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Caracterizacion de actinobacterias raras, degradadoras de lignocelulosa: Demostracion de actividad lacasa en dos aislados de Tsukamurella sp y Cellulosimicrobium sp.

Characterization of lignocelluloses-degrading rare actinobacteria: Demonstration of laccase activity in two isolates of Tsukamurella sp AND Cellulosimicrobium sp

Introduccion

Los altos contenidos en celulosa de la biomasa vegetal (>45%, peso seco) son una excelente materia prima potencial para la obtencion de biocombustibles y otros compuestos organicos (Lynd et ai, 1999). No obstante, el aprovechamiento industrial de la biomasa lignocelulosica no ha alcanzado su punto de madurez en razon a las propiedades fisicas y quimicas de la lignina y su densa compactacion con la celulosa (Weimer, 1996; Lynd et ai, 1999; Tuomela et ai, 2002). En efecto, la relativa hidrofobicidad de la lignina reduce la permeabilidad de la pared celular vegetal, lo cual obstaculiza su degradacion por agentes biologicos. En consecuencia, la industria ha recurrido al desarrollo de procesos quimicos de deslignificacion; sin embargo, los investigadores en biotecnologia estan impulsando el desarrollo de metodos biotecnologicos de despolimerizacion de la lignina (Lynd et ai, 2002).

La lignina no es digerible por los animales pero si por hongos y bacterias secretoras de enzimas que pueden degradar el polimero. Aunque se ha utilizado el termino generico "ligninasa", es preferible referirse a "enzimas modificadoras de lignina" (lignin-modifying enzymes o LMEs) ya que no catalizan reacciones hidroliticas sino oxidativas (Winquist et ai, 2008). Las LMEs comprenden las peroxidasas y muchas fenol-oxidasas del tipo lacasas (Shah y Nerud, 2002).

Las lacasas (1,2-benzenediol:oxigeno oxidorreductasa, EC 1.10.3.2) son oxidasas de una variedad de compuestos aromaticos (p-difenoles) y se caracterizan por poseer 3 centros cataliticos: Un centro T1, mononuclear, se encarga de la oxidacion del sustrato, mientras que dos centros T2 y T3, forman un centro trinuclear, el cual se encarga de reducir el oxigeno molecular a agua (Alcalde y Bulter, 2003; Arias et ai, 2003). Entre los sustratos naturales de las lacasas se incluyen fenoles, polifenoles, anilinas, aril-diaminas, fenoles metoxi-sustituidos, hidroxi-indoles, benzenotioles, compuestos metalicos organicos e inorganicos, entre otros (Kunamneni et ai, 2008a).

Entre las aplicaciones potenciales de las lacasas se encuentran: deslignificacion de biomasa lignocelulosica (Rodriguez et al., 2003); bioblanqueamiento de pulpa de papel (Bourbonnais et al., 1997; Ibarra et al., 2006); tratamiento de aguas residuales industriales (Bergbauer et al., 1991; Berrio et al., 2007); modificacion enzimatica de fibras y blanqueamiento de textiles (Abadulla et al., 2000; Kunamneni et al., 2008b); destoxificacion de contaminantes y biorremediacion (Alcalde et al., 2002); destoxificacion de hidrolizados de lignocelulosa para la produccion de etanol por levaduras (Lopez, 2005) y remocion enzimatica de compuestos fenolicos en el procesamiento de bebidas (Brijwani et al., 2010). El uso de las lacasas en la degradacion de biopolimeros estructurales como la lignina es materia de estudio para el aprovechamiento de gigantescos volumenes de biomasa vegetal residual, e.g., palma africana (Cujia y Bula, 2010).

Las lacasas de origen fungico han sido ampliamente estudiadas y en la actualidad tienen usos biotecnologicos (Rodriguez et ai, 2003; Kiiskinen et ai, 2004). No obstante, son escasas las lacasas bacterianas que han sido caracterizadas bioquimicamente in extenso, e.g., Streptomyces cyaneus, S. viridosporus, Bacillus subtilis, Pseudomonas desmolyticum y Azospirillum lipoferum (Faure et ai, 1995; Berrocal et ai, 1997; Diamantidis et ai, 2000; Martins et ai, 2002; Claus, 2003 y 2004). El analisis bioinformatico de las secuencias alojadas en Genbank predice la existencia y amplia distribucion de enzimas con actividad lacasa en procariotas (Alexandre y Zhulin, 2000; Hernandez-Torres et ai, 2006).

En este articulo describimos el aislamiento y la identificacion morfologica y molecular de dos cepas de actinobacterias raras con actividad lacasa. Se evaluo su capacidad para oxidar guayacol en pruebas cualitativas, y cuantitativamente ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) en paralelo con curvas de crecimiento. Los resultados obtenidos permiten concluir que los dos aislados tienen un gran potencial en la busqueda de nuevos genes con actividad lacasa, de importancia para la industria biotecnologica.

Materiales y metodos

Aislamiento primario de microorganismos

Se tomaron muestras de suelo (2-5 cm de profundidad) y materia organica vegetal en descomposicion, a partir de zonas agricolas de los Municipios de Abrego (Norte de Santander [N. de S.] 1380 msnm) y alrededores de la Meseta de Bucaramanga (Santander [S.] 1000 msnm). Se llevo a cabo un aislamiento selectivo de actinobacterias segun Seong et ai, (2001). Diez gramos de cada muestra fueron sometidos a calor humedo (70 [grados]C) por 15 min. Posteriormente, las muestras fueron transferidas a un recipiente con 50 ml de 1,5% fenol, homogenizadas e incubadas a temperatura ambiente durante 2 h. De las suspensiones fenolicas se realizaron diluciones seriadas hasta [10.sup.-6] en solucion salina esteril y se sembraron por diseminacion en Agar CYC pH 7.0 (Agar Czapek-Dox-Extracto de Levadura-Casaminoacidos, Ramirez y Coha, 2003). Los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente ([+ o -]25 [grados]C), por 14 d. Se obtuvieron cultivos axenicos mediante resiembras en agar para aislamiento de actinobacterias (Difco).

Deteccion de actividad lacasa

Las pruebas cualitativas para lacasas extracelulares se realizaron siguiendo la oxidacion de guayacol en medio mineral basal MBC (0.1% K[H.sub.2]P[O.sub.4], 0.4% [Na.sub.2]HP[O.sub.4]-7[H.sub.2]0, 0.02% NaCl, 0.02% MgS[O.sub.4]- 7[H.sub.2]0, y 0.005% Ca[Cl.sub.2]x2[H.sub.2]0 suplementado con 5 g/L carboximetilcelulosa (CMC, Sigma) como unica fuente de carbono) (Crawford, 1978), con presencia de iones [Cu.sup.2+] (Gnanamani et al., 2006), durante 48 h. Se aplicaron los siguientes tratamientos, con la adicion de: i) 10 mM guayacol sin CuS[O.sub.4] [Control 1]; ii) 2 mM CuS[O.sub.4] sin guayacol [Control 2]; iii) 10 mM guayacol y 1 mM CuS[O.sub.4]; iv) 10 mM guayacol y 2 mM CuS[O.sub.4]; v) 10 mM guayacol y 5 mM CuS[O.sub.4].

Determinacion morfologica

Para la determinacion de las caracteristicas morfologicas se realizaron siembras en Agar Czapek-Dox (Muiru et al., 2008). Los medios fueron dispensados en cajas de Petri esteriles e incubados a 37 [grados]C >24 h para facilitar el secado y controlar la esterilidad. Los cultivos fueron incubados a 25 [grados]C (AC1) y 37 [grados]C (AC18). Para la determinacion de las caracteristicas microscopicas, se realizo tincion de Gram y de Wirtz-Conklin con 0,1% verde de malaquita y 0,5% safranina (Schaeffer y MacDonald, 1933).

Analisis de las secuencias del gen 16S rRNA

Se amplifico parcialmente el gen de la subunidad pequena del RNA ribosomal, por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleotidos asi: para AC01, F243 (Heuer et ai, 1997) y ACT1159R (Blackwood et al, 2005); para AC18, EUB338F (Guo et ai, 2008) y ACT1159R. La mezcla de reaccion de 25 |i contenia 50 ng de DNA total, bufer 1X flexible, 2,0 mM Mg[Cl.sub.2], 0,4 mM dNTPs, 0,4 mM de cada cebador y 1,25 U de Taq ADN polimerasa (Promega). Las rutinas de PCR se realizaron con una desnaturalizacion inicial a 94 [grados]C durante 3 min, seguido por 30 ciclos de 1 min a 94 [grados]C, 1 min a 60 [grados]C y 1 min a 72 [grados]C, y una extension final a 72 [grados]C durante 5 min en un termociclador Max Pro (ESCO). Los productos de PCR fueron verificados en geles de 0,8% agarosa tenidos con bromuro de etidio. Los amplificados (~500 ng) se purificaron con el kit PCR System Clean-Up (Promega[R]) y enviados a la empresa Macrogen (Corea) para su secuenciacion.

Ensayos de actividad lacasa en cultivo sumergido

Las cepas AC01 y AC18 fueron precultivadas durante 72 h en 30 g/L Caldo Tripticasa (Merck). Se inocularon 40 ml de suspension celular en biorreactores provistos de 360 ml de medio mineral basal MBC suplementado con 10 g/L CMC, 100 Ul/ml nistatina, 0,1% lignina alcali y 2 mM CuS[O.sub.4] adicionado a 48 h de incubacion (Ramirez y Coha, 2003). Los cultivos fueron incubados a [+ o -]25 [grados]C por 7 d, con aireacion y agitacion constantes. Luego se centrifugaron a 1600 g hasta alcanzar un volumen de sedimento de 5 ml, por triplicado para cada aislado. Las celulas fueron resuspendidas con 35 ml de medio mineral basal MBC para un volumen final de 40 ml. Cada triplicado de suspension celular fue utilizado para la inoculacion de 3 biorreactores de 500 ml, cada uno provisto de 360 ml de medio MBC suplementado con 10 g/L CMC, 100 Ul/ml nistatina, 0,1% lignina alcali y 2 mM CuS[O.sub.4]. Los cultivos fueron incubados a 28 [grados]C por 7 d. Cada 24 h se extrajeron alicuotas de 20 ml para monitorear el crecimiento bacteriano a 620 nm y efectuar los ensayos de actividad lacasa.

De cada inoculo, 10 ml de cultivo sumergido se centrifugaron a 10.000 g por 20 min a 4 [grados]C. El incremento de ABTS oxidado se midio a 405 nm (Wang y Ng, 2006), usando un lector de placas multipozos Anthos 2020. La mezcla de reaccion consistio de 15 [micron]L de sobrenadante, 85 [micron]L de bufer 0,2 M acetato de sodio pH 4,5 y 100 [micron]L de 10 mM ABTS (Sigma). Una unidad de actividad enzimatica fue definida como la cantidad de enzima que cataliza la oxidacion de 1 |mol de ABTS en 1 min. Para el calculo de la actividad lacasa se utilizo un coeficiente de extincion molar de 35.000 [M.sup.-1][cm.sup.-1] para el ABTS oxidado.

Resultados

Aislamiento primario de microorganismos

Para la provision de actinobacterias degradadoras de lignocelulosa, se aplico el metodo de aislamiento de Seong et ai, (2001). Este procedimiento, basado en la incubacion de las muestras de suelo a 70 [grados]C por 15 min y posterior tratamiento con fenol, garantiza la seleccion de actinobacterias raras del suelo, por la supervivencia de las esporas a tales condiciones.

Se aislaron 20 cepas bacterianas (AC1-AC20) capaces de crecer sobre medio mineral basal MBC con carboximetilcelulosa como unica fuente de carbono. Varias cepas se destacaron por una proliferacion abundante sobre este medio de cultivo. En la figura 1 se muestran detalles morfologicos de los aislados AC01, procedente de Abrego (N. de S.) y AC18, nativa de los alrededores de la Meseta de Bucaramanga (S.). A juzgar por el crecimiento en las condiciones nutricionales restrictivas, se concluyo que los aislados expresaban actividades celuloliticas.

Deteccion de actividad lacasa en los aislados

La actividad lacasa puede evidenciarse en bioensayos con lignina como unica fuente de carbono, aunque los ensayos analiticos para determinacion de lignina los hacen dispendiosos. No obstante, otros compuestos organicos como el guayacol, empleado en este trabajo, tambien son sustratos de las enzimas modificadoras de lignina y la actividad se revela facilmente por un cambio de coloracion del medio de cultivo a purpura (Winquist et ai, 2008).

De acuerdo con la literatura cientifica, los iones [Cu.sup.2+] tienen un efecto regulador positivo en la expresion de las lacasas de los hongos ligninoliticos Pleurotus ostreatus (Palmieri et al., 2000), P. pulmonarius (Tychanowicz et ai, 2006), Lentinus (Panus) tigrinus (Shutova et al., 2008), Trametes versicolor (Collins y Dobson, 1997), entre otros. Por esta razon, inicialmente se hicieron ensayos de determinacion cualitativa de actividad lacasa de todos los aislados celuloliticos, a las concentraciones de 0, 1, 2 y 5 mM CuS[O.sub.4] y 10 mM guayacol. Los cultivos con los debidos controles demostraron que la coloracion purpura se debe a la presencia indispensable de iones [Cu.sup.2+] y de guayacol (tabla 1). A 5 mM, la actividad tiende a disminuir (cepas AC04 y AC07). Excepcionalmente, se pudo apreciar que en comparacion con los otros 16 aislados positivos, la cepa AC18 exhibio una actividad lacasa precoz a 1 mM de iones [Cu.sup.2+], la cual se constata aun a 5 mM CuS[O.sub.4]. Esta etapa de calibracion de la concentracion de CuS[O.sub.4] permitio concluir que la concentracion de 2 mM parece ser la mas apropiada para obtener una fuerte actividad oxidativa del guayacol con las cepas aisladas. Por provenir de muestras de suelo distintas y generar un mayor producto coloreado, las cepas AC01 y AC18 (tabla 1) fueron seleccionadas para una caracterizacion morfologica y molecular detalladas.

Identificacion bacteriana

El metodo de aislamiento empleado, especifico para actinobacterias, impone un filtro de seleccion de las especies bacterianas a obtener (Seong et ai, 2001). Como era de esperarse, las pruebas morfologicas y moleculares aplicadas a las cepas AC01 y AC18 apuntan a que esos dos aislados pertenecen al phylum Actinobacteria, orden Actinomycetales.

Las caracteristicas morfologicas de la cepa AC01 en cultivo sobre medio Agar CYC, fueron las siguientes: colonias de consistencia blanda, aspecto brillante, forma elevada convexa, superficie rugosa, borde irregular, color blanco (anverso y reverso), sin hifas aereas ni produccion de pigmento melanoide (figuras 1A y 1B). Microscopicamente, mostro ser Gram variable, positiva en cultivos frescos con perdida de la coloracion en cultivos envejecidos (figura 1C). Celulas aerobias, en forma de cocobacilos de [aproximadamente igual a]2 [micron]m, sin movilidad, filamentos en grupos de 3 a 6 celulas, micelio septado, formadoras de esporas (figura 1D). Las busquedas mediante BlastN (Altschul et ai, 1990) con la secuencia parcial del gen 16S rRNA (944 pb, segmentos hipervariables V2 a V7 (Chakravorty et ai, 2007)) arrojo la mayor identidad con gran cantidad de especies del genero Tsukamurella (97-99%) y unas pocas del genero Rhodococcus (95-96%). La aplicacion Sequence Match de la Ribosomal Database (Cole et ai, 2009) encontro homologos exclusivamente del genero Tsukamurella con un score de similaridad de 0,948. Una busqueda en Genbank de lacasas dentro de la familia Tsukamurellaceae con la secuencia de CotA de B subtilis (la lacasa bacteriana mejor caracterizada), arrojo la presencia de oxidasas multicobre potenciales, con un E value de 1e-42. Curiosamente, busquedas BlastP y BlastN con las secuencias de lacasas tipicas de actinobacterias como Streptomyces lavendulae y la pequena lacasa de Streptomyces coelicolor (Machczynski et al., 2004) no produjeron ningun resultado.

Por otra parte, las caracteristicas morfologicas de la cepa AC18 en cultivo sobre medio Agar CYC fueron: colonias de consistencia cremosa, aspecto brillante, forma elevada, superficie irregular con formacion de crater, borde irregular, color blanco, sin hifas aereas y sin produccion de pigmento melanoide (figuras 1E y 1F). A diferencia de los demas aislados, esta cepa mostro un crecimiento mas rapido a 37 [grados]C que a 25 [grados]C. Microscopicamente, mostro ser Gram variable, celulas aerobias, en forma de bacilos pequenos [aproximadamente igual a]1.5 x 0.8 [micron]m (figura 1G), sin movilidad, con formacion de esporas y cadenas largas de conidios (figura 1H). BlastN capturo secuencias unicamente del genero Cellulosimicrobium con una identidad de 99% (832 pb, segmentos hipervariables V3 a V7). Asi mismo, Sequence Match de la RDP encontro homologos exclusivamente del genero Cellulosimicrobium con un score de similaridad de 0,889. Busquedas BlastP y BlastN con las diversas lacasas bacterianas y fungicas no arrojaron E values los suficientemente bajos, relacionados con el genero Cellulosimicrobium.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Ensayos de actividad lacasa

Se realizaron pruebas de actividad lacasa a sobrenadantes de cultivos sumergidos de los aislados seleccionados, i.e., cepas AC01 y AC18. Ambas cepas presentaron una fase de latencia hasta el dia 3 y una fase exponencial hasta el dia 5. Durante los dias siguientes, ambos cultivos se encaminaron hacia la fase estacionaria (figura 2).

La actividad de las lacasas extracelulares expresadas en cultivos sumergidos se cuantifico con base en la oxidacion de 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) (ABTS). En estos ensayos enzimaticos, la oxidacion del ABTS se manifiesta por la aparicion de un color verde oscuro brillante en la mezcla de reaccion (figura 3). Como puede apreciarse en la figura 2A, el aislado AC01 revelo una actividad lacasa detectable desde 24 h de cultivo (2 U/L). En los dias siguientes, la actividad se incremento rapidamente hasta un valor maximo de 108 U/L (dia 6) y decrecio en 24 h a 60 U/L con el alcance de la fase estacionaria. La cepa AC18 presento el mismo comportamiento enzimatico, aunque sorpresivamente los valores de actividad lacasa fueron muy bajos. En efecto, la actividad se hace detectable junto con el crecimiento, el dia 3 con 4 x 10-2 U/L y aumento rapidamente hasta alcanzar un valor maximo de tan solo 0,56 U/L el dia 6. Al igual que la cepa AC01, la estabilizacion del cultivo en la fase estacionaria tiene un efecto negativo y en 24 h la actividad decrece a alrededor de 0,4 U/L (figura 2B). En la figura 3 se aprecia el cambio de coloracion que sufre el ABTS, como producto de la actividad lacasa de la cepa AC01.

Discusion

En este trabajo se logro el aislamiento de 20 cepas celuloliticas, 17 de ellas tambien degradadoras de lignina, y la caracterizacion morfologica, molecular y funcional de la actividad lacasa de dos de ellas. Como se pudo apreciar, el protocolo de aislamiento de actinobacterias raras del suelo es muy eficiente en cuanto a su selectividad. No puede descartarse que las tres cepas celuloliticas restantes ostenten actividad ligninolitica, ya que podrian requerir condiciones nutricionales o ambientales especificas (D'Zouza-Ticlo et ai, 2006; Zak et al., 2011). Son pocos los generos bacterianos a los cuales se les ha comprobado la actividad lacasa, la mayoria de ellos de Actinobacteria, las bacterias mas abundantes del humus de los bosques (Stevenson, 1994).

La actividad ligninolitica de los aislados quedo demostrada por la biotransformacion del guayacol y del ABTS. Esta bien documentado que el guayacol y el [Cu.sup.2+] inducen la expresion de genes que codifican para diferentes isoenzimas de lacasa (Collins y Dobson, 1997; Palmieri et ai, 2000, Terron et ai, 2004). La presencia de iones [Cu.sup.2+] en el medio de cultivo es una condicion esencial para que ocurra la expresion de las lacasas, debido a que esta enzima pertenece a la familia de proteinas multicobre (Claus, 2004). No obstante, se pudo constatar que concentraciones alrededor de 5 mM CuS[O.sub.4] lograron ser inhibitorias del crecimiento bacteriano y de la actividad lacasa, en 2 de 3 cepas (tabla 1). El efecto del cobre en dosis toxicas ha sido previamente reportado (Gordon et al., 1994; Tychanowicz et ai, 2006, Patel et al, 2009).

Los dos aislados escogidos por su alta expresion de lacasas en las pruebas cualitativas, resultaron ser actinobacterias poco estudiadas. Las caracteristicas morfologicas, asi como los analisis del gen 16S rRNA, hacen coincidir el aislado AC01 con el genero Tsukamurella (Collins et al., 1988). Dos especies (T. pseudospumae y T spumae) se han aislado de lodos activados (Nam et al, 2003; Nam et al, 2004), otras mas de muestras clinicas (Nam et al, 2004) y recientemente, T soli, una especie aislada del suelo (Weon et al., 2010). Es muy escasa la literatura cientifica relacionando el genero Tsukamurella con las lacasas. Ademas, el hecho de que en Genbank no se encuentren proteinas homologas de las lacasas tipicas hace suponer que esta especie podria albergar una nueva variedad isoenzimatica.

[FIGURA 3 OMITIR]

De otro lado, los resultados obtenidos permiten concluir que el aislado AC18 muy probablemente sea un representante del genero Cellulosimicrobium. Aunque de nuevo, existe poca literatura vinculando las lacasas con este genero (Mishra y Lata., 2007), es de presumir que las contienen, pues no es sorprendente encontrarlo como agente de biodegradacion del humus boscoso (Yoon et al., 2007; Lo et al., 2009). Esta cepa llama la atencion por su resistencia a altos niveles de cobre, que como se expreso anteriormente, son normalmente toxicos (tabla 1). Sin embargo, no es la unica, pues ya se han reportado casos individuales de actinobacterias tolerantes a valores alrededor de 25 mM CuS[O.sub.4] (Albarracin et al., 2005). Por otra parte, AC18 se destaco igualmente por un crecimiento rapido y abundante a 37 [grados]C sobre medio solido, a diferencia de 25 [grados]C de los demas aislados. Si bien la temperatura optima establecida para el crecimiento de especies de este genero es de [+ o -] 28 [grados]C, e.g., C variabile (Bakalidou et al., 2002) y C terreum (Yoon et al., 2007), otras especies como C funkei (Brown et al, 2006) y C cellulans (Heym et al, 2005; Rowlinson et al., 2006) pueden tolerar e incluso preferir temperaturas mayores (Yoon et al, 2007), pues se han encontrado como agentes infecciosos en humanos inmunosuprimidos.

Los valores de transformacion del ABTS en cultivo sumergido se encuentran dentro de los rangos previamente identificados para basidiomicetos y actinobacterias (Srinivasan et al., 1995; Niladevi y Prema, 2005; Gomes et al, 2009). Sorprenden las cifras extremadamente bajas del aislado AC18 (Cellulosimicrobium sp), cuando en las pruebas cualitativas con guayacol se esbozaba como una de las mas interesantes para caracterizar, por su precocidad en la expresion de la actividad lacasa y su resistencia a altos niveles de cobre (tabla 1). Es claro que ocurrio un efecto inhibidor durante la linea de tiempo del cultivo y aunque la explicacion de este fenomeno requiere de nuevas pruebas de laboratorio, es de considerar la posibilidad de que exista una especificidad de sustrato, como ha sido demostrado de manera muy similar en Pleurotus ostreatus (Mansur et al., 2003) y Lentinus edodes (D'Annibale et ai, 1996) o de inductor de la expresion en Trametes sp. A[H.sub.2]8-2 (Xiao et ai, 2004).

Tomados en conjunto todos los resultados, podemos concluir que hemos aislado y caracterizado dos cepas de actinobacterias raras, interesantes por su actividad lignocelulosica. Detallados estudios bioquimicos y de la expresion y regulacion de la actividad lacasa podrian revelar su potencial cientifico y biotecnologico.

Conclusiones

Se demostro el aislamiento selectivo de cepas bacterianas secretoras de lacasas, de las cuales dos generos de actinobacterias raras del suelo fueron caracterizados: Tsukamurella sp y Cellulosimicrobium sp. Los dos aislados ostentan caracteristicas microbiologicas y funcionales que las relacionan con la biodegradacion de lignocelulosa. Como es practicamente nula la literatura cientifica sobre estos dos generos y su actividad secretora de lacasa, este trabajo hace un aporte significativo al conocimiento de la microbiota involucrada en la biodegradacion del material vegetal. La caracterizacion bioquimica de las posibles nuevas isoformas de lacasas aqui reportadas podria revelar el papel que cumplen estos microorganismos en la degradacion de la lignocelulosa y su potencial uso biotecnologico.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Vicerrectoria de Investigaciones y Extension de la Universidad Industrial de Santander, por su apoyo financiero y logistico en el marco del proyecto de investigacion "Biotratamiento de residuos lignocelulosicos por fermentacion sobre sustrato solido mediante el uso de actinobacterias con actividad lacasa extracelular".

Recibido: enero 2 de 2012

Aprobado: noviembre 25 de 2012

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Enrique Luis Revolto Escudero*, Oriana Danuta Serna Daza*, Jorge Hernandez Torres*, **

* Centro de Innovacion en Biotecnologia Industrial y Biologia Molecular (CINBIN), Universidad Industrial de Santander, Sede de la UIS en Guatiguara, Km 2 via al Refugio, Piedecuesta (Santander), Colombia.

** Autor para correspondencia: Jorge Hernandez Torres, M.Sc., Ph.D., hernanj@uis.edu.co
Tabla 1. Determinacion cualitativa
de actividad lacasa de los aislados,
segun oxidacion de 10 mM guayacol.

Cepa           mM CuSO4       SG

        0    1     2     5

AC 01   -    +    +++   ND    -
AC 02   -    +    +++   ND    -
AC 03   -    +    +++   ND    -
AC 04   -    +    +++   ++    -
AC 05   -    +    +++   ND    -
AC 06   -    +    +++   ND    -
AC 07   -    +    +++   ++    -
AC 08   -    +    +++   ND    -
AC 09   -    +    ++    ND    -
AC 10   -    -     -    ND    -
AC 11   -    -     -    ND    -
AC 12   -    +    +++   ND    -
AC 13   -    +    +++   ND    -
AC 14   -    +    +++   ND    -
AC 15   -    -    ++    ND    -
AC 16   -    -    ++    ND    -
AC 17   -    +    +++   ND    -
AC 18   -   +++   +++   +++   -
AC 19   -    -     -    ND    -
AC 20   -    -          ND    -

ND: No determinado

SG: Sin guayacol, 2 mM CuSO4
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Revolto Escudero, Enrique Luis; Serna Daza, Oriana Danuta; Hernandez Torres, Jorge
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2012
Words:6403
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