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Caracterizacion biologica y accion de inhibidores de una fosfolipasa [A.sub.2] del veneno de Lachesis muta.

Biological characterization and inhibitors action of Phospholipase [A.sub.2] from Lachesis muta venom

Introduccion

Muchos de los envenenamientos ofidicos que ocurren en la selva alta y baja del Peru son causados por especies de la familia Viperidae, siendo Lachesis muta "Shushupe" la serpiente Crotalinae que ocasiona un cuadro clinico severo, con danos locales y sistemicos como: colico abdominal, diarrea, edema, dolor local intenso, nauseas, anormalidades hemostaticas, hipotension, sangrado, necrosis, signos neurotoxicos, coagulopatias, choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda; todo ello atribuido al complejo enzimatico del veneno.

Dentro de este complejo enzimatico se encuentran las fosfolipasas (EC 3.1.1.4), enzimas hidrolazas de los fosfolipidos que actuan sobre los enlaces acil-ester de una gran variedad de fosfogliceridos. La fosfolipasa [A.sub.2] (PL[A.sub.2]) conocida tambien como fosfatidasa A o lectinasa A, es la fosfolipasa comun en venenos de serpientes. Mas de cien fosfolipasas procedentes de serpientes y de otras fuentes han sido caracterizadas y purificadas (Kini & Evans, 1989). Entre las caracteristicas de esta enzima se conoce el efecto anti-coagulante, hemorragico, inhibidor de la agregacion plaquetaria, neurotoxico, convulsivo y miotoxico, (Soares & Giglio 2003, Kini 2003). Estas enzimas estan involucradas en los procesos fisiopatologicos del reumatismo, osteoartritis, psoriasis, shock septico, sindrome distress respiratorio y asma (Touqui & Alaoui-El-azher 2001, Murakami & Kudo, 2002). Tambien se conoce de efectos bactericidas, anti-HIV, anti-tumoral, antiparasitario y anti-malarico (Soares & Giglio 2003, Kini 2003).

Las homologias estructurales de las fosfolipasas de venenos de serpientes no estan relacionadas con sus efectos biologicos, y puede existir isoformas de PL[A.sub.2] en un mismo veneno con funciones biologicas totalmente distintas, por lo que el estudio de estas proteinas adquiere singular importancia.

Las proteinas aisladas y caracterizadas del veneno de L. muta de Peru son las enzimas similar a trombina (Yarleque et al. 1989), proteinasa (Rodriguez & Yarleque 1990), fibrinogenasa (Escobar 1992) y fosfolipasa (Mejia et al. 2006). Considerando la gran variabilidad de la accion biologica e inmunologica de las fosfolipasas A2 y tomando en cuenta el poco conocimiento de sus inhibidores; en el presente trabajo realizamos un estudio de su accion biologica como: anticoagulante, hemolitica, hemorragica, miotoxica y edematica, asi como estudios de la accion de sus inhibidores y su reactividad inmunogenica frente al antiveneno especifico producido por el Instituto Nacional de Salud-Peru.

Materiales y metodos

Venenos y antiveneno. Se empleo veneno liofilizado de Lachesis muta procedente de Satipo, Junin; mantenidos en cautiverio en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima. El antiveneno fue el suero antilachesico monovalente liquido, producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima.

La cuantificacion de proteinas fue estimada por el metodo de Warburg y Christian, (1941) y por el metodo de Lowry et al. (1951), utilizando como proteina estandar albumina bovina.

La Purificacion de la enzima

Se realizo por el metodo de Mejia et al. (2006) con variaciones. Cien miligramos de veneno liofilizado fueron disueltos en 2 mL de buffer acetato de amonio 0,05M a pH 5,0; se centrifugo a 4000 rpm por 15 min para eliminar los residuos insolubles. El sobrenadante fue aplicado en una resina de intercambio cationico CM-Sephadex C-50 (45 x 1,2 cm), equilibrado con el mismo buffer, colectandose fracciones de 3 mL a razon de 7 mL/h a temperatura ambiente. La elucion de las proteinas retenidas se realizo con el mismo buffer conteniendo NaCl 0,3M y 0,6M respectivamente.

Cada fraccion fue analizada, en cuanto a su actividad enzimatica (Fosfolipasa A2) y las fracciones con mayor actividad fueron reunidas, concentradas y aplicadas a una columna de filtracion Sephadex G-50 (45 x 1,2cm), equilibrado en buffer acetato de amonio 0,05M a pH 5,0 y colectandose fracciones de 1,5 mL a razon de 7 mL/h a temperatura ambiente. Se analizo cada fraccion en su actividad enzimatica reuniendo las fracciones con mayor actividad para su posterior caracterizacion.

Actividad enzimatica de fosfolipasa Se determino la actividad enzimatica empleando los metodos de: Vidal y Stoppani (1971), y el metodo de De Oliveira y Palma (1998).

Propiedades bioquimicas de la enzima

Evaluacion de la pureza y peso molecular, se realizo una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) al 12% en condiciones reductoras y no reductoras de acuerdo al metodo de Laemmli (1970). Se empleo 20 [micron]g de la enzima purificada y como patrones de peso molecular: Lisozima (14300 Da), Inhibidor de tripsina (21500 Da), Ovoalbumina (45000 Da) y Albumina (66000 Da). Adicionalmente la pureza tambien fue evaluada por inmunodifusion e inmunoelectroforesis.

Efecto de inhibidores enzimaticos. Se analizaron los efectos de inhibidores enzimaticos: PMSF, DTT, Iodoacetato, EDTA, TLCK, 2P-Mercaptoetanol, a concentraciones finales de 2,5; 5; 10 y 20 mM. Igualmente se evaluo el efecto de algunos aminoacidos: cisteina, acido aspartico, acido glutamico y el peptido glutation a las mismas concentraciones anteriormente senaladas. Se preincubo la enzima con cada inhibidor por 10 min a 37 [grados]C.

Propiedades biologicas de la enzima

Determinacion de la actividad hemolitica

a) Actividad Hemolitica en Tubo

Se evaluo la hemolisis directa al mezclar 0,8 mL de buffer isotonico, 0,1 mL de globulos rojos lavados (GRL) y 0,1 mL de la enzima a diferentes concentraciones, fue incubado a 37 [grados]C por 2 horas, se detuvo la reaccion con 5 mL de NaCl al 0,9% pH 7,3 con EDTA 1 mM fria; luego fue centrifugada a 1000 rpm por 5 min y la hemoglobina liberada fue leida a 540 nm. El grado de hemolisis total se expreso como porcentaje de hemoglobina liberada de 0,1 mL de GRL hemolizados con 5,9 mL de agua destilada (Condrea et al. 1964). Se determino la Dosis Hemolitica Media (D[H.sub.50]), la cual se define como la concentracion de veneno en [micron]g/mL que es capaz de lisar el 50% de los globulos rojos, (Castanon et al., 1993). Para la hemolisis indirecta se adiciono ademas 0,1 mL de fosfolipidos de yema de huevo al 6,4% (Condrea et al., 1964).

b) Actividad hemolitica Indirecta en placa

Se prepararon placas de agar sangre (agar 1,5% en PBS a pH 7,4, GRL al 3%, yema de huevo al 5% y Ca[Cl.sub.2] 10 mM) donde se fabricaron pocillos colocandose las muestras de veneno y enzima purificada, usandose como control solucion salina. Se midieron los halos hemoliticos formados a las 0, 12 y 24 horas (Gutierrez et al. 1988).

Actividad miotoxica. Se determino por la prueba de cuantificacion de Creatina Kinasa (CK) serica. Inyectandose 0,1 mL de la fosfolipasa [A.sub.2] a diferentes concentraciones a ratones albinos (18-22 g) en el musculo gastrocnemius; se uso como control negativo solucion salina. Despues de 2 horas se obtuvo el plasma. La actividad de creatina kinasa fue medida con 25 iiL del plasma sobre 1 mL del kit para creatina kinasa (Pointe Scientific, USA), midiendo los incrementos en la absorbancia a 340 nm por minuto. La actividad se expreso en UI/L. (Gutierrez et al. 1980). Se determino la Dosis Miotoxica Minima (DMM) que corresponde a la cantidad de enzima que produce un valor de CK 4 veces mayor al control negativo, (WHO 1981).

Actividad edematica. Fue determinado por el metodo de Yamakawa et al., (1976), inyectandose 0,05 mL de fosfolipasa [A.sub.2] a distintas concentraciones en el cojinete de la pata posterior derecha de ratones albinos (18-22 g), y en la pata posterior izquierda solucion salina (control negativo). Despues de 3 horas se sacrificaron los animales y las patas inyectadas fueron pesadas comparandolas con su propio control negativo y evaluando la diferencia de pesos entre ellos. La dosis edematica media (DEM) se expresa en microgramos de proteina capaz de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no tratado, equivalente al 30%., (WHO 1981).

Determinacion de la actividad hemorragica. Se realizo segun el Metodo de Kondo et al. (1960); ratones (18 - 22 g) fueron inyectados intraperitonealmente con 0,1 mL de la muestra, luego de 2 horas se sacrificaron. Retirandose la piel y evaluando el area hemorragica formada. La actividad hemorragica se expreso como la dosis hemorragica minima (DHM), definida como la cantidad de veneno o enzima que induce un area hemorragica de 10 mm de diametro.

Actividad anticoagulante. Se determino por el metodo descrito por Yarleque et al. (1989). La mezcla de reaccion contenia 0,2 mL de plasma humano y 0,1 mL de la enzima, se incubaron a 37 [grados]C por 5 min para luego agregarles 0,1 mL de Ca[Cl.sub.2] 25 mM midiendose el tiempo de recalcificacion. La actividad anticoagulante se determino por el retardo en la coagulacion o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo de coagulacion del blanco.

Pruebas inmunologicas y de neutralizacion

Inmunodifusion directa (IDD) e inmunoelectroforesis

La inmunogenicidad de la enzima purificada fue determinada siguiendo la metodologia de Ouchterlony y Nilsson (1967), sobre geles de agarosa al 1% en PBS.

[FIGURA 1 OMITIR]

Ensayo de neutralizacion para la actividad enzimatica

Se utilizaron mezclas que contenian 4,35 [micron]g de la enzima en estudio con diferentes concentraciones del suero antilachesico monovalente equivalentes a 0,5; 1 y 2 dosis las cuales fueron preincubadas a 37 [grados]C por 30 min para luego medir la actividad de fosfolipasa. Una dosis neutralizante equivale a 10 mL de suero que neutraliza 24 mg de veneno lachesico.

Ensayo de neutralizacion para la actividad hemolitica

Se preparo una solucion de agar al 1,5% en PBS a pH 7,4, GRL al 3%, yema de huevo al 5% y Ca[Cl.sub.2] 10 mM. Luego de su gelificacion se realizaron pocillos y se colocaron las muestras del antiveneno y la enzima preincubadas a 37 [grados]C por 30 min a concentraciones equivalentes a 0,5; 1 y 2 dosis, se evaluo a las 12 y 24 horas observandose el grado de neutralizacion por la reduccion del halo de hemolisis.

Resultados

Purificacion de la enzima

El veneno crudo de Lachesis muta fue fraccionado en 4 picos al ser pasado por una resina de CM-Sephadex C-50, en condiciones isocraticas, representando el 42,4% del total de la proteina colocada. Eluyeron adicionalmente 3 picos con NaCl 0,3 M y 2 picos con NaCl 0,6 M representando 42,6% y 15% respectivamente. La actividad de fosfolipasa A2 estuvo presente en la caida del tercer pico del volumen isocratico que represento el 2,1% del total de proteina. En el segundo paso cromatografico en Sephadex G-50, se resolvieron 2 picos, encontrandose la fosfolipasa en el primero. Como se muestra en la Tabla 1, la metodologia empleada nos permitio la purificacion de la PL[A.sub.2] con un rendimiento del 34,1% y una purificacion de 55,3 veces representando el 0,62% del total de proteina. Al evaluar la fosfolipasa A2 por PAGE-SDS, bajo condiciones reductoras y no reductoras, se observo en ambos casos que la enzima mostro una sola banda homogenea indicandonos que la proteina es monomerica con un peso molecular de 18749 Da.

Efecto de inhibidores enzimaticos

El EDTA y el PMSF tuvieron un efecto inhibitorio mayor, aunque no total; para que los otros agentes inhibitorios logren un efecto similar es necesario el incremento de su concentracion. Por otro lado, las pruebas con los aminoacidos y el glutation dieron como resultado que este ultimo inhibe en mayor grado la actividad de la enzima seguido por la cisteina sin diferir mucho de los otros aminoacidos que presentan inhibicion parcial al emplearse concentraciones altas.

Propiedades biologicas de la enzima

En cuanto a las actividades biologicas la enzima mostro una elevada actividad hemolitica indirecta con una Dosis Hemolitica media (D[H.sub.50]) de 4,35 [micron]g para la enzima purificada y de 67,6 g para el veneno total (Fig. 1). Los valores de Dosis Miotoxica Minima (DMM) y Dosis Edematica Minima fueron de 125,89 [micron]g/mL y de 91,5 [micron]g respectivamente. La enzima purificada retardo el tiempo de recalcificacion del plasma humano como se muestra en la Figura 2. Produciendo un retraso de 158 segundos con 9,60 [micron]g de enzima. La enzima no presento actividad hemolitica directa sobre los eritrocitos humanos asi como actividad hemorragica a las concentraciones de 5, 15 y 30 [micron]g, al inocularse en piel de ratones albinos.

Pruebas inmunologicas y ensayos de neutralizacion

Las pruebas de inmunodifusion e inmunoelectroforesis demostraron la inmunogenicidad de la fosfolipasa A2 purificada y del veneno de L. muta, al ser reconocidas por el suero antilachesico monovalente comercial, observandose un solo arco de precipitacion para la PL[A.sub.2] purificada y varios arcos para el veneno total.

El suero antilachesico no neutralizo completamente la accion enzimatica de la fosfolipasa A2 purificada reduciendola hasta un 41,7% cuando se emplea la mayor dosis del antiveneno (Fig. 3). De la misma manera la actividad hemolitica indirecta de la enzima solo fue neutralizada parcialmente con la dosis mayor de antiveneno, hasta un 60% de accion hemolitica.

Discusion

Purificacion de la enzima y determinacion del peso molecular

Una isoforma de fosfolipasa A2, aislada del veneno de la serpiente peruana Lachesis muta, fue purificada por medio de dos pasos cromatograficos que involucraron secuencialmente el empleo de una resina intercambio cationico CM sephadex C-50 y una resina de exclusion molecular Sephadex G -50. La enzima es de caracter acido al ser eluida en el volumen isocratico del primer paso cromatografico. En trabajos previos realizados en veneno de L. muta de Brasil han caracterizado cuatro isoformas de PL[A.sub.2], siendo dos acidas y dos basicas (Fuly et al. 2002, Damico et al. 2005), con caracteristicas bioquimicas y biologicas distintas a las encontradas en la enzima purificada en este trabajo.

Los analisis por PAGE SDS asi como las pruebas de inmunodifusion confirmaron la pureza de la proteina. El peso molecular de la enzima purificada tanto en condiciones reductoras como no reductoras fue de 18749 Da, peso similar fue encontrado para la PL[A.sub.2] de L. muta de Brasil (Fuly et al. 2002), encontrandose dentro del rango de fosfolipasas en venenos de serpientes (Kini 2003). La presencia de una sola banda en condiciones reductoras indica que la proteina es de naturaleza unicatenaria.

Efecto de inhibidores enzimaticos

Como se muestra en la Tabla 2, el EDTA es el mayor inhibidor de la actividad enzimatica porque es un agente quelante que atrapa todos los cationes divalentes presentes en el medio, dej ando a la enzima sin su activador. Esto permite afirmar que la enzima requiere de iones como calcio para potenciar su actividad (Hseu et al. 1999). Asi mismo, debemos resaltar el hecho que los acidos aspartico y glutamico logran inhibir a la PL[A.sub.2] a altas concentraciones, por lo que se sospecha que el mecanismo de accion comprenderia la atraccion del ion ligado a la enzima por tales aminoacidos acidos, causando con ello un descenso en la afinidad PL[A.sub.2]-fosfolipidos.

Los efectos del PMSF y TLCK evidenciarian la presencia de los aminoacidos serina e histidina y/o cisteina como residuos fundamentales en la estructura catalitica. Por otro lado, los resultados de inhibicion con mercaptoetanol y el DDT indican que los puentes disulfuros no parecen estar involucrados en la conformacion del sitio activo de la enzima pero si son necesarios en la estructura conformacional de la misma (Yang & King 1980). Un efecto similar tiene el aminoacido cisteina el cual logra inhibir a la enzima en 68,4% de su actividad; ambos, glutation y cisteina, modificarian la estructura conformational de la enzima ya sea por ruptura de puentes disulfuros como es el caso del glutation o por la formacion de nuevos puentes por encontrarse cisteina libre en el medio. Sin embargo son necesarios estudios cineticos mas profundos para determinar el modo probable de accion de los agentes mencionados

Caracterizacion biologica

Las PL[A.sub.2] pueden actuar directamente sobre los eritrocitos para causar hemolisis (Kemparaju et al. 1994). Trabajos previos han sugerido la presencia de componentes que permiten esta actividad como el factor litico directo, FLD (Martin et al. 1975) o el desoxicolato (Hendon & Fraenkel-Conrat 1971). Sin embargo, el mecanismo responsable para esta actividad no esta del todo entendido. La enzima aislada no presenta una actividad hemolitica directa, la hemolisis producida es el resultado de la actividad de la lisolecitina liberada por la enzima al actuar sobre los fosfolipidos libres, atribuyendo de esta manera una actividad hemolitica indirecta que es superior al del veneno crudo y al reportado por Castanon et al. (1993).

No se ha encontrado una actividad miotoxica significante por parte de la enzima aislada lo que sugiere que perteneceria al grupo de las PL[A.sub.2] que presentan el residuo D-49 y no al grupo que presenta el residuo K-49 (Ownby et al. 1999). Tampoco fue identificada una actividad edematizante significativa, la cual si es producida por las PL[A.sub.2] de Lachesis muta stenophrys y Crotalus durissus durissus (Lomonte 1985) y B. asper (Lomonte y Gutierrez 1989), sin embargo esta actividad si esta presente en el veneno crudo de L. muta lo que sugiere la existencia de otro componente en el veneno responsable para tal actividad.

Una de las diferencias resaltantes de la isoforma aislada en este trabajo con la reportada por Mejia et al. (2006) es la presencia del notable efecto anticoagulante, la cual alarga el tiempo de recalcificacion del plasma, probablemente por hidrolisis de fosfolipidos, indispensable para que funcione la cascada de coagulacion por la via intrinseca (Bofa et al. 1982) esta actividad tambien esta presente en varias PL[A.sub.2] aisladas (Kemparaju et al. 1994, Boffa & Boffa 1976, Condrea et al. 1981, Teng et al. 1984 y Prado-Franceschi et al. 1998).

Inmunogenicidad y neutralizacion

La reactividad inmunologica de la PL[A.sub.2] indica que esta proteina, a pesar de su menor tamano, puede inducir la produccion anticuerpos. Investigaciones previas dan a conocer que las PL[A.sub.2] pueden llegar a alcanzar hasta el 68% del veneno crudo (la crotoxina de C. durissus terrificus) por lo que al neutralizar al mayor componente del veneno, se estaria neutralizando la letalidad del mismo (Da Silva & Guilherme 1982). Los resultados de neutralizacion muestran que, independientemente de su inmunogenicidad, los anticuerpos anti-PL[A.sub.2] presentes en el antiveneno comercial no son neutralizantes de su actividad enzimatica. Por otro lado, los ensayos in vitro para probar la potencia del antiveneno sobre la actividad de PL[A.sub.2], existen como alternativa con el objetivo de aminorar el uso de animales para experimentacion (Habermann & Hardt 1972, Gutierrez et al. 1988).

En conclusion se ha aislado una nueva isoforma de PL[A.sub.2] del veneno de la serpiente peruana Lachesis muta, que presenta una notable actividad anticoagulante y accion hemolitica indirecta, los principales inhibidores son agentes quelantes y reductores de aminoacidos especificos de sitio activo.

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Publicado impreso: 20/10/2010 Publicado online: 29/09/2010

Rosalina Inga, Dan Vivas, Pedro Palermo, Julio Mendoza, Fanny Lazo y Armando Yarleque Laboratorio de Biologia Molecular, Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Apartado 11-0058, Lima 11, Peru.

Email Rosalina Inga: rosalin_47@hotmail.com

Trabajo presentado a la XVIII Reunion Cientifica del Instituto de Investigaciones en Ciencias Biologicas Antonio Raimondi, "200 anos del nacimiento de Charles Darwin y el 150 aniversario de la publicacion de On the Origin of Species by Means of Natural Selection". Del 19 al 21 de agosto de 2009.
Tabla 1. Purificacion de la fosfolipasa A2 del veneno de Lachesis muta.
Actividad Especifica: min. de retardo/min. Incubacion/mg proteina

                                               Unidades
Procedimiento      Proteina total Actividad    totales de
                   mg      %      especifica   actividad

Inicial            110,1   100    1,6          171,7
(Veneno crudo)

CM-SEPHADEX C-50   2,3     2,07   59,8         136,3

SEPHADEX G-50      0,68    0,62   86,3         58,5

Procedimiento      Rendimiento   Purificacion
                   %             (veces)

Inicial            100           1
(Veneno crudo)

CM-SEPHADEX C-50   79,4          388,3

SEPHADEX G-50      34,1          55,3

Tabla 2. Efecto de algunos agentes sobre la actividad de la
fosfolipasa A2 del veneno de Lachesis muta. DDT: ditiotreitol, TLCK:
tosil-lisil-clorometil-cetona, PMSF:fenil metil solfonul fluoruro,
EDTA: Etilensiaminotetraacetico.

Agente quimico        Actividad especifica (%)

                   2,5 mM   5 mM   10 mM   20 mM

Control                         100%

DTT                90,3     73,0   65,0    62,0
2-Mercaptoetanol   89,5     81,7   72,4    59,4
Iodoacetato        92,6     81,0   63,7    55,3
TLCK               88,0     76,1   58,1    49,5
PMSF               68,1     53,0   42,4    39,9
EDTA               70,8     52,4   35,8    32,7
Acido aspartico    98,0     77,5   64,4    62,1
Acido glutamico    90,9     69,2   51,3    47,7
Cisteina           80,3     54,9   41,6    31,6
Glutation          78,1     48,9   36,4    30,0

Figura 2. Actividad anticoagulante de la fosfolipasa
[A.sub.2] de Lachesis muta.

[micron]g de     Tiempo de
Fosfolipasa      recalcificacion

1.6                  41
3.2                  60
6.4                  95
9.6                 158.5

Figura 3. Neutralizacion de la actividad
enzimatica y hemolitica de la fosfolipasa [A.sub.2]
purificada de Lachesis muta.

               Dosis de suero
               antilachesico

           Actividad   Actividad
           Hemolitica  enzimatica

0.5          4,2         22,7
1           25,0         32,5
2           41,7         41,7
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Author:Inga, Rosalina; Vivas, Dan; Palermo, Pedro; Mendoza, Julio; Lazo, Fanny; Yarleque, Armando
Publication:Revista peruana de biologia
Article Type:Report
Date:Apr 1, 2010
Words:4876
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