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Caracterizacion de la estructura secundaria de subtipos de la historia H1 por dicroismo circular.

CHARACTERIZATION OF THE SECONDARY STRUCTURE OF HISTONE H1 SUBTYPES BY CIRCULAR DICHROISM (CD)

INTRODUCCION

En las celulas eucariotas la cromatina esta formada por un complejo de ADN y proteinas que compactan eficazmente grandes cantidades de ADN dentro del pequeno volumen nuclear. Las histonas modulan la estructura y la funcion de la cromatina, las cuales, a su vez, afectan la utilizacion del ADN genomico. La estructura de la cromatina esta sujeta a procesos de dinamica estructural que hacen posibles la replicacion, la transcripcion y la regulacion de la expresion genica (1, 2).

Las histonas H1 son proteinas basicas que interaccionan con el ADN internucleosomal (3-5). Se han descrito numerosos subtipos de la histona H1 en vertebrados, invertebrados y plantas, pero los mejor caracterizados son los siete subtipos de los mamiferos, cinco somaticos, H1a, b, c, d, e, H1, y dos especificos de celulas germinales, H1t y H1oo (6), la H5 de eritrocito de ave (7) y la B4 de Xenopus (8).

Los diferentes subtipos de histonas sufren modificaciones postraduccionales como: fosforilacion, acetilacion, metilacion, poli-ADP-ribosilacion y ubiquitinizacion. Recientemente, se han identificado nuevas modificaciones postraduccionales en histonas H1 de eritrocitos de pollo: cuatro acetilaciones, tres formilaciones y dos fosforilaciones (9). Las histonas H1 difieren en estabilidad evolutiva (10) y en las tasas relativas de sintesis y degradacion, en celulas en division y en celulas quiescentes, propiedades que permiten cambios en sus proporciones relativas durante el desarrollo y la maduracion de los tejidos. Las histonas H1 presentan diferencias de afinidad relativa por el ADN y por la cromatina; la H1a es el subtipo con mas baja afinidad, las H1b y H1c tienen afinidades intermedias y las H1d, H1e y H1 tienen las afinidades mas altas (11).

La estructura de las histonas H1 esta conformada por un dominio central globular flanqueado por los extremos amino-terminal (N-terminal) y carboxilo-terminal (C-terminal); su dominio globular interacciona con el ADN de enlace a la entrada y salida del nucleosoma (12) y esta constituido por un haz de 3 helices-alfa y una lamina-beta antiparalela (beta-hairpain) en el extremo carboxilico. El dominio N-terminal (DNT) presenta dos regiones claramente diferenciadas: la region mas cercana al N-terminal tiene caracter apolar, por la presencia de residuos de alanina y prolina y la otra region, adyacente al dominio globular, es similar al dominio C-terminal en composicion aminoacidica, contiene residuos basicos, especialmente lisina. Por su parte, el dominio C-terminal (DCT), rico en lisina, serina, prolina y alanina, interacciona con el ADN entre los nucleosomas, neutraliza su carga y facilita la compactacion de la cromatina (13). El primer nivel de compactacion de la cromatina, el nucleosomal, puede deberse, en parte, a interacciones electrostaticas entre las cargas positivas de la histona H1 y los fosfatos del ADN internucleosomal (14). Es probable que los dominios terminales de la H1 se plieguen en helice-alfa y lamina-beta al interaccionar con el ADN (15).

Por otra parte, los extremos N-terminal y C-terminal son altamente basicos. En disolucion, estos dominios estan desestructurados, probablemente como consecuencia de la distribucion regular de residuos de prolina y por las repulsiones entre las cargas positivas de las cadenas laterales de los numerosos residuos de lisina y arginina, estos residuos constituyen casi el 30% del total (16).

La variacion en secuencia y estructura de los subtipos de la histona H1 ha sido ampliamente reconocida como un importante factor en la determinacion de la estabilidad local de la cromatina. La variacion en las secuencias de aminoacidos entre los subtipos de una misma especie radica en la extension de los dominios policationicos (N-terminal y C-terminal), mientras que el dominio globular es conservado en su secuencia de aminoacidos. Dentro de un mismo organismo, el peso molecular de dos subtipos de la histona H1 puede diferir en aproximadamente 1 kDa (Tabla 1) (17, 18); esta diferencia se debe al dominio C-terminal de la molecula. La distinta composicion y conformacion de los dominios de los subtipos pueden jugar multiples papeles funcionales en la estructura de la cromatina y en el proceso de regulacion genica.

En presencia de inductores de helice-alfa_el DCT adopta una estructura en cortos segmentos de helice, interrumpidos por los residuos de prolina (19, 20), que podrian interaccionar con uno de los surcos del ADN (21). Se ha propuesto que los motivos (S/T)P(K/R)(K/R), presentes en el DCT, adoptan una estructura de giro _eta (b) (22). A su vez, estudios con peptidos, correspondientes a los extremos N-terminal y C-terminal de las histonas H1 y H1e, mediante dicroismo circular (DC) y resonancia magnetica nuclear en dos dimensiones demostraron que los peptidos se estructuran en helice-alfa y codos b,s o s,b (23). Igualmente, se determino que los elementos de estructura secundaria, presentes en el DCT unido a ADN, incluyen helice-alfa, estructura-beta, giros y bucles abiertos (15).

En presencia de agentes aglomerantes, el DCT de las histonas H1t y H1 se estructura en helice-alfa, banda-beta y bucles abiertos; ademas, el DCT no unido se encuentra en un estado de globulo fundido, como en la estructura secundaria nativa, pero carece de la estructura del dominio cooperativamente unida al ADN (24).

El efecto de la fosforilacion sobre la estructura secundaria del complejo DCT-ADN es especifico de sitio y depende del numero de grupos fosfato. La fosforilacion completa aumenta la proporcion de estructura-beta y disminuye la de helice-alfa, mientras que la fosforilacion parcial aumenta la cantidad de estructura indefinida y causa disminucion de la helice-alfa, sin un aumento significativo de la estructura-beta. El grado de fosforilacion tambien tiene efecto sobre la afinidad del DCT unido al ADN; la fosforilacion parcial reduce drasticamente la agregacion de fragmentos de ADN por el DCT, pero la fosforilacion completa restaura, en gran medida, la capacidad de agregacion del DCT no fosforilado (25).

La union del dominio C-terminal al ADN es basicamente electrostatica; esto implica compensacion de la carga reciproca de los fosfatos del ADN y los grupos amino de la lisina. La eliminacion de la carga de la lisina a pH alcalino induce el plegamiento del DCT con proporciones de motivos de estructura secundaria similares a los observados en complejos con ADN; estas observaciones condujeron a sugerir que el aumento de hidrofobicidad de las cadenas laterales anfipaticas de la lisina, que genera la neutralizacion de la carga en la interaccion con el ADN, es el responsable del plegamiento del dominio C-terminal (26).

Se ha determinado el efecto de varios detergentes sobre la estructura secundaria del DCT, utilizando espectroscopia de infrarrojo (27). Los detergentes neutros, Brij 35 y Triton X-100, y el detergente ionico, SDS, inducen el plegamiento del DCT no fosforilado, con proporciones de estructura secundaria similares a los encontrados en complejos ADN-DCT. La fosforilacion del DCT se comporta como un interruptor estructural; en la presencia de detergentes, aumenta la cantidad de estructura--beta y disminuye la helice-alfa. El mayor efecto se observa en el DCT completamente fosforilado, en presencia de SDS, cuando se convierte en una proteina todo beta y se forman fibras amiloideas. En condiciones similares, cuando la H1 esta completamente fosforilada forma fibras amiloideas (27).

Por otra parte, el DC es una tecnica estandar para medir la actividad optica de moleculas asimetricas en disolucion, como las proteinas y los acidos nucleicos, mediante la absorcion desigual de la luz polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda por moleculas activas opticamente. El espectro de DC se puede observar en dos regiones espectrales: en el ultravioleta (UV) lejano, o region amida (170 nm--250 nm), debido a los enlaces peptidicos, y en el UV cercano (250 nm--330 nm), debido a los aminoacidos aromaticos. La region amida da informacion sobre la organizacion estructural de una proteina y es usada para caracterizar la estructura secundaria y sus cambios; por ejemplo, la estructura en helice-alfa muestra un fuerte y caracteristico espectro en la region del UV lejano.

Espectros de referencia observados en varias proteinas, con conformacion en helice-alfa, muestran dos picos negativos: uno con un valor de elipticidad molar de--35700 a 222 nanometros de longitud de onda ([[[theta]].sub.222]-35700) y otro con un valor de elipticidad molar de -32600 a 208 nm ([[[theta]].sub.208]-32600); ademas, aparece un pico positivo de +76900 a una longitud de onda de 191 nm ([[[theta]].sub.191] + 76900). El espectro caracteristico de la banda beta muestra una banda negativa de -18400 de elipticidad molar ([[[theta].sub.]217]-18400) y una banda positiva con valor de elipticidad molar de + 31900 ([[[theta]].sub.195] + 31900). La conformacion desestructurada (random coil) presenta un pequeno pico a 217 nm de 4600 y uno mayor a 197 nm (-41900) (28).

Las conformaciones basicas de las proteinas son facilmente distinguibles por su espectro de DC. Las histonas disueltas en agua, o en disolucion a muy baja fuerza ionica, se encuentran desestructuradas. Las histonas H1 tienen un espectro de DC caracteristico de helice-alfa en presencia de sal o de inductores como TFE (trifluoroetanol) o NaCl[O.sub.4] (perclorato de sodio). Por tanto, a partir de los espectros de DC en la region amida, se pueden utilizar varios modelos matematicos para determinar la estructura secundaria de las proteinas (29-32).

Como se ha descrito en parrafos anteriores, la mayoria de estudios sobre la estructura de las histonas H1 incluye determinacion de estructura secundaria de peptidos correspondientes a los dominios terminales y determinacion de estructura de los dominios amino y carboxiterminales de algunos subtipos como H1, H1e y H1t y su interaccion con moleculas como ADN, agentes aglomerantes y trifluoroetanol, a traves de diversas tecnicas, pero, poco hay reportado sobre la determinacion de la estructura secundaria de las histonas H1 completas; por ejemplo, se ha determinado la estructura secundaria en histonas H1 parcialmente purificadas como en la mezcla de H1bcde, en H1a, y H1t (33); en este contexto, por lo tanto, este trabajo de investigacion tuvo como objetivo caracterizar la estructura secundaria de subtipos de la histona H1 (H1, H1a, H1b, H1c, H1e) mediante DC.

MATERIALES Y METODOS

Purificacion de nucleos

Los nucleos se purificaron a partir de cerebro de ratas, de la cepa OFA Sprague Dawley, de dos grupos de edad, de 15 dias, para la posterior purificacion de H1a y H1b, y de 30 dias o mas, para purificar H1 (34, 35). El tejido se homogeneizo con sacarosa 1 M en cacodilato sodico 4 mM, KCl 100 mM, espermina 0,60 mM, espermidina 200 mM, EDTA 4 mM, tiodiglicol 4%, PMSF 0,1 mM, 0,1 mg de aprotinina, 0,1 mg de leupeptina y 0,1 mg de pepstatina. Los nucleos se precipitaron por centrifugacion del homogeneizado sobre una disolucion de sacarosa 2M, a 28.000 rpm, en un rotor Beckman SW 28. El precipitado nuclear se resuspendio en cacodilato sodico, KCl, espermina, espermidina, Ca[Cl.sub.2] y tiodiglicol y se comprobo el estado de los nucleos al microscopio optico.

Extraccion de la histona H1 total

Para purificar la H1 total de cerebro de rata se modifico el metodo de extraccion salina (36). Teniendo en cuenta la concentracion de ADN en la disolucion de nucleos, se realizo digestion con 5 ml de nucleasa micrococal (0,5 unidades/ ml) durante 10 min a 37 C. Los nucleos se recuperaron en el precipitado despues de centrifugar durante 10 min a 12.000 rpm; se resuspendieron en 2 ml de EDTA 1 mM, Tris 10 mM, inhibidores a pH 7,4 y se dializaron toda la noche a 4 C frente a EDTA 1 mM, Tris 10 mM a pH 7,4. Despues de este proceso de lisis nuclear, la cromatina quedo libre en la disolucion.

La cromatina solubilizada se ajusto a una concentracion 0,35 M de NaCl con gotas de NaCl 4 M a pH 8,8. Despues, se anadio Carboximetil-Sephadex C-25 hidratado (CM-S) (24 mg/ ml) y se agito en hielo durante 2 horas; en este periodo, las histonas H1 cargadas positivamente fueron selectivamente extraidas de la cromatina y unidas a la resina de CM-S--operacion por tandas--(36, 37).

Despues del proceso de intercambio cationico, la suspension se centrifugo a 10.000 rpm durante 10 min para recuperar, en el precipitado, las histonas unidas a la resina de CM-S y, para eliminar, en el sobrenadante, los restos de cromatina, ADN e histonas no unidas. La suspension de CM-S, con histonas unidas, se lavo cuatro veces mas con NaCl 0,35 M, Tris 10 mM, PMSF 0,1 mM a pH 8,8 para retirar todos los restos.

Posteriormente, el CM-S, con histonas unidas y equilibrado con NaCl 0,35 M, Tris 10 mM, PMSF 0,1 mM a pH 8,8, se cargo en una columna que contenia 3 ml de Sephadex G-25, tambien, previamente equilibrada con NaCl 0,35 M, Tris 10 mM y pH 8,8.

[FIGURA 1 OMITIR]

Las histonas H1, unidas a la resina de CM-Sephadex, se eluyeron con 60 ml de un gradiente lineal de NaCl 0,35 M a 1,2 M, Tris 10 mM/ pH 8,8. El perfil de elucion se registro a 226 nm con un detector Unicord SII de Pharmacia-Biotech y se recogieron fracciones de 1 ml. La composicion de las fracciones se comprobo en geles de poliacrilamida con SDS (38, 39); el gel de resolucion se preparo con poliacrilamida al 15 %, porque se obtiene mejor resolucion de la H1 de rata (38); el gel de concentracion se preparo al 5%. Las fracciones correspondientes al pico en el cromatograma (Figura 1) se dializaron frente a acido acetico al 1%, se liofilizaron y se utilizaron como material de partida para separar cada uno de los subtipos: H1, H1a, H1b, H1c y H1e.

Separacion de la histona H1

La separacion de la H1 se realizo a partir de H1 total purificada de cerebro de rata de 30 dias o mas; a esta edad, esta proteina se encuentra en mayor proporcion (40). Se separo por filtracion en gel (41) con Biogel P100 en una columna de 160 cm de longitud y un diametro de 2 cm. Entre 1,25 y 3 mg de H1 total liofilizada, obtenidos por intercambio cationico con CMS, se resuspendieron en 2 ml de urea 4 M, Tris 10 mM, se cargaron en la superficie del gel y se realizo elucion con 10 mM HCl, 0,02 azida sodica (NaN3), a temperatura ambiente, a una velocidad de 10 ml/hora y se recogieron fracciones de 3,5 ml. El perfil de elucion se registro con un detector Unicord SII de Pharmacia-Biotech. Las fracciones de los picos se analizaron por electroforesis de poliacrilamida con SDS (38, 39).

Purificacion de las histonas H1a, H1b, H1c, H1e

A partir de la histona H1 total, extraida por intercambio cationico, las histonas H1a, b, c y e se separaron por Cromatografia Liquida de Alta Resolucion de Fase Reversa (RP-HPLC) (42). La cromatografia se realizo en un sistema modular Waters, que consiste en dos bombas (modelo 150), un inyector de liquido (UGK) y un detector de absorbancia modelo 490E. El sistema fue controlado por el programa Maxima 820 (Dynamic Solution, Division of Millipore Corp.). Se uso una columna Vydac C18 de 28 cm de longitud. Se preparo como disolucion A, acido trifluoracetico al 0,1%, y como disolucion B, acido trifluoracetico al 0,1% y acetonitrilo (CH3CN) al 95%. La histona H1 total liofilizada (obtenida por intercambio cationico) se resuspendio en 1 ml de disolucion A y se centrifugo a 13.000 rpm durante 5 min, para eliminar cualquier material particulado antes de inyectar la muestra en el sistema de HPLC; posteriormente, se realizo la inyeccion manual de la muestra. La elucion se realizo durante 140 min a un flujo de 0,7 ml/ min con el siguiente gradiente: de 0 a 10 min 100% de A, de 10 a 15 min 80% de A y 20% de B, de 15 a 115 min 60% de A y 40% de B, de 115 a 120 min 10% de A y 90% de B, y finalmente de 120 a 140 min 100% de A. El perfil de elucion se registro a 214 y a 280 nm de longitud de onda.

Las fracciones se analizaron por PAGE-SDS y PAGE-AU, geles de poliacrilamida con ureaacetico de alta resolucion (38, 40, 43). El gel de resolucion con 15% de acrilamida, urea 2,5 M, acido acetico 0,9 M, persulfato de amonio al 0,5% y 400 ml TEMED (tetra-metil-etilen-diamina). se dejo polimerizar toda la noche (15). El gel de concentracion se preparo con acrilamida al 7%, urea 2,5 M, acido acetico 0,9 M, persulfato de amonio al 0,5% y TEMED.

Se realizo pre-electroforesis, a 200 voltios (v) durante 12 horas a 4[grados]C, para remover radicales libres del gel (38); se uso acido acetico 0,9 M como tampon de recorrido. Despues de la pre-electroforesis, el tampon se cambio por acido acetico 0,9 M fresco y se cargaron las muestras. Previamente, un volumen de 50 ml de cada muestra fue evaporado y disuelto en 10 ml de tampon de muestras (urea 8 M, tiodiglicol 5%, ditiotreitol 0,1 mM, pironina 0,01% y acido acetico 0,9M) (38). La electroforesis se corrio a 320 v durante 29 horas. El gel se sumergio en una disolucion de metanol/ agua/ acetico (5:5:1) durante 30 min, con el fin de fijar las proteinas, y luego se tino durante toda la noche con negro amido. El gel se destino con una disolucion de metanol/agua/acetico (45:45:10).

Desnaturalizacion-renaturalizacion de las proteinas

Antes de medir los espectros de DC, todos los subtipos de la H1 se sometieron a un proceso de desnaturalizacion-renaturalizacion. La desnaturalizacion se realizo con urea 6 M y la renaturalizacion se realizo por dialisis frente a concentraciones decrecientes de urea 6 M, 3 M, 1,5 M, 0,75 M, 0,3 M en NaCl 0,2 M y tampon fosfato 10 mM a pH 7; finalmente, las proteinas se dializaron frente a NaCl 0,14 M y tampon fosfato 10 mM a pH 7.

Dicroismo circular

Los espectros de DC se registraron con un espectropolarimetro JASCO J-715. El analisis de los espectros se realizo con el programa "Analisis Estandar" de JASCO, que permite realizar los espectros de diferencia, el cambio de unidades a elipticidad molar__q__(deg.[cm.sup.2]/ dmol de residuo) y la reduccion de ruido de fondo, si es necesario. Los espectros se realizaron con una cubeta de cuarzo rectangular de 0,1 cm de paso de luz a 20[grados]C; los parametros seleccionados fueron: rango 260-190 nm, amplitud de la banda 2,0 nm, resolucion 0,5 nm, acumulacion 4, sensibilidad 50 mdeg, respuesta 2 s y velocidad 50 nm/min. Para cada uno de los subtipos H1, H1a, b, c y e, se realizo una serie de espectros en: tampon fosfato 10 mM; tampon fosfato 10 mM, 20% TFE; tampon fosfato 10 mM, 40% TFE; tampon fosfato 10 mM, 60% TFE; tampon fosfato 10 mM, 150 mM NaCl y tampon fosfato 10 mM, 1M NaCl. Las concentraciones de las proteinas se midieron espectrofotometricamente usando [EXPRESSION MATHEMATIQUE NON REPRODUCTIBLE EN ASCII.] = 205 (44, 45).

Los porcentajes de helice-alfa se calcularon por diferentes modelos matematicos, a partir de los espectros de DC. El primer modelo se basa en la ecuacion empirica que expresa que: % helice a = 100 [[q].sub.222]/(-39500 (1--2,57 / n))], donde n es el numero de enlaces peptidicos y [[q].sub.222]] es la elipticidad molar de las proteinas a 222 nm de longitud de onda (29). El segundo modelo, utiliza la elipticidad molar a 193 nm, usando la ecuacion: % helice--a = 14,769 + 0,0010261 [[q].sub.193]], en la cual [[q].sub.93]] es la elipticidad molar de la proteina a 193 nm de longitud de onda (30). La ecuacion fue obtenida por correlacion de los cambios de elipticidad molar a 193 nm con el contenido de helice obtenido del metodo de Chen et al. (29); con esta ecuacion, es posible obtener el contenido de helice-alfa corregido por la contribucion de aminoacidos aromaticos en proteinas o peptidos con fenilalanina.

Puesto que la elipticidad molar a 222 nm y a 193 nm depende de la exactitud en la determinacion de la concentracion de las proteinas, con el proposito de eliminar posibles errores en su determinacion, se usaron dos parametros independientes de la concentracion: R1 y R2, que son relaciones de intensidades en los espectros de DC (31). R1 es definido como la relacion entre [q] maxima en el rango de longitud de onda de 190 nm a 195 nm y la q minima en el rango 195 nm a 210 nm, y R2 se define como la proporcion entre [q] 222 nm y q minima.

Por ultimo, se uso el programa de deconvolucion K2D, que proporciona una estimacion de los porcentajes de estructura secundaria de las proteinas, a partir de los espectros de DC, teniendo en cuenta el intervalo entre 200 nm a 240 nm (32), que tampoco depende de la concentracion.

RESULTADOS

Purificacion de los subtipos de la H1

La histona H1 se extrajo por cromatografia de intercambio cationico como se describe en Materiales y Metodos. En el perfil de elucion, se obtuvo un unico pico (Figura 1a) porque el proceso de intercambio cationico, en este caso, es un proceso preparativo de la mezcla de histonas H1 (H1, H1a, b, c, d, e), en el cual estas proteinas se separan de la cromatina y se unen al CM-Sephadex a una concentracion 0,35 M de NaCl. El unico pico eluyo a partir de 0,6 M y el maximo se registro a 0,7 M.

Cuando la histona H1 total se separa en geles de poliacrilamida con SDS da origen a un patron de tres bandas electroforeticas. La banda con menor movilidad corresponde a la mezcla de histonas H1a, b, d, e; por debajo de esta, corre la H1c y la tercera banda con mayor movilidad corresponde a la H1, carril 2 (Figura 1b) (38, 43).

En el analisis electroforetico de la H1 total, extraida por intercambio cationico (carriles 8-16, Figura 1b), las bandas mas intensas corresponden al maximo del pico observado (carriles 9, 10, Figura 1b). En todos los carriles, se observa la banda con menor movilidad electroforetica formada por H1b, d, e; en el carril 8, por debajo de la anterior, corre con una movilidad ligeramente superior, la H1a; la siguiente banda corresponde a la H1c que se ve mas intensa en los carriles 9-13, y por ultimo aparece la H1 a partir del carril 12.

La H1a eluyo a una concentracion 0,6 M, mientras que la H1 eluyo al final del pico, a una concentracion 0,8M, (a partir del carril 12). La elucion mas rapida de la H1a indica una menor afinidad de este subtipo por el CM-Sephadex; esto significa que existe un mecanismo de separacion electrostatico, con la mayor carga positiva en los subtipos que eluyeron al final.

[FIGURA 2 OMITIR]

La histona H1 se separo por filtracion en gel. En el cromatograma (Figura 2a) se observaron dos picos, el primero corresponde a la mezcla de histonas H1a, b, c, d y e, que empezo a eluir a los 166 ml y se recogio en un volumen de 17 ml (fracciones 50-54) y el segundo corresponde a la H1, que empezo a eluir a los 190 ml y se recogio en un volumen de 14 ml (fracciones 57-60). En el analisis electroforetico (Figura 2b), en los carriles 4, 5, 6, 7 y 8, se observa la mezcla de histonas del primer pico que se separa en las dos bandas electroforeticas tipicas, y en los carriles 11, 12, 13 y 14, se observa la H1 que tiene la mayor movilidad en geles de poliacrilamida con SDS.

La separacion de las histonas H1a, b, c y e, por RP-HPLC, se realizo a partir de H1 total purificada de cerebro de rata de 15 dias, cuando la H1a y la H1b se encuentran en mayor proporcion (40). Con el gradiente utilizado, como se describe en Materiales y Metodos, las histonas se separaron en 5 picos (cromatograma, Figura 3a). El analisis de las fracciones correspondientes a cada uno de los picos se realizo en geles de poliacrilamida de urea-acetico de alta resolucion (Figura 3b); se uso como marcador de peso molecular una mezcla de histonas (carriles 1, 15, 16 y 27); en el carril 27 del gel, se observa que el subtipo con menor movilidad es H1a, luego aparecen H1b y H1d; luego se observa la banda con la mezcla H1c-H1e, que tiene la misma movilidad, y por ultimo, H1, que se separa en sus dos componentes H1a y H1b. Estas bandas electroforeticas corresponden con las descritas por otros investigadores (38, 40, 43).

[FIGURA 3 OMITIR]

El analisis en gel de urea-acetico muestra que el primer pico del cromatograma corresponde a una mezcla de H1b y H1, el segundo pico corresponde a H1b, el tercer pico a H1a y el cuarto a H1e; estos cuatro picos eluyeron de la columna, respectivamente, a los 90, 104 y 107 min. En el quinto pico, que eluyo a los 110 min, se solaparon en gran porcentaje H1c y H1d. La histona H1c se recogio manualmente al final del quinto pico.

Como en el gel de urea-acetico la H1e y la H1c tienen la misma movilidad electroforetica (38, 40, 43), las fracciones correspondientes a los 5 picos de la RP-HPLC se separaron en gel de poliacrilamida con SDS para comprobar su identidad (Figura 3c). En este gel, la H1e esta ubicada en la primera banda, de acuerdo con su movilidad electroforetica caracteristica en SDS-PAGE (carril 4), y la H1c en la segunda banda (carril 7). Tambien, se observa que las proteinas no estan mezcladas con otros subtipos y su movilidad electroforetica es la caracteristica en cada uno de los subtipos (38, 43).

[FIGURA 4 OMITIR]

Prediccion de estructura secundaria a partir de los espectros de dicroismo circular

En los espectros de DC de las histonas realizados con 150 mM de NaCl y con 1 M de NaCl en tampon fosfato 10 mM, no se aprecian cambios importantes, si se comparan con los espectros a baja fuerza ionica con 10 mM TP (Figura 4).

En los espectros de las histonas H1, H1a, H1b, H1c y H1e con TFE (Figura 5), se observa que, al anadir TFE, va disminuyendo el valor de la elipticidad molar a 222 nm y van aumentando los valores con longitudes de onda menores a 200 nm; es decir, el perfil de elipticidad va adquiriendo la forma tipica de helice-alfa. En las histonas H1, H1a, H1c y H1e el cambio mas importante se produjo al pasar de un 20% a un 40% de TFE. En el caso de la H1b, en contraste con los demas subtipos, el aumento de helicealfa se produjo de manera gradual al anadir cantidades crecientes de TFE.

[FIGURA 5 OMITIR]

DISCUSION

Purificacion de los subtipos

Para extraer la histona H1, la edad se tuvo en cuenta porque los subtipos H1a y H1b se encuentran en mayor proporcion en el cerebro de ratas jovenes y la H1 se acumula en neuronas en proceso de diferenciacion, es decir, a partir de 10 dias de edad. Los subtipos H1c, d y e son los mas abundantes a cualquier edad, aunque tambien se encuentran en diferente proporcion segun el grado de desarrollo del tejido (35, 40).

Teniendo en cuenta que la histona H1 es una proteina policationica, se realizo una extraccion preparativa usando como intercambiador cationico carboxi-metil-Sephadex C-25, en la cual, en un primer paso, las histonas H1 se unieron a una suspension de CM-S, operacion por tandas (36, 37) y, en un segundo paso, la suspension de resina-histonas unidas se cargo en una columna de 28 cm sobre 3 ml de Sephadex G-25; el paso por Sephadex G-25 evito que las histonas separadas del CM-S en el proceso de elucion con el gradiente lineal de NaCl se volvieran a unir a esta resina. Esta modificacion se realizo al metodo de extraccion salina (36), porque, en los primeros ensayos, las histonas quedaban retenidas en la resina de CM-S y no se recuperaban en el tampon de elucion; ademas, si se aplicaba un gradiente con mayor concentracion de NaCl se unian las histonas internas (H2A, H2B, H3 y H4). Las histonas H1 se separan a una fuerza ionica de 0,35 M porque se encuentran unidas a la entrada y a la salida de los nucleosomas; por el contrario, las histonas internas forman el centro del nucleosoma y es necesario aplicar mayor fuerza ionica para su separacion de la cromatina (3-5).

En el analisis electroforetico de la purificacion de la H1, se tuvo en cuenta que aunque la electroforesis en geles que contienen SDS separa proteinas de acuerdo con su peso molecular, las histonas realizan contribuciones sustanciales a la carga de sus complejos con SDS y tienen un comportamiento anomalo; estas histonas con peso molecular entre 20 y 22 kDa (Tabla 1) (17, 18) migran como un grupo de proteinas de peso molecular aparente entre 30 y 35 kDa (38), como se observa en el gel respecto al marcador de peso molecular (Figura 1b).

A pH acido y baja fuerza ionica la precipitacion de histonas es minima; sin embargo, bajo estas condiciones, las histonas existen como cadenas extendidas, se comportan de manera anomala en cromatografia de filtracion en gel y exhiben pesos moleculares que pueden estar en un factor de 2 a 6 veces mas altos que sus pesos moleculares normales (41, 46); esta caracteristica de mostrar pesos moleculares anomalos permite separar la H1 de la mezcla de histonas H1a, b, c, d, e y H1 por filtracion en gel con Biogel P100, producto utilizado por los investigadores para separar histonas (41, 46, 47) y que en este trabajo permitio la separacion de la H1 de los demas subtipos.

Por RP-HPLC se logro la separacion de los subtipos H1a, H1b, H1c y H1e. Los resultados obtenidos se contrastaron con distintos protocolos de separacion realizados por varios investigadores (42, 48-50). En uno de los trabajos, el proceso de separacion de las histonas H1 de higado de rata se realizo durante 45 min a un flujo de 0,5 ml/min, con gradiente lineal desde 60% de disolvente A y 40% de disolvente B hasta 42% de A y 58% de B (disolvente A: 0,1% de acido trifluoroacetico en agua; disolvente B: 0,1% de acido trifluoroacetico en 70% de acetonitrilo) y obtuvieron 6 picos, correspondientes a las histonas H1, H1b, H1a, H1d, H1e+c y H1c (48). Estos autores, tambien, separaron H1 de testiculo de rata, entre ellas, la H1t, especifica de celulas germinales masculinas, que eluyo a los 38 min en el pico 7. El gradiente y el tiempo utilizado por estos autores es diferente al utilizado en esta investigacion, en la cual se obtuvieron 5 picos que corresponden, consecutivamente, a las histonas H1+b, H1b, H1a, H1e, H1d+c y al final del quinto pico, se recogio manualmente la H1c.

Otros investigadores separaron histonas H1 fosforiladas, utilizando RP-HPLC con una columna C4 de Nucleosil 300-5; en este caso, la cromatografia se realizo durante 35 min, a un flujo de 1,5 mil/min, con un gradiente lineal de acetonitrilo. En este gradiente, se utilizo como solvente A 0,1% de TFA y como solvente B 70% de acetonitrilo y 0,1% TFA; el gradiente empezo con 53% de A y 47% de B; la concentracion de B aumento linealmente de 47 a 55% en 35 min. Con esta cromatografia, las histonas se separaron en dos picos: en el primero, se separo la H1b, y el segundo correspondio a una mezcla de los otros subtipos. Para separar los subtipos de la mezcla, se utilizo una cromatografia liquida de interaccion hidrofilica (49).

Otra contrastacion se realizo con el trabajo de investigadores que utilizaron celulas 3T3 de raton para separar las histonas H1, H1b, H1c y H1e; ademas, separaron las histonas totales con un gradiente lineal creciente de tampon A (0,1% TFA y 95% de acetonitrilo). Los pasos del gradiente fueron: 0,1-25% durante 10 min, 25-30% durante 15 min, 30-55% durante 100 min y 55-90% durante 5 min (42).

En ninguno de los casos descritos se logro la purificacion completa de los 5 subtipos somaticos de histona H1. En cada uno de estos trabajos, el material de partida, los gradientes y los tiempos de elucion fueron diferentes; estas variables pueden influir en la separacion de cada uno de los subtipos. Como consecuencia, los protocolos de purificacion por HPLC varian; esta situacion hace necesaria su optimizacion en cada caso.

En resumen, se sabe que las tecnicas cromatograficas no permiten la purificacion simultanea de todos los subtipos de la histona H1 y sus formas modificadas (49). Generalmente, se requieren sistemas cromatograficos combinados. Por este motivo, en esta investigacion se realizaron diferentes tipos de cromatografia para la purificacion de los subtipos H1a, b, c, e y H1. Primero, se uso la cromatografia de intercambio cationico con CM-S, para purificar la H1 total, a partir de cerebro de rata. La purificacion por este metodo, que utilizo el gradiente lineal de NaCl, evita el tratamiento de las proteinas con acido perclorico o acido clorhidrico, sistemas mas usados para su extraccion, protegiendo, de esta manera, la desestructuracion del dominio globular (51).

En segundo lugar, se utilizo la cromatografia de filtracion en gel, la cual permitio la separacion de la histona H1 de las demas histonas de manera completamente pura. La histona H1 se obtuvo a partir de ratas con mas de 30 dias de edad, debido a que este es el periodo del desarrollo durante el cual se acumula mayor cantidad de H1 en neuronas en proceso de diferenciacion (40).

Por ultimo, se uso RP-HPLC para la purificacion de las histonas H1a, b, c, e. Algunos autores (43, 49) han descrito que este metodo permite la separacion de formas modificadas y no modificadas de las histonas y tambien la separacion parcial de varios subtipos de histona H1 y sus formas fosforiladas. En comparacion con el proceso de filtracion en gel para purificar la H1, la RP-HPLC tiene importantes ventajas como el tiempo de duracion de la cromatografia y los componentes de la fase movil, que protegen las proteinas de procesos de desnaturalizacion.

Prediccion de estructura secundaria a partir de los espectros de dicroismo circular

De los porcentajes de helice-alfa para cada uno de los subtipos estudiados (Tabla 2), se deduce que los espectros de DC de cada uno de los subtipos en tampon fosfato 10 mM presentan un espectro caracteristico de helice-alfa, aunque en muy bajo porcentaje, debido posiblemente a que los iones fosfato en la disolucion estabilizan parcialmente las regiones helicoidales del dominio globular de las proteinas (33). Si se compara el valor de elipticidad molar de los diferentes subtipos, se observa que la H1b es el subtipo que menos se estructura en tampon fosfato, mientras que el subtipo que mas se estructura es H1c.

Al incrementar progresivamente el porcentaje de TFE, los valores de elipticidad molar, a menos de 200 nm, aumentan progresivamente hasta hacerse claramente positivos, mientras que los valores entre 208 y 230 nm disminuyen, formandose dos minimos, uno entre 205 y 208 nm y el otro a 222 nm. Estos cambios indican que el TFE induce cada vez mas un espectro tipico de estructura en helice-alfa e incrementa el contenido de helice-alfa, posiblemente porque estabiliza los puentes de hidrogeno intramoleculares entre los aminoacidos (20).

Al comparar los porcentajes de helice-alfa calculados (Tabla 2) se observa variabilidad en los valores obtenidos a partir de la elipticidad molar a 193 nm, la elipticidad molar a 222 nm y el programa de deconvolucion K2D. Esta variabilidad en el porcentaje de helice-alfa segun el modelo matematico utilizado, ha sido ampliamente reflejada en la literatura, al no existir un metodo claramente establecido (20, 30, 31, 52, 53). Asi, para Pintar et al. (52), los porcentajes de helice-alfa obtenidos a partir de la elipticidad a 222 nm son afectados por la presencia de otras conformaciones (distintas a las de helice) y por la contribucion de residuos aromaticos. Algunos autores han establecido un metodo para el calculo del porcentaje de helice-alfa en peptidos, a partir del valor de elipticidad molar a 193 nm, con el fin de corregir el error producido por la presencia de anillos aromaticos (30). En el caso de los programas de deconvolucion, el problema radica en saber hasta que punto las proteinas de la base de datos del programa son adecuadas para las proteinas en estudio. En la determinacion de contenido de helice-alfa a partir de espectros de DC realizados con distintos metodos, se obtienen diferencias de mas del 50% (52).

La variabilidad de los porcentajes, debido a los distintos modelos utilizados, es del mismo orden que las diferencias encontradas en los porcentajes de helice-alfa entre los diferentes subtipos. En consecuencia, estas diferencias de porcentajes entre los distintos subtipos no se pueden considerar significativas. No obstante, podemos observar que la H1c presento siempre un mayor contenido de helice-alfa en tampon fosfato, en los distintos porcentajes de TFE y en presencia de NaCl.

En estudios anteriores de DC, realizados con subtipos H1 parcialmente purificados (H1bcde, H1a y H1t, en 1 M NaCl y 60% de TFE), se obtuvieron valores de elipticidad molar a 220 nm, similares a los del presente trabajo y se propuso que la helice-alfa observada a 1 M de NaCl se debe tan solo a la estructuracion del dominio globular, mientras que el porcentaje de helice-alfa en presencia de TFE se debe a la induccion de helices-alfa en los dominios terminales (33).

Por otro lado, se ha observado que el TFE incrementa el porcentaje de helice-alfa de la histona H1 y de la histona H5 de pollo mas eficazmente que el NaCl[O.sub.4] y el NaCl (19). Estos autores proponen que la union de los ligandos al ADN estabiliza fragmentos de helice-alfa en los dominios C-terminales de la H1 y de la H5. En este sentido, resultaria interesante estudiar los cambios que se producen en el espectro de DC del ADN, al anadir cada uno de los subtipos de la histona H1 (54).

Por espectroscopia de infrarrojo (IR) se determino la estructura secundaria de los dominios C-terminal de los subtipos H1 y H1t unidos a ADN; el dominio C-terminal tiene poca estructura en solucion acuosa, pero llega a ser extensivamente plegado en interaccion con el ADN, encontrandose elementos de estructura secundaria como helice-alfa, estructura-beta, y giros. La estructura del dominio C-terminal de la H1 unido a ADN muestra dependencia de la concentracion de sal; en concentracion fisiologica de sal, 140 mM, llega a ser altamente estructurado con 24% de helice-alfa, 25% de estructura-beta, 17% de loops abiertos y 33% de giros (15).

Se ha observado que la fosforilacion del DCT de la H1 genera un reordenamiento estructural caracterizado por una disminucion en la proporcion de helice-alfa y un aumento en la proporcion de banda-beta. A una relacion, proteina/ADN (r) (peso/peso) de 0,25 o menos, la helice-alfa disminuye del 24 al 8% y la banda-beta aumenta del 24 al 36% en el DCT fosforilado; a r = 0,5, la helice disminuye hasta una proporcion de 6% y la banda-beta aumenta hasta 46% y cuando, r = 0,7, aproximadamente la proporcion de saturacion, el CTD finalmente se convierte en una proteina todo-beta, sin helice-alfa, 16% de regiones flexibles, 20% de giros y 74% estructura-beta. El DCT de H1e de raton (CH1e) no fosforilado presento una proporcion significativamente mayor de helicealfa (34%) y menor proporcion de estructurabeta (18%). El CH1e fosforilado presento menor cantidad de helice-alfa, que de estructura-beta; pero a diferencia del DCT de H1, el CH1e completamente fosforilado conserva una proporcion significativa de helice-alfa (17%) y el aumento de estructura fue menos pronunciado (55%) (25).

Se ha estudiado el efecto de detergentes neutros, Brij 35 y Triton X-100, y detergente anionico, SDS, sobre la estructura secundaria del DCT de histona H1, por espectroscopia de IR a concentracion de sal fisiologica (140 mM NaCl). En presencia de TritonX-100, las proporciones de motivos de estructura secundaria encontrados son 34% de giros, 27% de helice-alfa, 19% plegamientos al azar y regiones flexibles y 20% de estructura-beta. En presencia de SDS, las proporciones son similares con 38% de giros, 26% de helice-alfa, 16% de plegamientos al azar y flexibles y 20% estructura-beta. Debido a su caracter anionico, el SDS es capaz de realizar interacciones electrostaticas e hidrofobas (27).

El porcentaje de helice-alfa en TFE al 60% encontrado en este trabajo, desde 19,41% para H1 hasta 30,68% para H1c a 222 nm (Tabla 2), es semejante al porcentaje de helice-alfa encontrado en el C-terminal de la H1 unido al ADN (15, 25) y unido a detergentes (27). Este hallazgo aporta a la hipotesis de que en presencia de TFE la estructuracion en helice-alfa de las histonas H1 se debe a los dominios C-terminales.

Ahora bien, las relaciones R1 y R2 son pruebas utiles para determinar la cantidad relativa de helice-alfa presente en dos o mas proteinas similares, y son caracteristicos de la forma del espectro. Ademas, proporcionan bases precisas para la comparacion de la cantidad de helice-alfa presente, independiente de la concentracion de las proteinas (31). Teniendo en cuenta estos criterios, se calcularon los valores R1 y R2 para todos los subtipos en las diferentes condiciones. Los subtipos H1, H1a, H1b y H1e presentaron un valor positivo de R1 en TP 10 mM, mientras que para la H1c es negativo (Figura 6). En TFE, al 20%, R1 es negativo para todos los subtipos, y al incrementar el TFE al 40% y al 60% los valores se hacen cada vez mas negativos. Ademas, se observa que el cambio mas significativo sucede cuando la concentracion de TFE pasa del 20% al 40% (Figura 6).

[FIGURA 6 OMITIR]

R1 es positivo cuando la [q] maxima y la [q] minima son negativas e indica bajos niveles de formacion de helice-alfa. Cuando la [q] maxima es positiva y la [q] minima es negativa, R1 disminuye, lo cual indica que el contenido de helice-alfa aumenta; estos valores confirman que, a medida que se incrementa el porcentaje de TFE en cada uno de los subtipos, aumenta el porcentaje de helice-alfa; a medida que los valores R2 se acercan a 1 aumenta el contenido de helice-alfa. Teniendo en cuenta los valores R1 y R2, los subtipos con mayor contenido de helice-alfa son la H1a y la H1c.

Se han realizado muchos estudios sobre la estructura secundaria de peptidos correspondientes a los dominios N y C-terminales (23), sobre la estructura del DCT desfosforilado, del DCT fosforilado, sobre complejos ADN-DCT, DCT-aglomerantes, DCT-detergentes (15, 25, 27), pero muy pocos estudios con los subtipos completos, como el realizado por infrarrojo en presencia de detergentes (27). En este sentido, los resultados de esta investigacion son importantes porque contribuyen a la comprension de la estructura secundaria de subtipos de la histona H1 completos.

Por ultimo, los resultados indican que los porcentajes de helice-alfa son similares en los metodos estudiados; sin embargo, se observaron pequenas diferencias que podrian ser importantes en la diferenciacion funcional de los subtipos, junto a otras variables como la longitud de los dominios, el numero y la distribucion de cargas y las diferentes afinidades por el ADN y la cromatina.

DOI: 10.17151/biosa.2015.14.2.4

Recibido: abril 14 de 2015-Aceptado: agosto 24 de 2015.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento a todas las personas que colaboraron con el desarrollo de este trabajo.

FINANCIACION

Este trabajo fue patrocinado por el Ministerio de Educacion y Ciencia (Espana), Grant BFU200502143.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran que no existe ningun conflicto de interes.

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Mary Orrego Cardozo [2]

Inma Ponte [3]

Pedro Suau [4]

[1] Trabajo realizado en el grupo de investigacion Expresion Genica del Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular de la Facultad de Biociencias de la Universidad Autonoma de Barcelona, Espana.

[2] Ph.D. en Bioquimica y Biologia Molecular. Docente Investigadora Universidad Autonoma de Manizales--Docente Catedratica Universidad Nacional de Colombia, sede Manizales. Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular, Facultad de Biociencias, Universidad Autonoma de Barcelona. Barcelona, Espana. Autor para correspondencia. Correo electronico: morregoc@unal.edu.co--maryorrego@autonoma.edu.co

[3] Ph.D. en Biologia. Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular, Facultad de Biociencias, Universidad Autonoma de Barcelona. Barcelona, Espana. Correo electronico: inma.ponte@uab.es

[4] Ph.D. en Ciencias Biologicas. Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular, Facultad de Biociencias, Universidad Autonoma de Barcelona. Barcelona, Espana. Correo electronico: pere.suau@uab.es

[5] Una caracteristica del acido acetico es que inhibe el proceso de polimerizacion, razon por la cual es necesario utilizar mayor cantidad de TEMED que en PAGE-SDS.
Tabla 1. Caracteristicas de subtipos de la H1. PM: pesos
moleculares; No. aa total: numero de aminoacidos totales; No. aa N-ter:
numero de aminoacidos del dominio N-terminal; No. aa Globular: numero
de aminoacidos del dominio globular; Noaa C-ter: numero de
aminoacidos del dominio C-terminal; y punto isoelectrico (17, 18).

Histona           PM      No. aa  No. aa
                          total   N-ter

H1 raton       20716,30    193     20
H1 rata        20755,40    193     20
H1 humano      20733,50    193     20
H1 raton       21655,70    212     34
H1 humano      21713,00    214     35
H1b raton      22477,30    222     32
H1b humano     22181,30    222     35
H1c raton      21137,70    211     32
H1c humano     21235,70    212     32
H1d raton      21970,90    220     33
H1d humano     22221,10    220     33
H1e raton      21848,70    218     32
H1e rata       21858,80    218     32
H1e humano     21736,70    218     32

Histona          No.aa     No.aa     Punto
               Globular   C-ter   isoelectrico

H1 raton          76       97        10,98
H1 rata           76       97        10,91
H1 humano         76       97        10,85
H1a raton         76       102       10,93
H1a humano        76       103       11,00
H1b raton         76       114       10,91
H1b humano        76       111       10,90
H1c raton         76       103       11,00
H1c humano        76       104       10,94
H1d raton         76       111       11,03
H1d humano        76       111       11,03
H1e raton         76       110       11,11
H1e rata          76       110       11,11
H1e humano        76       110       11,03

Tabla 2. Porcentaje de helice-alfa calculado a 193 nm,
222 nm y por el programa K2D.

Histonas                   % helice-   % helice-   % helice-alfa
                             alfa        alfa      Deconvolucion
                           (193 nm)    (222 nm)

H1/TP 10 mM                  6,70        6,81            7
H1/TP 10 mM/20% TFE          13,07       9,74            8
H1/TP 10 mM/40% TFE          22,57       17,31          14
H1/TP 10 mM/60% TFE          29,08       19,41          26
H1/TP 10 mM                              6,81
H1/TP 10 mM/NaCl 150 mM                  6,95
H1/TP 10 mM/NaCl 1M                      7,05
H1a/TP 10 mM                 10,82       10,84           8
H1a/TP 10 mM/20% TFE         16,3        13,17           9
H1a/TP 10 mM/40% TFE         27,23       21,20          24
H1a/TP 10 mM/60% TFE         30,9        24,17          32
H1a/TP 10 mM/NaCl 150 mM                 10,27
H1a/TP 10 mM/NaCl 1M                     10,39
H1b/TP 10 mM                 8,87        4,23            7
H1b/TP 10 mM/20% TFE         12,98       10,80           8
H1b/TP 10 mM/40% TFE         22,29       17,64          17
H1b/TP 10 mM/60% TFE         28,83       22,19          24
H1b/TP 10 mM/NaCl 150 mM                 4,95
H1b/TP 10 mM/NaCl 1 M                    8,86
H1c/TP 10 mM                 8,70        12,04           9
H1c/TP 10 mM/20% TFE         17,00       17,10          24
H1c/TP 10 mM/40% TFE         33,42       30,68          29
H1c/TP 10 mM/60% TFE         41,34       36,04          28
H1c/TP 10 mM/NaCl 150 mM                 13,67
H1c/TP 10 mM/NaCl 1M                     14,85
H1e/TP10 mM                  7,18        10,37           7
H1e/TP10 mM/20% TFE          14,56       14,09          10
H1e/TP10 mM/40% TFE          24,94       21,73          26
H1e/TP10 mM/60% TFE          31,56       27,81          28
H1e/TP10 mM/NaCl 150 mM                  10,15
H1e/TP10 mM/NaCl 1 M                     11,05
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Author:Orrego Cardozo, Mary; Ponte, Inma; Suau, Pedro
Publication:Biosalud
Date:Jul 1, 2015
Words:10131
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