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Caracterizacion electroforetica de las proteinas del endospermo de variedades de arroz Venezolanas.

Electrophoretic characterization of endosperm proteins from Venezuelan rice varieties

INTRODUCCION

En el arroz, como en otros cereales, existen al menos cuatro grupos de proteinas: las estructurales, rnetabolicas, protectivas y las de reserva. Estas ultimas en el grano son sintetizadas en el endospermo (Habino et al., 1989; Rubin et al.. 1992; Krishnan y White, 1995) y depositadas en cuerpos proteicos dentro de vacuolas de almacenamiento de proteinas (Shewry y Halford, 2002; Kim et al., 2009, Reyes et al., 2011). Segun el fraccionamiento de Osborne, estas biomoleculas pueden ser clasificadas segun su solubilidad en diferentes solventes, obteniendose mediante extracciones sucesivas con agua, solucion de sales diluida, etanol al 70 % y acidos o alcalis diluidos. Usando esta secuencia de separacion, las proteinas se clasifican en albuminas, globulinas, prolaminas y glutelinas, respectivamente (Ruiz, 2009; Nogueira et al., 2013).

Dada la importancia de los cereales desde el punto de vista agroalimentario, estas proteinas han sido ampliamente estudiadas en diferentes aspectos, entre los que se pueden mencionar: biosintesis (Yamagata et al., 1982; Habino et al., 1989), acumulacion en el cndospermo (Vitale y Ceriotti, 2004), regulacion de la expresion genica y del trafico vesicular (Fauteux y Stromvik, 2009; Onda et al., 2009; Zhou, et al., 2013), caracterizaciones bioquimicas de las diferentes fracciones (Shyur et al., 1994; Abayomi et al., 2009), reacciones inmunologicas en humanos y aspectos nutricionales (Young y Pellett., 2010; Oszvald et al., 2014; Ren et al., 2014). Asi mismo, estas proteinas se han utilizado con el objeto de la identificacion varietal en diferentes tipos de cereales (Huebner et al., 1990; Abe et al, 1996; Hoai et al., 2008) y se han desarrollado asi biomarcadores, tal como es el caso en arroz (Ju y Jinkyu, 2015).

En Venezuela, existen programas de mejoramiento genetico de arroz, lo que ha permitido liberar al mercado un numero importante de variedades para ser aprovechadas por los productores, comercializandose a traves de semillas (Acevedo et al., 2007; Perez et al., 2011). Asi estas variedades, antes de ser liberadas son evaluadas como lo establece el Servicio Nacional de Semillas (SENASEM) a fin de obtener conocimiento de su comportamiento, rendimiento, resistencia o susceptibilidad a enfermedades y calidad del grano, verificando las caracteristicas de distincion, uniformidad y estabilidad, requisitos fundamentales para la proteccion de las variedades vegetales generadas por los programas de mejoramiento genetico (Perdomo et al., 2006; Montoya et al., 2008).

A pesar que en la actualidad las tecnicas de ADN para la identificacion de variedades son muy usadas por su fiabilidad, se propone utilizar las proteinas del endospermo de las semillas del arroz como caracteristica para la identificacion y diferenciacion de las variedades estudiadas, ya que a diferencia de las primeras tecnicas, estos estudios permitiran disponer de una herramienta sencilla y economica para los productores a la hora de constatar la pureza de los granos que desean adquirir, asi como evaluar la presencia del arroz rojo (AR) en los sembradios y consecuentemente mejorar la productividad del cereal.

MATERIALES Y METODOS

Material biologico. Las semillas utilizadas correspondieron a cinco variedades de Ofyza sativa L del subgrupo Indica: Venezuela 21, Araurc, Cimarron, Centauro y D-Sativa, asi como semillas de la maleza conocida como arroz rojo (O. sativa), y arroz silvestre (O. glumaepatula).

Extraccion de prote nas. Se descascaro el grano de arroz y se molio el endospermo de las semillas hasta obtener un polvo fino (harina) que ftie utilizado para la extraccion de proteinas. Para esto, se realizaron modificaciones al protocolo propuesto como metodo 3 por Abayomi et al. (2009), asi como el protocolo de Chcn et al. (2010), segun las siguientes pautas: Para la extraccion de la fraccion (albumina/globulina), se trato 0.25 g de la harina con 250 (xl de solucion de NaCl 1 % durante 1 h, transcurrido ese tiempo se centrifugo a 10 mil rpm por 15 min, conservando el sobrenadante (albumina/globulina). Las glutelinas fueron extraidas tratando al precipitado remanente con NaOH 0,02 M (ajustado a pH 11,0) durante 30 min, y se centrifugo como anteriormente se indico. Para obtener las prolaminas, se utilizo etanol al 70 % v/v durante 4 h, y se realizo nuevamente un proceso de centrifugacion. Entre la extraccion de cada una de las fracciones se realizaron tres lavados con la misma solucion de extraccion, adicionalmente a las fracciones obtenidas se le incluyo fenilmctilsulfonilfluoruro (PMSF) (1 luM) y acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) (0,1 mM) para inhibir la accion de proteasas.

Una vez realizada la extraccion de las diferentes fracciones, las proteinas fueron precipitadas con acido tricloroacctico (ATC). Para ello, a las diferentes fracciones se Ies anadio 500 [micron]L de ATC para obtener una concentracion final del 10 %, y se incubo por 20 min a 4[grados]C. Posteriormente se centrifugo a 10.000 rpm por 10 min, conservando el precipitado (proteinas) que se lavo con etanol al 70 % salvo la fraccion de prolaminas que fue concentrada a 37[grados]C. Todas las fracciones fueron almacenadas a 4[grados]C hasta su analisis.

Determinacion de la concentracion de prote nas. Para la cuantificacion de proteinas en cada una de las fracciones, se utilizo el metodo colorimetrico de Bradford (1976). Se construyo una curva de calibracion con una solucion de albumina de suero bovino (ASB) 100 [micron]g x [mL.sup.-1].

Electroforesis en gel de poliacrilamida en gradiente discontinuo. Para observar el perfil electroforetico polipeptidico de las fracciones (Albuminas/globulinas, prolaminas y glutelinas), se realizo una modificacion del metodo de Laemmli (1970). Se preparo un gel de poliacrilamida en gradiente discontinuo (12, 14 y 16,5 %) en condiciones desnaturalizantes. Para generar un gradiente estable fue necesario incorporar gliccrol a cada una de las concentraciones del polimero, empleando 600 [micron]L para la zona de 16,5 % y 200 [micron]L para la de 14 %. Se analizaron 60 [micron]g de proteinas para establecer comparaciones entre variedades. La corrida electroforetica fue realizada a 100 V por 1 h a 4[grados]C. La tincion se realizo con una solucion de metanol al 40 %, acido acetico al 10 % y azul de coomassie R-250 (0.0123 %) por 30 minutos, luego se trato con una solucion de destenido (metanol 40 % y acido acetico 10 %) hasta observar bandas azules, que se registraron fotograficamente mediante un transiluminador Chemidoc XRS system 170-8170 de Bio-Rad, empleando el programa Piximetrc version 5.7 para la medicion de la migracion de las bandas de proteinas y la correspondiente asignacion de los pesos moleculares aproximados, tomando como referencia el patron de peso molecular de Bio-rad (intervalo 10-250 kDa) utilizado.

Los datos generados fueron comparados mediante un analisis de arbol jerarquizado utilizando la distancia binaria segun el programa estadistico Past version 1.91.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los perfiles electroforeticos de la fraccion albuminas/globulinas, de las variedades de arroz se muestran en la Figura 1. Para esta fraccion, las variedades analizadas mostraron dos patrones electroforeticos caracteristicos: el primero, representado por Venezuela 21, Cimarron y DSativa, es un perfil constituido por 14 bandas con un intervalo de peso molecular aproximado entre 97,6 y 14,5 kDa, tal como se ha senalado al evaluar diversos bancos de germoplasma de arroz (Nogueira et al, 2013; Tripathy et al., 2015; Vithyashini y Wickramasinghe, 2015). En este grupo, la variedad D-Sativa presenta una banda de peso molecular proximo a 37,7 kDa, la cual no se observa en las otras variedades. Asi mismo, se observo que Venezuela 21 y Cimarron mostraron patrones electroforeticos similares en esta fraccion.

El segundo patron electroforetico, encontrado en esta fraccion, lo presentaron las variedades Araure y Centauro. Este estuvo constituido por un menor numero de bandas, con un intervalo de peso molecular aproximado entre 60,6 y 14,5 kDa. Se puede observar que ambas variedades carecen de las subunidades de mayor peso molecular (97,6; 91,2 y 74,4 kDa). A su vez se aprecia que la variedad Araure se distingue de Centauro por presentar un doblete de peso molecular 35,2 y 30,7 kDa, que en esa ultima variedad no se observo.

Es de resaltar que en esta fraccion las variedades estudiadas mostraron una serie de similitudes, como por ejemplo, la presencia de una banda con un peso molecular aproximado a 46,2 kDa, que presento la mayor intensidad a diferencia de lo reportado por Nogueira et al. (2013), quienes indican que la banda de mayor intensidad se ubico en 25 kDa. Estas diferencias pueden ser atribuidas a que en este trabajo las albuminas y las globulinas se encontraron en una misma fraccion. De igual forma, en todas las variedades comerciales se evidencio la presencia de un doblete de bajo peso molecular (15,5 y 14,5 kDa). Sin embargo, tanto ese doblete como la subunidad de 46,2 kDa, no se observaron en el AR. Lo que indica diferencias entre las variedades comerciales y el arroz rojo.

Es importante mencionar que la caracterizacion bioquimica de esta fraccion puede identificar variedades con propiedades nutricionales importantes. Un ejemplo de esto es el indice de Aminoacidos Esenciales (lAE), que es directamente proporcional al contenido de globulinas (Martinez et al., 2005). Este aspecto es relevante ya que los granos de este cereal estan constituidos en un gran porcentaje por almidon y valores cercanos al 10 % de proteinas, tal como lo plantean Kim et al. (2013) y Cao et al. (2009). Sin embargo, algunos autores plantean que su importancia radica en la calidad de la proteina y no en la cantidad de la inisma (Martinez et al., 2005).

Las prolaminas se caracterizan por solubilizarse en soluciones de alcohol, siendo el componente proteico mas abundante en la mayoria de los cereales, a excepcion del arroz donde son las glutelinas las de mayor cuantia, lo cual coincide con los hallazgos encontrados en este estudio. La Figura 2 muestra el fraccionamiento de las prolaminas del endospermo de las cinco variedades comerciales, del arroz rojo y del arroz silvestre. Se puede ver que existe un patron caracteristico de este tipo de proteina, independiente a la variedad estudiada, aspecto que coincide con lo senalado por Nogueira et al. (2013), sin embargo, difiere a lo senalado por Hoai et al. (2008), quienes indican que por analisis de SDS PAGE de esta fraccion es posible identificar cultivares de arroz del norte de Vietnam debido a diferencias en terminos de puntos isoelectrico, numero e intensidad de las bandas.

El patron electroforetico de prolaminas encontrado en este trabajo consiste de 9 subunidades o bandas con un intervalo de peso molecular 93,7 kDa a 5,4 kDa. El componente mayoritario de esta fraccion proteica corresponde a una o varias cadenas polipeptidicas con peso molecular aproximado de 33,2 kDa que puede ser evidenciado por la intensidad de la banda en el analisis electroforetico presentado. Asi mismo, se observan proteinas de bajo peso molecular entre 18 y 14 kDa, resultados similares a los indicados por otros investigadores en otras variedades de arroz (Kim et al., 2013; Nogueira et al., 2013). Otro aspecto importante a senalar son las proteinas menores a 6 kDa detectadas en este estudio (Figura 2), que corresponde a uno de los pesos moleculares mas bajos reportados por este tipo de proteinas en estos cereales (Van Der Borght et al., 2006; Ghandi y Sogi 2007; Oszvald et al., 2014).

La similitud encontrada en el perfil electroforetico de las prolaminas pudiera ser utilizada para diferenciar variedades comerciales de arroz venezolanas de otros cereales, ya que el patron difiere entre cereales. En este sentido, Kim y Okita (1988) sugieren que no existe homologia significativa de estas proteinas en otros cereales, por lo que deben haber diferencias, en terminos de perfiles electroforeticos, entre los diversos cereales (Shewry y Halford, 2002).

Otro aspecto importante en estos analisis es que la especie silvestre mostro un patron de bandas diferente, en tenninos de ausencia de bandas en comparacion con las variedades comerciales, lo que concuerda con lo reportado por Nogueira et al. (2013). Las diferencias radican principalmente en la ausencia de las subunidades de mayor peso molecular en esta fraccion (93,7 y 80,4 kDa), asi como las de 17,2 y 5,4 kDa. Esta informacion pudiera ser utilizada para detectar mezclas entre variedades comerciales y arroz silvestre, ya que el patron electroforetico no corresponderia a las establecidas individualmente para cada una de ellas. En este estudio no se encontraron diferencias entre el patron electroforetico de las variedades comerciales y el arroz rojo, tal como ha sido senalado en otras investigaciones (Nogueira et al., 2013), ya que todos ellos pertenecen a la especie O. sativa.

Las glutelinas constituyeron la fraccion de mayor cuantia determinadas en este estudio, y se encontraron dos patrones electroforeticos para esta fraccion: el primero, lo presentaron las variedades Venezuela 21, Araure y D-Sativa, el mismo estuvo constituido por un total de 13 bandas con un intervalo de peso molecular de 109,1 a 13,7 kDa. Al respecto, Ghandi y Sogi (2007), reportan glutelinas en variedades de arroz con pesos moleculares entre 22 y 88 kDa aproximadamente, siendo las subunidades mayoritarias de 70,04 y 22,28 kDa; mientras que en este trabajo, la subunidad mayoritaria correspondio a la banda en la zona de 48,3 kDa, segun lo evidenciado en la Figura 3, donde se observa que la variedad Venezuela 21 presento 9 de las 13 bandas detectadas en el analisis. En esta variedad no se observan las subunidades de menor peso molecular (14,8 y 13,7 kDa) asi como las subunidades de 19,9 y 18,5 kDa, que unicamente estuvieron presentes en las variedades D-Sativa y Araure respectivamente. El segundo patron caracteristico en la fraccion de glutelinas lo presentaron las variedades Gimarron y Gentauro, esta ultima puede ser diferenciada por presentar la subunidad con el menor peso molecular (13,7 kDa) y la ausencia de bandas en la zona correspondiente a los 109,1 kDa hasta los 60,4 kDa.

En lo que respecta a las similitudes encontradas en esta fraccion entre las diferentes variedades analizadas, se puede decir que existen subunidades que se encuentran presentes en todas ellas, un ejemplo de esto, es el doblete con peso molecular asociado de 24,8 y 23,1 kDa y una subunidad de 48,389 kDa, que constituye el componente mayoritario en todas las variedades (Figura 3). A pesar de las similitudes encontradas en esta fraccion, las variedades analizadas en este estudio mostraron patrones de bandas diferentes lo que sugiere que esta fraccion puede ser utilizada para la identificacion de variedades comerciales de arroz. Estas diferencias pueden ser atribuidas a que esta fraccion proteica es la mayoritaria en los granos de arroz (cerca del 80 %), y es en ella donde existe mayor cantidad de proteinas que muestran alta heterogeneidad en pesos moleculares y puntos isoelectricos (Kagawa et al., 1988; Kim et al., 2013; Nogueira et al., 2013).

El dendograma que se muestra en la Figura 4, indica que con el perfil proteico de las proteinas del endospermo de las variedades estudiadas se pueden distinguir entre ellas, el arroz silvestre y AR. Esta respuesta concuerda con lo descrito por Aiswariya y Thomas (2016), al caracterizar cinco variedades de arroz de la India, utilizando caracteres morfologicos referenciales y perfiles proteicos del grano. Las diferencias encontradas en este estudio pudieran estar relacionadas al hecho de que la principal funcion de las proteinas de reserva es servir de fuente de amino acidos, de carbono o nitrogeno, al embrion en desarrollo, por lo que desde el punto de vista funcional no parecen tener tantas restricciones, lo que permite que exista polimorfismo a pesar de la existencia de una estrecha base genetica entre las variedades comerciales.

Finalmente, la informacion suministrada en este estudio concuerda con lo reportado por otros autores (Kumamaru et al., 1988; Chen y Chen, 1989; Nogueira et al., 2013) quienes plantean que los perfiles electroforeticos de las proteinas de la semilla o del endospermo pueden utilizarse para establecer diferencias entre cultivares, asi como del arroz rojo y del silvestre. Es por esto que se recomienda realizar este tipo de trabajo a todas las variedades comerciales presentes en el pais, asi como, al complejo de Arroz rojo y arroz silvestre presente en los estados productivos de Venezuela.

CONCLUSIONES

Las variedades Araure, Centauro y D-Sativa pueden ser diferenciadas por analisis electroforetico utilizando la fraccion de albuminas/globulinas de las proteinas del endospermo. Sin embargo, esta fraccion no permitio discriminar por esta tecnica entre las variedades Venezuela 21 y Cimarron.

En la fraccion de prolaminas no se encontraron diferencias en el patron de bandas en las variedades de O. sativa estudiadas, pero si es posible identificar la especie silvestre de este cereal

Con el patron de bandas de la fraccion de glutelinas ftie posible detectar un perfil polipeptidico unico para cada tipo de semilla estudiada, es decir, cada patron fue diferente (en terminos de presencia y ausencia de bandas) en todas las variedades analizadas.

AGRADECIMIENTO

A la Dra. Iris Perez (INIA-Maracay) por la donacion de las semillas de las cinco variedades de Oryza sativa y a la Dra. Aida Ortiz (Facultad de Agronomia, UCV) por la donacion de las semillas de arroz rojo y arroz silvestre.

Este trabajo fue subvencionado por el Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de la Universidad de Carabobo (CDCH-UC), segun oficio No. CDCH 023-2012.

LITERATURA CITADA

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Carlos Jose Moreno [1], Rafael Fernandez Da Silva [1] y Oscar E. Valbuena Vilchez [1]

Recibido: Enero 30, 2016 Aceptado: Octubre 13, 2016

[1] Dpto. de Biologia, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnologia (FACYT). Centro de Biotecnologia Aplicada (CBA), Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela. e-mail: cjmore@gmail.com; rafaelfer2l03@hotmail.com; ovalbuena@uc.edu.ve

Leyenda: Figura 1. Perfil electroforetico de la fraccion de albuminas y globulinas del endospermo de variedades venezolanas de arroz (SDS-PAGB en gradiente discontinuo del 12 al 16.5 %). 1.--Marcador de peso molecular (Sigma Marker M4038). 2.--Venezuela 21. 3.--Araure. 4.--Cimarron. 5.Centauro 6.--D-Sativa. 1--Arroz rojo. 8.--Arroz silvestre.

Leyenda: Figura 2, Perfil electroforetico de la fraccion de prolaminas del endospermo de variedades venezolanas de arroz (SDS-PAGE en gradiente discontinuo del 12 al 16.5 %). 1.--Marcador de Peso Molecular (SigmaMarker M4038). 2.--Venezuela 21.3.--Araure. 4.-Cimarron. 5.--Centauro 6.D--Sativa. 7.--Arroz rojo. 8.--Arroz silvestre

Leyenda: Figura 3. Perfil electroforetico de la fraccion de glutelinas del endospermo de variedades venezolanas de arroz (SDS-PAGE en gradiente discontinuo del 12 al 16.5 %). 1.--Marcador de Peso Molecular (SigmaMarker M4038). 2.--Venezuela 21. 3.--Araure. 4.--Cimarron. 5.--Centauro 6.--DSativa. 7.--Arroz rojo. 8.--Arroz silvestre

Leyenda: Figura 4. Dendograma con informacion de todas las fracciones proteicas. 1.--Venezuela 21. 2.--Araurc. 3.--Cimarron. 4.--Centauro 5.--DSativa. 6.--Arroz rojo. 7.--Arroz silvestre
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Author:Jose Moreno, Carlos; Fernandez Da Silva, Rafael; Valbuena Vilchez, Oscar E.
Publication:BIOAGRO
Article Type:Report
Date:Apr 1, 2017
Words:4525
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