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Caracterizacion electroforetica de proteinas de la "paja amarilla" (Sorghastrum setosum) incubada en rumen de bovinos.

INTRODUCCION

Las proteinas individuales que componen el total del proteoma de una planta en particular pueden ser separadas en geles de electroforesis, los cuales proporcion ademas el numero y la cantidad relativa de la proteina en estudio (7). La electroforesis discontinua SDS-PAGE es considerada como una herramienta de gran utilidad para estudios taxonomicos y geneticos en vegetales. Sin embargo su aplicacion es limitada ya que se han observado, para algunas variedades, patrones electroforeticos heterogeneos en cuanto al numero e intensidad de las bandas.

La proteina cruda es la fraccion del forraje o alimento que esta compuesta por una multitud de protidos que difieren en la composicion y secuencia de aminoacidos, asi como por sus estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias. Tales caracteristicas pueden ayudar a aclarar la variacion de la degradacion ruminal (17). Las estructuras terciarias y secundarias probablemente afecten la tasa y extension de la hidrolisis ruminal evidenciable mediante la tecnica de electroforesis, razon por la cual la proteina del forraje podria ser cuantificada usando la electroforesis y densitometria (18). La desaparicion de la proteina durante la incubacion ruminal tambien seria monitoreable cuantitativamente usando electroforesis (10), lo que facilitaria la formulacion de dietas basadas en las proteinas metabolizables y absorbibles (21).

La tecnica SDS-PAGE es la mas usada para separar y caracterizar proteinas para estimar el grado de diversidad genetica (28). Se demostro que esta tecnica es confiable porque la proteina de almacenaje es en gran parte independiente de fluctuaciones ambientales (4, 28). La electroforesis se emplea en muchos estudios para clasificar y evaluar la variabilidad genetica, asi como para comparar las variaciones de los monomeros que caracterizan a los genes que cifran varias proteinas. Se la utilizo en estudios sobre especies como: Amaranthus (14), sorgo (20), sesamo (15).

En cultivos de tomates y calabazas la electroforesis de las hojas se utilizo para evaluar la variabilidad genetica y caracterizar la proteina cruda en Lyncopersicon y Trichosanthes (3). Mediante esta tecnica, se puedo diferenciar la diversidad genetica en la especie Leucaena (29) y se caracterizaron las fracciones de proteinas de las hojas de Panicum virgatum, Andropogon gerardii y Bromus inermis, que no fueron degradadas en rumen; el analisis de los geles indico tres fracciones de 24, 26 y 56 kDa. Especies de gramineas [C.sub.4] tienen ciertas fracciones de proteinas que les permiten permanecer por mas tiempo sin ser degradadas en el rumen (24).

La tecnica SDS-PAGE permitio la identificacion de varios cultivares de cereales, diversas pasturas y otros vegetales (22). En semillas de girasol se determino cuantitativamente la presencia de cinco polipeptidos principales (26). Tambien se caracterizaron gluteinas de alto peso molecular en gluten de trigo en cultivares de Uruguay (8); se realizo la caracterizacion proteomica del grano de frijol azufrado (5) y se evaluaron las proteinas de semillas del genero Passiflora L. Passifloraceae (23).

Analisis electroforeticos de material aislado de Lupinus por SDS-PAGE, muestran bandas entre 14,4 y 66,2 kDa, que serian proteinas que estarian mayoritariamente representadas por globulinas (12). Las globulinas son una clase de proteinas muy heterogeneas, clasificadas como alfa, beta, gama y conglutina (27). En investigaciones realizadas en proteinas de L. angustifolius y L. albus, se observo la presencia de una beta conglutinina, compuesta de monomeros de PM que oscilaron entre 17 y 64 kDa (9).

El objetivo del presente trabajo fue realizar la caracterizacion por electroforesis de las fracciones proteicas de Sorghastrum setosum (paja amarilla) del nordeste argentino, durante la incubacion ruminal en bovinos.

MATERIAL Y METODOS

El material vegetal evaluado fue recolectado en un campo del nordeste argentino (latitud sur 27[grados 10'; longitud oeste 58[grados] 57'). Las muestras de S. setosum fueron tomadas por medio de cortes con tijeras a 10 cm de altura de todo el material disponible en condicion de pastoreo, dentro de un marco de 50 x 50 cm. El metodo utilizado fue el de exclusion del pastoreo por medio de alambrado perimetral, con cortes a los 15, 30 y 45 dias del corte de limpieza, en cada una de las estaciones del ano. Las muestras del pasto, se colocaron en bolsas de papel limpias y puestas a secar en estufa de aire forzado a 55 [grados]C durante 48 a 72 h y luego molidas en molino de cuchillas con mallas de 2 mm.

Para la incubacion ruminal, se utilizo la tecnica de suspension in situ de bolsas de dacron, en dos novillos cruza cebu de 550 kg PV provistos de fistula ruminal, que fueron mantenidos en potreros con pastura natural. Los animales recibieron ad libitum un suplemento mineral que contenia 12% Ca, 8% P y microelementos vehiculizados en sal comun. En cada bolsa, de 9,5 x 18 cm, con una porosidad de 50 um, se colocaron 5 g de material seco de la pastura, que fueron introducidas en el rumen en forma secuencial en los siguientes tiempos: 120; 72; 48; 24; 12; 6; 3 y 0 horas. Luego del tiempo de incubacion correspondiente, las bolsas fueron retiradas del rumen y sumergidas en agua fria por 5 min, despues lavadas bajo agua corriente y por ultimo secadas en estufa a 60 [grados]C durante 72 h. Tambien fueron pesadas.

Con el fin de evaluar las fracciones proteicas de la pastura en estudio, se tomaron 1-3 g de material seco y se mezclaron con 50 ml de acetona enfriada a 4 [grados]C, luego se filtro por Buchner y lavo con acetona hasta decoloracion total del residuo. El residuo acetonico fue secado en estufa al vacio a 30 [grados]C, obteniendose asi el polvo acetonico. La extraccion de proteinas se llevo a cabo pesando 0.3 g del polvo acetonico anteriormente preparado y poniendolo en contacto con 25 ml de buffer Tris pH 8 (Tris 100 mM, EDTA 1 mM, PVPP 0,6 mg/100 ml), al que se le adicionaron 200 [micron]l del inhibidor de proteasas fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMFS) 1 mM.

La mezcla se mantuvo 3 h en agitacion a temperaturas inferiores a 10 [grados]C y luego se centrifugo durante 15 min a 13500 rpm en una centrifuga refrigerada. Se filtro por gasa y al sobrenadante se le adicionaron 4 g de acido tricloroacetico, dejandolo en contacto durante 30 min a 10 [grados]C con agitacion constante. Luego el residuo se centrifugo 10 min a 13500 rpm y el precipitado se lavo 2 veces con 10 ml de acido tricloroacetico al 1% y 3 veces con acetona al 80%, antes de secarlo en desecador durante 24 h. Las proteinas presentes en los residuos acetonicos fueron solubilizadas en el buffer Tris de pH 8 y cuantificadas por el metodo de Lowry. Todas las determinaciones se efectuaron por triplicado. Se utilizaron geles desnaturalizantes SDS-PAGE, segun protocolo anteriormente descrito (16).

El precipitado obtenido en la etapa de extraccion se disolvio en 200 pl de buffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, SDS 1%, mercaptoetanol 5%, glicerol 40%, azul de bromofenol 0,02%, pH 8-9). Las muestras se sonicaron durante 10 min y se calentaron a ebullicion durante 1 min, previo a la siembra en el gel de "stacking" a razon de 20 [micron]l de muestra por calle. Para las corridas se utilizo el sistema de electroforesis vertical (Bio-Rad Mini-Protean II, Hercules, California, USA), empleando un gel concentrador de 4% de acrilamida y un gel de separacion con 1 % de acrilamida.

Debido a que la mayoria de las proteinas vegetales contienen mas aminoacidos de tipo acido (acidos aspartico y glutamico) que basico (lisina y arginina), los puntos isoelectricos de la mayoria de ellas se encuentran en un pH menor a 7, por ello la solubilidad generalmente es mayor en la zona alcalina, razon por la cual se uso buffer de pH > 8 para solubilizar las proteinas de las distintas muestras.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Las corridas se realizaron a 25 mAmp a temperatura ambiente, hasta la salida del frente de avance de los colorantes. Para la fijacion de los geles se uso una solucion de isopropanol 25% y acido acetico glacial 10% durante 30 min. Para la tincion se utilizo una solucion de Coomasie Brilliant Blue R-250 al 0,02% durante 24 h y la decoloracion de los geles se efectuo con una solucion de alcohol metilico 25% y acido acetico glacial 10%. Se utilizo un kit Sigma de patrones de referencia (Dalton Mark VII-L Standard Mixture) con un rango de PM de 14 000 a 70 000 Da. Los geles de poliacrilamida fueron escaneados con una impresora HP 4200 y analizados por medio del software para analisis de geles 2 WinXGel 1.8.

Para determinar el peso molecular de las proteinas separadas por electroforesis, se determinaron los valores de la distancia recorrida por cada una de las bandas (Rf) utilizando el software mencionado anteriormente y se calcularon segun la ecuacion obtenida para los patrones de pesos moleculares (Figura 1).

RESULTADOS Y DISCUSION

En el analisis cualitativo realizado mediante electroforesis por SDS-PAGE (Figura 2) a la hora cero, se encontraron proteinas de alto PM: 87; 64; 58; 55; 51; 47; 46; 44; 42; 27 y 14 kDa. En el perfil proteico del pasto obtenido por electroforesis en geles de acrilamida corridos en condiciones desnaturalizantes, se detectaron bandas intensas correspondientes a proteinas de pesos moleculares de 46, 42 y 14 kDa, ademas de otras de menor intensidad correspondientes a proteinas de 64, 58 y 51 kDa, y un grupo de proteinas de alto peso molecular en la region de 87 kDa. Estas bandas de proteinas de alto peso molecular se repiten en el resto de las muestras tomadas durante todo el proceso de degradacion ruminal, valores estos semejantes a los mencionados por la literatura, dado que en ensayos realizados con varias especies, coincidentemente en todos los forrajes se encontraron bandas en pesos moleculares de 15, 30, 45, 47 y 54 kDa (18).

En general, en el follaje de las gramineas se observan dos bandas electroforeticas con mayor intensidad, que probablemente sean la RuBisCO (ribulosa-1, 5bisfosfato carboxilasa oxigenasa), proteina con mayor concentracion en tejidos verdes y con peso de 56 kDa, y otras proteinas involucradas en procesos de reserva llamadas proteinas vegetativas de almacenamiento foliares (VSP), que se encuentran en las hojas. La masa de estas proteinas oscila entre los 27 y 47 kDa y son muy ricas en aminoacidos esenciales, como valina, lisina, prolina, metionina y triptofano, lo cual tambien fue observado en leguminosas (6).

Luego de seis horas de digestion, se observaron las bandas de 65 y 46 kDa, al igual que en el tiempo inicial, a la vez que aparecieron nuevas proteinas a los 60; 55; 44; 33 (debil); 30, 27 y 23 kDa, asi como un grupo de bandas muy debiles de bajo peso molecular entre los 19 y 15 kDa. Doce horas despues, continuo apareciendo la banda correspondiente a los 46 kDa que fuera detectada en tiempo cero. De las bandas que hicieron su aparicion a las 6 horas de degradacion, solo se mantuvieron 4 de ellas y correspondieron a polipeptidos de 60; 55; 33 (debil) y 29 kDa. Tambien se distinguieron nuevas bandas bien definidas de bajo peso molecular: 24; 18 y 15 kDa. A las 24 horas se observo la banda de 29 kDa que fue detectada por primera vez a las 6 horas de digestion, presentandose nuevas bandas a los 71; 64; 50; 34; 26 y 12 kDa.

Posteriormente, a las 48 horas de digestion, se observan las bandas de 50 y 34 kDa que continuaron apareciendo hasta finalizar el ensayo (120 horas). Tambien se presentaron bandas a los 55; 25 y un grupo de bandas entre los 21 y 18 kDa. A las 72 y 120 horas de digestion, se observaron mayores cambios, dado que aparecieron bandas a los 62; 45; 28; 12; 19 y 17 kDa. Estas dos ultimas bandas incrementaron su intensidad al avanzar el tiempo de digestion. Tambien se detectaron nuevas bandas a las 120 horas de digestion a los 55; 40 y 18 kDa.

Se detecto la presencia de bandas muy intensas de 46, 41 y 14 kDa, bandas de menor intensidad de 64, 55, 57 y 51 kDa y un grupo de alto peso molecular de 87 kDa. Trabajando con pastos liofilizados, otros autores encontraron bandas entre 20 y 36 kDa (18); estos forrajes no difirieron en la concentracion nitrogenada y la distribucion de proteinas individuales no vario entre cultivares, siendo semejantes a otros pastos, asi tambien se observo que la fraccion que mas disminuyo fue la de 54 kDa a las 12 horas de degradacion.

Las proteinas de 15, 30 y 54 kDa sumaron el 80% de las proteinas separadas electroforeticamente. Las fracciones de 15 y 54 kDa parecieran ser la mayor y menor subunidad de RuBisCO, y la de 30 kDa es la que podria estar asociada con el complejo clorofila-proteina 25 del fotosistema 2. Las fracciones solubles de las proteinas de las hojas sumaron del 40 al 50% de las proteinas totales. La RuBisCO asi identificada entre ellas represento la mayor proporcion de las proteinas solubles totales en alfalfa, el resto fue una mezcla heterogenea de proteinas en el rango de 10 a 300 kDa (13).

En las especies [C.sub.4], del 8 al 23% del total de proteinas correspondio a la enzima RuBisCO. La perdida de estas fracciones podria ser utilizada como indicador de integridad celular. En presencia de SDS, la proteina RuBisCO se disocia en una fraccion con PM de 56 kDa y una subunidad mas pequena de PM de 16 kDa (25).

En ensayos realizados con especies [C.sub.3], se observo que las tasas de degradacion ruminal eran diferentes. En ellas las fracciones de 24, 26 y 56 kDa, se localizaron dentro del cloroplasto del mesofilo; en las especies [C.sub.4] la fraccion de 56 kDa estaba localizada en el cloroplasto de las celulas de la vaina, que eran degradadas mas lentamente (1), conjuntamente con las fracciones de 24 y 26 kDa que estan en el mesofilo de las celulas de la vaina. La disminucion creciente de estas fracciones de proteinas en el tejido degradado de gramineas megatermicas, apoya fuertemente la hipotesis que estas pueden ser protegidas de la degradacion ruminal por celulas de la vaina (24).

La fraccion de proteina de 56 kDa que al parecer es la subunidad grande de la enzima RuBisCO, estuvo presente en la especie aqui estudiada hasta las 120 h de incubacion ruminal; en cambio, la literatura menciona distintos comportamientos para otras pasturas como ser Panicum, donde estuvo presente hasta las 24 h, en Andropogon se la observo hasta las 16 h y en Bromus solo hasta las 8 h. En cambio otra fraccion como la de 26 kDa, que fue observada hasta las 24 h en Panicum y Andropogon, coincidentemente con lo observado por nosotros, se detecto solamente por 8 h en Bromus (24). La fraccion de 24 kDa en S. setosum, estuvo presente hasta las 48 h de incubacion ruminal, mientras que la literatura cita para Panicum 24 h de incubacion, para Andropogon 8 h y para Bromus 4 h (24).

En estudios realizados en semillas de girasol se encontro que el patron electroforetico exhibio cinco polipeptidos, en el rango de 65,5 a 42 kDa; esto fue comparado contra un patron de ocho polipeptidos, dentro del cual se observo la fraccion de 55 kDa, que perteneceria a RuBisCO y estaria presente en todos los vegetales (26). En porotos pallar se registro la presencia de dos fracciones, una que tenia mayor presencia con PM de 14 a 50 kDa y otra con polipeptidos de PM entre 14 y 116 kDa; ademas, se reporto el hallazgo de varias bandas comunes entre ellas, probablemente debido a una separacion incompleta de las fracciones (11).

Analisis electroforeticos realizados en Lupinus, mostraron bandas entre 14,4 y 66,2 kDa (12). En proteinas de L. angustifolius y L. albus se observaron monomeros con PM que oscilaron entre 17 y 64 kDa (9). Estos valores son coincidentes con los hallados en nuestro trabajo, donde el rango encontrado para los diferentes monomeros se ubico entre los 14 y 64 kDa, a excepcion de dos polimeros, uno de ellos que surgio a las 24 h de incubacion ruminal de PM de 12 kDa y otro de 86 kDa, que aparecio en todos los horarios estudiados.

Otros investigadores sometieron a degradacion ruminal tres genotipos de alfalfa y luego, por electroforesis bidimensional, caracterizaron las proteinas individuales en dos tiempos de incubacion 45 y 120 min. Despues de 45 min, 9 proteinas representaron el 75% del total, 12 proteinas representaron el 50% o menos y otras 5 proteinas fueron intermedias. Despues de 120 min 4 proteinas representaron el 80%, 7 se presentaron en el rango de 80 y 50%, y otras 15 representaron menos del 50% (7).

En trabajos anteriores se caracterizaron las proteinas solubles de la raiz de Lepidium peruvianum, observandose que para todos los ecotipos, los polipeptidos mas abundante eran los de peso molecular bajo (19). A su vez, el mas prominente de los analizados, ostentaba un PM de 22,5 kDa, en segundo lugar un polipeptido de 17 kDa, y el tercer polipeptido mas abundante tenia un PM de 15 kDa, todos ellos distribuidos en un rango de puntos isoelectricos de 7,1 a 8,2. Si bien este estudio se realizo en raices y no en hojas como el aqui presentado, los rangos de puntos isoelectricos coinciden con las observaciones del presente ensayo, no asi los PM que variaron dentro de un rango entre 12 a 87 kDa.

En conclusion, si bien la interpretacion del patron de bandas proteicas de S. setosum refleja variacion con otras especies, la presencia de bandas observadas evidencia homogeneidad con gramineas [C.sub.4]. Se observaron modificaciones en el perfil proteico a lo largo del proceso de degradacion, detectandose la aparicion e intensificacion de bandas de menor PM y la aparicion de bandas de PM superiores. Durante el proceso de degradacion ruminal ensayado, se registro la presencia de bandas que permanecieron durante las 120 h de estudio, lo que permite inferir algun grado de proteccion que ayudaria a prolongar su permanencia sin ser degradada y por lo tanto una menor digestibilidad de esta graminea.

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Slanac, A.L. [1]; Sgroppo, S.C. [3]; Kucseva, C.D. [4]; Balbuena, O. [2]

[1] Catedra de Fisiologia, [2] Catedra de Nutricion y Alimentacion, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE. [3] Catedra de Bromatologia, Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agrimensura, UNNE. [4] INTA Colonia Benitez (Chaco). E-mail: alslanac@vet.unne.edu.ar

Recibido: 29 julio 2014 / Aceptado: 22 septiembre 2014
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Author:Slanac, A.L.; Sgroppo, S.C.; Kucseva, C.D.; Balbuena, O.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Dec 1, 2014
Words:4135
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