y con las caracteristicas que Gueho et al (12,13) describieron para esta especie, colonias color crema, lisas, con elevacion central, bordes lisos o ligeramente lobulados (irregulares) y de tamano promedio de 5 mm (12); mientras las caracteristicas observadas en el segundo grupo, 37.5% (n=3) coinciden con lo reportado por Crespo et al. (3), quienes describieron colonias color crema, lisas o ligeramente rugosas que miden de 4-5mm (3). El grupo restante (25%), presento caracteristicas morfologicas macroscopicas variables que incluyen centro plano y bordes irregulares, coincidiendo parcialmente con algunos reportes (21).

Aunque los 59 aislamientos de Malassezia spp., comparten algunas caracteristicas macroscopicas con las especies M. furfur y/o M. pachydermatis, estos no fueron identificados hasta especie dado que los resultados de las pruebas bioquimicas presentaron patrones atipicos para estas dos especies (4,12).

La caracterizacion microscopica de los aislamientos identificados como M. pachydermatis, mostro celulas ovales y diferencias con respecto a las mediciones reportadas por Guillot et al (26), Dos Santos et al (21) y Gueho-Kellermann et al (12), quienes indicaron para esta especie celulas ovales con longitudes entre 4-5[micron]m y ancho de 2-2.5[micron]m (12,21,26), asi como lo observado para la cepa de referencia M. pachydermatis CBS 1879, cuyo tamano celular promedio fue de 4.1 [micron]m de longitud por 1.8 [micron]m de ancho.

Los aislamientos de M. furfur evidenciaron celulas ovales y cilindricas de diferentes tamanos, esta variabilidad de formas coincide con el pleomorfismo reportado para esta especie (3, 12, 21). Adicionalmente, Crespo et al (3) reportan tamanos promedio de 4-6 [micron]m, mientras Dos Santos et al (21) y Gueho-Kellermann et al (12) reportan longitudes hasta de 8 [micron]m y anchos de 1.5-3 [micron]m, rangos dentro de los que se encuentran las mediciones realizadas en el presente estudio. La longitud promedio para la cepa de referencia M. furfur CBS 7019, fue de 5.48 [micron]m de largo y de 2.0 [micron]m de ancho.

De la misma manera, la caracterizacion microscopica de los aislamientos determinados como Malassezia spp., mostro caracteres similares a los identificados como M. furfur y M. pachydermatis, en cuanto a variabilidad morfologica y tamano celular.

El analisis descriptivo de las medidas de las colonias y de las celulas permite determinar que sus tamanos no difieren entre especies y que incluso entre la misma especie se presentan caracteristicas morfologicas diferentes, por lo que los parametros morfometricos no permiten orientar la diferenciacion entre especies del genero Malassezia.

Caracterizacion bioquimica y fisiologica.

Frente a las pruebas de caracterizacion bioquimica y con respecto a la produccion de la enzima catalasa, todas las cepas de referencia CBS y el 100% de los aislamientos produjeron la enzima, lo que permitio inferir que ninguno de los aislamientos clinicos correspondio a M. restricta (4,3,12).

De los 38 aislamientos identificados como M. pachydermatis, solo 11 produjeron reaccion positiva para bilis esculina, dicha variabilidad en la produccion de la p-glucosidasa ha sido reportada para M. pachydermatis por Ashbee (2), Hossain et al (27) y Gueho-Kellermann et al (12). Esta actividad tambien se presento en tres de los aislamientos compatibles con M. furfur, lo que coincide con lo reportado por Mayser et al (19) y Gueho-Kellermann et al (12), quienes afirman que M. furfur es capaz de hidrolizar la esculina. De los 59 aislamientos reportados como Malassezia spp., 21 presentaron dicha actividad. Con esto es posible afirmar que la prueba de la hidrolisis de la esculina no es clasificatoria para la diferenciacion de las especies presentes en el estudio, como si lo es para especies como M. sympodialis que reacciona positivamente mientras M. slooffiae no lo hace (12).

Los 105 aislamientos evaluados presentaron diferentes caracteristicas de crecimiento en presencia de suplementos lipidicos como Cremophor-EL y Tween (20, 40, 60 y 80). Segun Mayser et al (19), la asimilacion del Cremophor-EL es una de las pruebas que diferencia a M. furfur de las demas especies, como se evidencio con la cepa de referencia M. furfur CBS 7019; siendo la unica que presento reaccion positiva; sin embargo, Ashbee (2), reporta variabilidad en este patron de asimilacion en las especies M. furfur y M. pachydermatis (2, 12); de igual forma, Hossain et al (27) en su estudio acerca de la variabilidad genetica de aislamientos de M. pachydermatis, reportaron la capacidad de asimilacion del Cremophor-EL en el 66% de los aislamientos estudiados. Con base en lo anterior, los resultados obtenidos podrian estar acordes con lo esperado para los aislamientos identificados como M. pachydermatis y M. furfur. En cuanto a la asimilacion de tweenes, Ashbee (2) y Gueho-Kellermann et al (12), indican que M. pachydermatis es capaz de asimilar Tween 20, como se observo en el 15.9% (n=6) de los aislamientos; sin embargo, en el 84.21% (n=32) y en la cepa de referencia CBS 1879 no hubo asimilacion, lo que concuerda con Torres et al (4) y Crespo et al (3).

Para los aislamientos de M. furfur, el 75% (n=6) asimilaron todos los Tweenes, lo que coincide con los reportes de Crespo et al (3), Torres et al (4), Gueho-Kellermann et al (12), asi como tambien lo hizo la cepa CBS 7019. Sin embargo, el 25% (n=2) de estos asimilaron solamente tween 40, 60 y 80, variacion reportada por Batra et al (28). Los aislamientos reportados como Malassezia spp., muestran diferentes patrones de asimilacion de suplementos lipidicos, por lo que fueron agrupados asi: Grupo A (n=7) asimilacion de Tween 20, 60 y 80; Grupo B (n=15) asimilacion de Tween 60 y 80; Grupo C (n=9) mayor variacion que no permitio agrupacion, incluso hubo un aislamiento que no asimilo ninguno de los suplementos, por lo que podria corresponder a la especie M. globosa, sin embargo, no se observaron las colonias cerebriformes caracteristicas de esta especie.

Con respecto al crecimiento en agar Sabouraud sin suplementos lipidicos, solo la cepa M. pachydermatis CBS 1879 mostro crecimiento, lo que coincide con lo reportado por diferentes autores, quienes describen que es la unica especie del genero que no presenta lipidodependiencia (12, 13). De igual manera, los aislamientos clinicos compatibles con M. pachydermatis crecieron en este medio de cultivo, lo que en asociacion con la asimilacion de todos los tweenes 40, 60 y 80, permiten su clasificacion en esta especie.

Con relacion a los aislamientos reportados como Malassezia spp., el 61% presentaron crecimiento en agar Sabouraud, lo que los podria catalogar como aislamientos atipicos de M. pachydermatis (12,13,26), aunque se debe tener en cuenta que Cafarchia et al (29), han reportado para esta especie genotipos lipodependientes y que posiblemente debido a los resultados de las demas pruebas, como la asimilacion del Cremophor-EL, no pudieron ser identificados con certeza como pertenecientes a esta especie.

La actividad fosfolipasa evidencio positividad en todas las cepas de referencia, siendo alta para M. pachydermatis CBS 1879 (Pz=0.62) y M. furfur CBS 7019 (Pz= 0.66), al igual que la mayoria de los aislamientos clinicos. Esta evidencia de actividad fosfolipasa, coincide con lo reportado por Cafarchia et al (15) y Pini & Faggi (16), quienes indican que esta enzima puede estar involucrada en la patogenesis ya que actua hidrolizando enlaces ester de los glicerofosfolipidos. Los fosfolipidos y las proteinas son los componentes principales de las membranas celulares del hospedero, asi pues, la actividad fosfolipasa induce la liberacion del acido araquidonico, que contribuye al proceso inflamatorio mediante la liberacion de varios metabolitos como prostaglandinas y leucotrienos e induciendo cambios en el pH cutaneo (12). Adicionalmente, contribuye al dano de las membranas de las celulas epiteliales del hospedero mediante la formacion de poros, favoreciendo la invasion del tejido (15). En los resultados del presente estudio, los aislamientos identificados como M. pachydermatis presentaron la mayor actividad fosfolipasa con respecto a los demas, lo que coincide con lo reportado en la literatura (15,16).

En cuanto a la produccion de pigmento en medios con triptofano, como unica fuente de nitrogeno, todos los aislamientos clinicos compatibles con M. furfur y la cepa de referencia M. furfur CBS 7019 fueron positivos para la prueba, formando colonias oscuras con pigmento marron difusible luego de 10-12 dias de incubacion. Estos resultados concuerdan con lo reportado por algunos autores (30), ya que la produccion de estos pigmentos permite la diferenciacion de M. furfur de las demas especies del genero. Sin embargo, de los 38 aislamientos compatibles con M. pachydermatis, 13 produjeron pigmento, en cinco de estos la pigmentacion marron observada en el medio fue ligera y los otros ocho produjeron pigmento con una intensidad diferente (Figura 1). Recientemente se ha reportado la capacidad de algunas cepas de M. pachydermatis para producir pigmento (27), Mayser et al (23), evaluaron la produccion de este en aislamientos de M. furfur, M. pachydermatis y M. sympodialis en dos medios de cultivo diferentes, el medio minimo (p-medium) y el agar Dixon con 0.6% de L-trp; todos los aislamientos de M. furfur produjeron pigmento en ambos medios, por el contrario, solo uno de los tres aislamientos de M. pachydermatis produjo pigmento leve en el medio Dixon con 0.6% de L- triptofano. De otro lado, en un estudio realizado por Hossain et al (27), se encontro que 84 aislamientos de M. pachydermatis de 210 evaluados, produjeron pigmento en intensidades variables y que la produccion del mismo puede verse asociada a variantes geneticas de las cepas (26), aspecto compatible con los resultados obtenidos en el presente estudio.

Fisiologicamente, ha sido reportada la capacidad de crecimiento de M. pachydermatis y M. furfur a 37[grados]C y 40[grados]C (13,26), aspectos confirmados con los aislamientos obtenidos, lo que permitio descartar la presencia de especies como M. obtusa, M. restricta y M. globosa que no crecen a 40[grados]C (12).

En conclusion, asociando las caracteristicas morfologicas y bioquimicas, el 36.19% (n=38) de los aislamientos fueron identificados como M. pachydermatis y el 7.62% (n=8) como M. furfur; sin embargo, para el 56.19% (n=59) de los aislamientos no se pudo definir la especie; aunque fue posible clasificarlos dentro del genero por presentar caracteristicas como la reaccion ureasa positiva y la morfologia propia del genero, los patrones fenotipicos atipicos de los aislamientos reportados como Malassezia spp., podrian corresponder a variantes de Malassezia furfur o Malassezia pachydermatis, lo que implica la necesidad de una aproximacion polifasica, incluyendo herramientas de biologia molecular, para la identificacion de especies y variantes presentes en el genero Malassezia.

Conflicto de intereses

Los autores no presentan conflicto de intereses. Agradecimientos

Pontificia Universidad Javeriana. Vicerrectoria de Investigacion. Apoyo a proyectos de investigacion para el fortalecimiento de grupos de investigacion ano 2011, ID PTA 00004585.

INTRODUCTION

Yeast of the genus Malassezia are found as commensal cutaneous microbiota in humans, as well as the external auditory canal in dogs. None the less, under humidity conditions, sweating, obstruction, keratinization disorders, and immunosupression, among others, they can cause diverse pathologies (1-4). In dogs the main diseases associated with these microorganisms are external otitis (EO) and dermatitis, with M. pachydermatis as the most frequent species reported. However, M. furfur has also been reported in patients with otic symptoms (5,6).

Prevalence of EO in dogs is between 10-20% (7-9), with its diagnosis based on clinical history or cytological findings (7,10). The gold standard assay is cell culture; however it is not a routine lab test. None the less, microbiological support is fundamental to define the etiology associated with these processes, as well as to contribute to epidemiology and clinical manifestations of this pathology.

In contrast to other species M. pachydermatis is a nonobligatory lipophylic. This yeast can grow in culture media devoid of lipids, such as Sabouraud's agar (1,11-13). Media utilized for obligatory lipophylic species isolation are modified Dixon agar and Leeming & Notman, containing Tween, glycerol, and oleic acid as lipid sources for yeast proliferation (11-12).

Malassezia spp. identification is performed by macroscopic morphological characterization of colony size, color, texture, surface, and margin. Microscopic measurements and biochemical and physiological findings confirm macroscopic findings. Among biochemical tests are catalase, [beta]-glucosidase, proliferation on Sabouraud's agar without lipid supplements, Tween and Cremophor-EL assimilation, phospholipase activity, and pigment production in media with tryptophan as only source of nitrogen. Last, temperature dependant growth is also evaluated at 37[degrees]C and 40[degrees]C (2,12,13).

Other biochemical tests include positive urea reaction, which allows classifying yeasts of the genus Malassezia within the phylum Basidiomycota (14). Furthermore, catalase negative reaction permits to distinguish M. restricta from all other species within the genus (3,4,12). Other assays based on enzyme activity are phospholipase, hydrolyzing specific ester bonds in glycerophospholipids (15,16). In addition, tryptophan aminotransferase (TAM 1), in charge of tryptophan transamination yielding indol pyruvate; reacts spontaneously with remaining tryptophan molecules producing pigment (17). This enzyme has been widely studied by Zuther et al (18), in the fungus Ustilago maydis. In their work they demonstrated generated indolic pigments are identical to those produced by M. furfur, suggesting this enzyme could be involved in pigment production. Last, lipid assimilation assays evaluate yeast capacity to metabolize supplements of greater or lesser structural complexity such as Tween 20, 40, 60, 80 and Cremophor EL (3,12,13,19,20).

Moreover, physiological tests comprise temperature dependent growth, with 32[degrees]C being an optimal temperature. However, some species associated with dog skin pathologies can develop at greater temperatures. As a case in point, M. pachydermatis has the capacity to grow at 37[degrees]C and 40[degrees]C. In addition, M. furfur can proliferate at 41[degrees]C (12,21).

Taking into account EO in dogs has not established cell culture as a routine test, the objective of this work was to identify morphologically and biochemically Malassezia spp. from swab samples in dogs with EO.

MATERIALS AND METHODS

Microorganisms. From collected yeast samples stored at -80[degrees]C obtained from auditory canals in dogs diagnosed with EO from four veterinary clinics in Bogota, 105 Malassezia isolates were characterized. All results were compared to reactions obtained from Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS) reference strains: Malassezia furfur CBS 7019, Malassezia pachydermatis CBS 1879, Malassezia sympodialis CBS 7222, Malassezia slooffiae CBS 7956, and Malassezia globosa CBS 7966. Additionally, phospholipase positive control strains were Candida albicans ATCC 90028, Candida krusei ATCC 6258, and Candida parapsilosis ATCC 22019.

Morphological characterization. For morphological evaluation the isolates were thawed and reactivated in modified Dixon agar (two picks) and incubated at 32[degrees]C for 5-7 days. Macroscopic analysis was based on colony diameter measured in 10 isolated colonies from streaked dilutions. In addition, morphological characterization was performed according to color, texture, and margin. Microscopic evaluation included Gram stain performed from a fresh yeast suspension, to determine length and width ([micro]m). Yeast without budding and with budding were included, for which the parent cell size was registered. Measurements in 30 yeast preparations were carried out by micrometry on both directions: length and width at 100 X (22).

Biochemical and physiological characterization.

Biochemical and physiological tests were carried out to identify and characterize yeast from the genus Malassezia including enzymatic activities for catalase, urease, [beta]-glucosidase, and phospholipase (2,3,12,15,16,19). In addition, pigment production in media with tryptophan as only source of nitrogen was also performed (23).

Except for M. pachydermatis, the remaining species in the Malassezia genus use lipids as a carbon source. Thus, lipid supplement assimilation in Cremophor EL (Sigma--USA) and different Tween 40 and 20 (Merck--Germany); Tween 60 and 80 (Sigma--USA) was used to define distinct species. Last, temperature dependant growth was also evaluated at 37[degrees]C and 40[degrees]C.

For phospholipase activity Sabouraud's agar was ammended with 10% egg yolk. The medium was inoculated from fresh cultures directly at four different points in the Petri dish, and incubated at 32[degrees]C for 21 days. To determine phospholipase activity the ratio of colony diameter to diameter of the dense white zone of precipitation around phospholipase positive colonies (Pz value) was used (15,16,24). No phospholipase activity was considered for a Pz value of 1 (Pz=1). High between 0.64-0.99, and very high for Pz values less than 0.64 (15,24). Reading was performed after three weeks of culture averaging Pz values from the four different points of seeding.

For pigment production in media with tryptophan we employed Dixon agar with 0.6% L-trp. (Sigma --USA) (23). Petri plates were incubated at 32[degrees]C for 15 days, and the assay was positive if a brown diffusing stain was present on the media.

Statistical analysis. Data obtained from morphological analysis were analyzed with descriptive statistics taking into account central tendency and dispersion as a mean (X) and standard deviation (SD) and variation coefficient (VC), with values less than 15% considered acceptable (25), indicating data did not show large differences between them.

RESULTS

Morphological characterization. All morphological characteristics performed in this study are detailed in table 1. Colonies with flat elevation, shiny and entire or undulate margins presented variability within the characterization, thus we were unable to group them according to pattern description.

Clinical isolate microscopic characterization did not demonstrate any difference among measurements with Gram stain and fresh yeast suspension, hence only Gram stain measurements are presented in table 2.

Biochemical characterization. Positive urease activity for all CBS referenced strains and for 100% (n=105) isolates (Table 3) confirms their classification in the Basidiomycota phylum (14). Biochemical characterization is summarized in table 3. Based on the biochemical profile 38 isolates corresponded to M. pachydermatis, 8 to M. furfur, and the remaining 59 could not be classified to the species level. Tables 1-3 describe morphological and biochemical characterization in detail for each species identified.

DISCUSSION

After test analysis for morphological, biochemical, and physiological characterization, 36.19% (n=38) isolates were identified as M. pachydermatis and 7.62 % (n=8) as M. furfur. The remaining 56.19% (n=59) isolates could not be identified at the species level, given the profiles did not coincide with those reported in the literature (11,14, 19), nor with reactions presented for CBS reference strains.

Morphological, macroscopic, and microscopic characterization. According to macroscopic characterization based on reports by Torres et al (4), 78.3% (n=29) (Table 1) of isolates obtained from dogs in the clinic were identified as M. pachydermatis, they described opaque witish colonies, sometimes umbilicated with an average size of 4-5 mm (4). These results also agree with those reported by Gueho-Kellermann et al (12) and Gueho et al (13), who defined entire margins or slightly undulated. None the less, some differences were established with the reference strain M. pachydermatis CBS 1879, presenting opaque colonies, convex, witish with smooth surface with entire margins with an average size of 4 [+ or -] 1mm (VC = 6.45%).

In a first group identified as M. furfur, 37.5% (n=3) coincided with the morphology observed in M. furfur CBS 7019, with characteristics described by Gueho et al (12,13) for this species: witish colonies, smooth, with umbonate elevation, entire margins or slightly irregular with an average size of 5 mm (12). In contrast, the second group 37.5% (n=3) agrees with reports from Crespo et al (3), who described witish colonies, smooth or slightly rough with a 4-5 mm diameter (3). The remaining 25% presented variable macroscopic characteristics including flat elevation, undulate margins, corresponding partially to some reports (21).

Although 59 Malassezia spp., isolates shared some macroscopic features with M. furfur and/or M. pachydermatis, these were insufficient to characterize them up to species level, since biochemical tests presented atypical patterns for these two species (4,12).

Microscopic characterization of isolates identified as M. pachydermatis, evidenced oval cells and differences in measurements as compared to reports by Guillot et al (26), Dos Santos et al (21), and Gueho-Kellermann et al (12), who described for this species oval cells with lengths between 4-5 pm and widths between 2-2.5 [micro]m (12,21,26), as observed for the reference strain M. pachydermatis CBS 1879, with a mean cell length of 4.1 [micro]m and 1.8 [micro]m for cell width.

M. furfur isolates evidenced oval and cylindrical shaped cells of different sizes. This variability in shape concurs with pleomorphism reported for this species (3,12,21). Additionally, Crespo et al (3) reported average sizes of 4-6 [micro]m. However, Dos Santos et al (21), and Gueho-Kellermann et al (12) reported lengths up to 8 [micro]m and widths of 1.5-3 [micro]m, agreeing with the results here obtained. The average length for the reference strain M. furfur CBS 7019, was 5.48 [micro]m and an average width of 2.0 [micro]m.

Likewise, Malassezia spp., isolates microscopic characterization demonstrated attributes similar to those identified in M. furfur and M. pachydermatis in terms of morphological variability and cell size.

Colony measurement descriptive analysis suggests their sizes did not differ between species. Due to contrasting morphological characteristics present within species, morphometric parameters cannot be used as a guide to define distinct species within the Malassezia genus.

Biochemical and physiological characterization. According to biochemical characterization, catalase test was positive for all CBS reference strains and 100% isolates. This allowed inferring none of the clinical isolates was M. restricta (3,4,12).

Out of the 38 clinical isolates identified as M. pachydermatis, only 11 were positive for bile esculine. This variability in [beta]-glucosidase production has been reported for M. pachydermatis by Ashbee (2), Hossain et al (27), and Gueho-Kellermann et al (12). This activity was also present for three M. furfur isolates, in agreement with reports from Mayser et al (19) and Gueho-Kellermann et al (12), who describe M. furfur is capable of hydrolyzing esculine. Out of the remaining 59 Malassezia spp. samples, 21 were positive for bile esculine. This results confirm in this study esculine hydrolysis cannot be used to distinguish differences among species. In contrast, it can be used to distinguish between M. sympodialis andM. slooffiae, with the first one being positive for bile esculine (12).

The 105 evaluated isolates had different growth characteristics in presence of Cremophor EL and Tween 20, 40, 60, and 80, lipid supplements. According to Mayser et al (19), Cremophor EL is a test distinguishing M. furfur from other species. In this study, it was evidenced M. furfur CBS 7019 was the only reference species that had a positive reaction. None the less, Ashbee (2) and Gueho-Kellermann et al (12) described variability in assimilation pattern for M. furfur and M. pachydermatis. In a study evaluating genetic variability, Hossain et al (27) confirmed Cremophor EL in 66% of the isolates studied. Based on these reports, the data here presented can be classified as M. pachydermatis and M. furfur.

With respect to Tween assimilation Ashbee (2) and Gueho-Kellermann et al (12) proved M. pachydermatis is capable of Tween 20 assimilation, as was observed in 15.79% (n=6) of our isolates. However, 84.21% (n=32) and reference strain CBS 1879 did not assimilate Tween 20, as exemplified by Torres et al (4), and Crespo et al (3).

For M. furfur isolates, 75% (n=6) assimilated all Tweens, as reported by Crespo et al (3), Torres et al (4), and Gueho-Kellermann et al (12). In addition, CBS 7019 reference strain was also capable of assimilating all Tweens. Never the less, 25% (n = 2) assimilated only Tween 40, 60, and 80, a variation reported by Batra et al (28). Malassezia spp. exhibited different lipid supplement assimilation patterns. Therefore, they were grouped as follows: Group A (n=7) Tween 20, 60, and 80 assimilation; Group B (n = 15) Tween 60 and 80 assimilation; Group C (n=9) due to increased variability it was not possible to classify. One of the isolates was unable to assimilate any Tween, thus it could correspond to M. globosa, however we did not observe the characteristic cerebriform colony morphology for this species.

The only species that did not present growth on Sabouraud's agar without lipid supplements was M. pachydermatis CBS 1879. This has been reported by different authors describing M. pachydermatis as the only nonbligatory lipohylic species within the genus (12,13). Likewise, clinical isolates compatible with M. pachydermatis grew on Sabouraud's agar. In addition, due to all Tween assimilation or Tween 40, 60, and 80 assimilation it was possibly to classify them as M. pachydermatis.

In regards to Malassezia spp. 61% could grow on Sabouraud's agar, classifying them as atypical M. pachydermatis (12,13,26), although it should be taken into account that Cafarchia et al (29) reported lipodependent phenotypes for this species. In addition to other test results, such as Cremophor EL assimilation it was not possible to identify as M. pachydermatis with certainty.

Phospholipase activity was positive for all reference strains. Highest values were observed for M. furfur CBS 7019 (Pz = 0.66) and M. pachydermatis CBS 1879 (Pz=0.62), in addition to all clinically isolated samples. Evidence of phospholipase activity coincides with results reported by Cafarchia et al (15) and Pini and Faggi (16), who illustrate this enzyme can be involved in pathogenesis, since it acts by hydrolyzing glycerophospholipid ester bonds. Phospholipids and proteins are important host's plasma membrane compounds. Thus, phospholipase activity induces arachidonic acid liberation, contributing to the inflammatory process through prostaglandin and leukotriene production, resulting in skin pH changes (12). Moreover, it contributes to host epithelial cell membrane disruption through pores formation, favoring tissue colonization (15). Results in this study evidenced M. pachydermatis had the highest phosphatase activity compared to other groups, in agreement with other reports in the literature (15,16).

All clinical isolates as well as M. furfur and M. furfur CBS 7019 reference strain were positive for pigment production in media with tryptophan, as the only nitrogen source. Data in this study corroborate results described by Lang et al (30). Colonies cultured in this media formed dark colonies with diffusible brown pigment after 10-12 days of incubation. Similar results have been reported in the literature, since these pigments allow differentiating M. furfur from other species in this genus. However, out of the 38 isolates characterized as M. pachydermatis, 13 produced pigment, five had a faint brown pigmentation in the middle, and eight produced pigment at a different intensity (Figure 1). Recently, it has been reported some M. pachydermatis strains produce pigment (27). Mayser et al (23), evaluated pigment production in M. furfur, M. pachydermatis, and M. sympodialis in different culture media: minimum medium (p-medium) and Dixon agar supplemented with 0.6% L-trp. All M. furfur isolates produced pigment in both media; on the contrary, only one of the M. pachydermatis isolates produced slight pigment in Dixon agar with 0.6% L- trp. Furthermore, in a study carried out by Hossain et al (27), it was observed that 84 M. pachydermatis isolates out of 210 evaluated, produced pigments at variable intensities. In addition, pigment production can be associated with strain genetic variations (26), as observed in this study.

Under physiological conditions M. pachydermatis and M. furfur can proliferate at 37[degrees]C and 40[degrees]C (13,26). These results permitted to discriminate the presence of species such as M. obtusa, M. restricta, and M. globosa uncapable of growing at 40[degrees]C (12).

In conclusion, morphological and biochemical characteristics permitted to identify 36.19% (n=38) of all isolates as M. pachydermatis and 7.62% (n=8) as M. furfur. However, 56.19% (n = 59) could not be defined as a specific species. Although it was feasible to classify them within the Malassezia genus based on positive urease activity and morphology; the atypical phenotypical traits of isolates reported as Malassezia spp. could correspond to Malassezia furfur or M. pachydermatis variants. Therefore, a polyphasic strategy incorporating molecular biology tools is required to identify variants within the Malassezia genus.

Conflict of interest

The authors report no conflict of interest.

Acknowledgements

This project was funded by Vicerrectoria de Investigacion at Pontificia Universidad Javeriana, grant for research group strengthening 2011, ID PTA 00004585.

REFERENCES

(1.) Cafarchia C, Gallo S, Romito D, Capelli G, Otranto D. New insights into the Diagnosis and the Pathogenicity of Malassezia Yeasts. Vet Res commun 2006; 30:231-234.

(2.) Ashbee H. Update on the genus Malassezia. Med Mycol 2007; 45:287-303.

(3.) Crespo V, Crespo M, Gomez E. Diagnostico de laboratorio de las levaduras del genero Malassezia. Piel 2008; 23(10):570-576.

(4.) Torres E, Arenas R, Atoche-Dieguez C. Infecciones causadas por el genero Malassezia. Med Cutan Iber Lat Am 2008; 36(6):265-284.

(5.) Cafarchia C, Gallo S, Capelli G, Otranto D. Occurrence and population size of Malassezia spp. in the external ear canal of dogs and cats both healthy and with otitis. Mycopathologia 2005; 160(2):143-149.

(6.) Khosravi A, Eidi S, Ziglari T, Bayat M. Isolation and differentiation of Malassezia species isolated from healthy and affected small animals, ear and skin. World J Zool 2008; 3(2):77-80.

(7.) Angus J. Otic cytology in health and disease. Vet Clin Small Anim 2004; 34(2):411-424.

(8.) Saridomichelakis M, Farmakit R, Leonidas S, Koutinas A. Aetiology of canine otitis externa: a retrospective study of 100 cases. Vet Dermatol 2007; 18(5):341-347.

(9.) Zur G, Lifshitz B, Bdolah-Abram T. The association between the signalment, common causes of canine otitis externa and pathogens. J Small Anim Pract 2011; 52(2):254-258.

(10.) Ginel P, Lucena R, Rodriguez J, Ortega J. A semiquantitative cytological evaluation of normal and pathological samples from the external ear canals of dogs and cats. Vet Dermatol 2002; 13(3):151-156.

(11.) Guillot J, Breugnot C, De Barros M, Chermette R. Usefulness of modified Dixon's medium for quantitative culture of Malassezia species from canine skin. J Vet Diagn Invest 1998; 10:384-386

(12.) Gueho-Kellermann E, Boekhout T, Begerow D. Biodiversity, Phylogeny and Ultrastructure. In: Boekhout T, Gueho E, Mayser P, Velegraki A. Malassezia and the skin. Science and Clinical Practice, Germany: Springer-Verlag; 2010.

(13.) Gueho E, Batra R, Boekhout T. Malassezia Baillon (1889). In: Kurtzman CP, Fell JW, Boekhout T The Yeast a taxonomic study. New York: Elsevier; 2011.

(14.) Guarro G, Gene J, Stchigel A. Developments in Fungal Taxonomy. Clin Microbiol Rev 1999; 12(3):454-500.

(15.) Cafarchia C, Otranto D. Association between phospholipase production by Malassezia pachydermatis and skin lesions. J Clin Microbiol 2004; 42(10):4868-4869.

(16.) Pini G, Faggi E. Extracellular phospholipase activity of Malassezia strains isolated from individuals with and without dermatological disease. Rev Iberoam Micol 2011; 28(4):179-182.

(17.) Barchmann T, Hort W, Kramer H, Mayser P. Glycine as a regulator of tryptophan-dependent synthesis in Malassezia furfur. Mycoses 2009; 54(1):17-22.

(18.) Zuther K, Mayser P, Hettwer U, Wu W, Kindler B, Karlovsky P, et al. The tryptophan aminotransferase Tam1 catalyses the single biosynthetic step for tryptophan-dependent pigment synthesis in Ustilago maydis. Mol Microbiol 2008; 68(1):152-172.

(19.) Mayser P, Haze P, Papavassilis C, Pickel M, Gruender K, Gueho E. Differentiation of Malassezia species: selectivity of CremophorEL, castor oil and ricinoleic acid for M. furfur. Brit J Dermatol 1997; 137(2), 208-213.

(20.) Kindo AJ, Sophia SKC, Kalyani J, Anandan S. Identification of Malassezia species. Indian J Med Microbi 2004; 22(3):179-181.

(21.) Dos Santos F, Werner S, Pagani B, Dos Santos J. Reclassificacao taxonomica de especies do genero Malassezia: revisao da literatura sobre as implicacoes clinicolaboratoriais. J Bras Patol Med Lab 2002; 38(3):199-204.

(22.) Del Rio J, Auladell C, Ribes E, Sagrista M, Amor M. Practiques de citologia. Ed.1. Espana: Editorial Universitat de Barcelona. 2005.

(23.) Mayser P, Wille G, Imkampe A, Thoma W. Synthesis of fluorochromes and pigments is Malassezia by use of tryptophan as the single nitrogen source. Mycoses 1998; 41(7-8):265-271.

(24.) Coutinho S. Malassezia pachydermatis: enzymes production in isolates from external ear canal of dogs with and without otitis. Arq Bras Med Vet Zootec 2005; 57(2):149-153.

(25.) Alvarez R. Estadistica aplicada a las ciencias de la salud. Espana: Ediciones Diaz de Santos; 2007.

(26.) Guillot J, Gueho E, Lesourd M, Midgley G, Chevrier G, Dupont B. Identification of Malassezia species: A practical approach. J Medl Mycol 1996; 6(3):103-110.

(27.) Hossain H, Landgraf V, Weiss R, Mann M, Hayatpour J, Chakraborty T, et al. Genetic and Biochemical characterization of Malassezia pachydermatis with particular attention to pigment-producing subgroups. Med Mycol 2007; 45(1):41-49.

(28.) Batra R, Boekhout T, Gueho E, Cabanes J, Dawson T, Gupta A. Malassezia Baillon, emerging Clinical Yeasts. FEMS Yeast Research 2005; 5(12): 1101-1113.

(29.) Cafarchia C, Latrofaa MF, Testinia G, Parisib A, Guillot J, Gasserd RB, et al. Molecular characterization of Malassezia isolates from dogs using three distinct genetic markers in nuclear DNA. Mol Cell Probe 2007; 21(3):229-238

(30.) Lang S, Hort W, Mayser P. Differentially expressed genes associated with tryptophan-dependent pigment synthesis in Malassezia furfur a comparison with the recently published genome of Malassezia globosa. Mycoses 2009; 54(4):e59-e83.

DOI:10.21897/rmvz.827

Angelica Hurtado-Suarez, [1] Bact, Adriana Pulido-Villamarin, [1] * M.Sc, Melva Linares-Linares, [1] M.Sc, Leidy Suarez-Fernandez, [1] Bact, Rubiela Castaneda-Salazar, [1] M.Sc, Maria Rodriguez-Bocanegra, [1] Ph.D.

Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiologia. Unidad de Investigaciones Agropecuarias (UNIDIA). Linea de Epidemiologia y Salud Animal. Carrera 7a No. 42-83. Ed 52 Of. 608. Bogota- Colombia. Correspondence: adriana.pulido@javeriana.edu.co

Received: August 2015; Accepted: February 2016.

Leyenda: Figure 1. Canine Malassezia phospholipase activity. A Very high activity. B High activity. C No activity.
Table 1. Canine Malassezia colonies macroscopic
characterization.

Species                               Morphology variables

                      CRS        CSR       CV          SM          VC

Total                43.80%    34.30%    21.90%       4.33        6.59
  isolates before    (n=46)    (n=36)    (n=23)   [+ or -] 0.34
  identification

M. pachydermatis     47.36%    28.95%    23.67%       4.90        6.85
  (n=38)             (n=18)    (n=11)    (n=9)    [+ or -] 0.28

M. furfur (n=8)      37.50%    37.50%    25.00%       4.80        6.41
                     (n=3)     (n = 3)   (n=2)    [+ or -] 0.28

Malassezia spp.      42.37%     37.29    20.33        4.34        6.53
  (n=59)             (n=25)    (n=22)    (n=12)   [+ or -] 0.40

CRS= Whitish colonies, rough surface, umbonate elevation, and
undulated margins; CSR= Whitish colonies, slightly rough surface or
smooth, umbonate elevation entire margins to slightly undulated; CV=
Colonies with variable characteristics; VC=Variation Coefficient (%);
SM= Size (mm) Mean [+ or -] SD

Table 2. Cell morphometric characterization obtained
from canine Malassezia isolates.

Species                          Parent cell Gram stain

                          LM           VC           WM           VC

Total isolates    3.29 [+ or -] 0.18  1.00  1.82 [+ or -] 0.16  1.32
  before
  identification

M. pachydermatis  3.27 [+ or -] 0.15  4.63  1.78 [+ or -] 0.24  1.37
  (n=38)

M. furfur (n=8)   3.33 [+ or -] 0.28  8.47  1.88 [+ or -] 0.25  1.05

Malassezia spp.   3.29 [+ or -] 0.18  5.38  1.83 [+ or -] 0.25  1.37
  (n=59)

LM= Length ([micro]m) Mean [+ or -] SD; VC=Variation coefficient (%);
WM= Width ([micro]m) Mean [+ or -] SD

Table 3. Canine Malassezia isolates biochemical characterization.

Biochemical test           Positive %      M. pachydermatis
                            (N=105)             (n=38)

Urease                    100 (n=105)            n=38
Catalase                  14.3 (n=15)             n=3
Weak Catalase             85.7 (n=90)            n=35
[beta]-Glucosidase        33.3 (n=35)            n=11
Tween 20-40-60 y 80        19 (n=20)              n=6
  assimilation
Tween 40, 60 y 80         51.4 (n=54)            n=32
  assimilation
Cremophor-EL              34.3 (n=36)             n=4
  assimilation
Sabouraud's agar          70.5 (n=74)            n=38
  growth
Growth at 37[degrres]C    100 (n=105)            n=38
Growth at 40[degrres]C    100 (n=105)            n=38
                          66.7 (n=69)            n=28
Phospholipase activity     High n=54          High: n=21
                         Very High n=15      Very High n=7
Pigment production        40.95 (n=43)      Positive (n=8)
  in media                                Weak Positive (n=5)
  with tryptophan

Biochemical test           M. furfur        Malassezia spp.
                             (n=8)              (n=59)

Urease                        n=8                n=59
Catalase                      n=3                 n=9
Weak Catalase                 n=5                n=50
[beta]-Glucosidase            n=3                n=21
Tween 20-40-60 y 80           n=6                 n=8
  assimilation
Tween 40, 60 y 80             n=2                n=20
  assimilation
Cremophor-EL                  n=8                n=24
  assimilation
Sabouraud's agar               --                n=36
  growth
Growth at 37[degrres]C        n=8                n=59
Growth at 40[degrres]C        n=8                n=59
                              n=6                n=35
Phospholipase activity     High: n=6          High: n=27
                                             Very High n=8
Pigment production       Positive (n=8)     Positive (n=13)
  in media                                Weak Positive (n=9)
  with tryptophan

High Phospholipase activity: Pz 0.64-0.99. Very High
Phospholipase activity: Pz <0.64
COPYRIGHT 2016 Universidad de Cordoba
No portion of this article can be reproduced without the express written permission from the copyright holder.
Copyright 2016 Gale, Cengage Learning. All rights reserved.

Article Details
Printer friendly Cite/link Email Feedback
Title Annotation:ORIGINAL
Author:Hurtado-Suarez, Angelica; Pulido-Villamarin, Adriana; Linares-Linares, Melva; Suarez-Fernandez, Leid
Publication:Revista MVZ (Medicina Veterinaria y Zootecnia)
Date:Sep 1, 2016
Words:8128
Previous Article:Megalops atlanticus (Megalopidae), un nuevo pez en el oceano Pacifico; informacion sobre su importancia pesquera.
Next Article:Estimacion de la diversidad genetica de Anadara tuberculosa en cinco manglares de Tumaco, utilizando la enzima citocromo oxidasa I.

Terms of use | Privacy policy | Copyright © 2019 Farlex, Inc. | Feedback | For webmasters