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Caracteristicas de aditivos enzimaticos obtenidos a partir de cultivos de Aspergillus niger ANM-1 en estados solido y sumergido.

Characteristics of enzymatic additives obtained from cultures Aspergillus niger ANM-1 in submerged and solid state

Introduccion

Los costos de los ingredientes usados para la alimentacion animal inciden en los sistemas de produccion, por lo que existe la necesidad de incorporar materias primas alternativas de bajo precio que no desmejoren la calidad de las dietas [1]. Por ello, la incorporacion de aditivos enzimaticos en la dieta de animales monogastricos es una practica cada vez mas frecuente. Esta estrategia se lleva a cabo para complementar la actividad desarrollada por las enzimas propias del tracto intestinal de los animales [2-4]. En particular, los aditivos enzimaticos que contienen celulasas pueden ser incorporados directamente al alimento de aves y porcinos, actuando en la descomposicion de los materiales fibrosos y mejorando la digestion de los mismos [2-4]. En la actualidad, el mercado mundial de las enzimas se ha estimado en US$ 430 millones, con un crecimiento anual del 5,7%. En este contexto, las enzimas hidrolasas representan el 75% de las enzimas industriales, contribuyendo las celulasas con 8% de la demanda mundial, encontrandose su mayor aplicacion como aditivo, en la alimentacion animal [5]. La obtencion de los aditivos enzimaticos es posible mediante procesos biotecnologicos en los que se ha reportado el uso de residuos o subproductos agroindustriales como sustrato fermentable, disminuyendo la carga contaminante al ambiente [3, 4, 6]. En tal sentido, se ha reportado la obtencion de aditivos a partir de desechos ricos en almidon o de afrechillo de trigo, resultando en una mejora significativa en la conversion alimenticia y una reduccion del costo de produccion, al incorporarlo en la dieta de pollos de engorde y cerdos en etapa de iniciacion [3, 4].

El mecanismo de sintesis de las celulasas o [beta]-1,4-endoglucanasas (EC 3.2.1.4) de origen microbiano, es un fenomeno complejo que depende de muchos factores, considerandose la induccion y la represion catabolica los mas importantes en la regulacion de este proceso. En consecuencia, varios trabajos se han llevado a cabo para estudiar el efecto del uso de diferentes fuentes de carbono en la produccion de celulasas como: paja de arroz, celulosa, glucosa, carboximetilcelulosa, almidon de residuos de papas, almidon soluble de papas, afrechillo de trigo, entre otros [5, 7-11]. De igual forma, se han empleado diversos microorganismos tales como: Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei y/o Aspergillus niger, en procesos fermentativos para la obtencion de estas enzimas [3, 8, 11, 12]. Estos estudios se enfocan en general en la etapa de fermentacion y existe muy poca informacion acerca de las propiedades enzimaticas del producto final o aditivo. Es por ello, que este trabajo tiene como proposito la obtencion y caracterizacion de dos aditivos enzimaticos empleando Aspergillus niger ANM-1 en un medio de cultivo a base de afrechillo de trigo para evaluar el efecto del tipo de fermentacion (solido (FES) y sumergido (FS)) y de la suplementacion del medio con varias fuentes de carbono para la induccion de la actividad enzimatica de celulasas o [beta]-1,4-endoglucanasas.

Parte experimental

Microorganismo

Se utilizo el aislado de Aspergillus niger ANM-1, obtenido de granos de maiz, perteneciente al cepario del Laboratorio de Microbiologia del Instituto de Quimica y Tecnologia de la Facultad de Agronomia de la Universidad Central de Venezuela [13]. La cepa fue conservada a 4[grados]C y propagada en cunas de agar papa dextrosa (PDA).

Medio de cultivo y condiciones del proceso fermentativo en matraces

Se empleo como sustrato un medio a base de afrechillo de trigo. Asimismo, se utilizaron cinco fuentes de carbono suplementarias a distintos niveles de sustitucion (5%, 10% o 15%). Estas fuentes suplementarias de carbono fueron escogidas para la prueba, por su disponibilidad y por la capacidad reportada como fuentes inductoras de celulasas: residuos de pasta humeda, residuos de papas (ambos residuos fueron provistos por industrias locales), almidon soluble (Sigma S 9765), carboximetilcelulosa (CMC, Sigma C 4146) y celulosa microcristalina (Macherey-Nagel 81529). En el proceso de FES, se ajusto la humedad del proceso a 85% usando una solucion salina compuesta por: CaC[O.sub.3], 0,5 g/L; MgS[O.sub.4] + 7[H.sub.2 O, 5 g/L; [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4], 2 g/L; K[H.sub.2]P[O.sub.4], 2 g/L y exxtracto de levadura, 2 g/L a pH 4,27 (Hanna 8417 Instruments[R], Mexico). Mientras que en el proceso de FS, se utilizo una concentracion de 50 g de sustrato/L de solucion salina. El proceso fermentativo fue llevado a cabo por triplicado para cada tratamiento, en matraces de 500 mL de capacidad, esterilizados a 121[grados]C durante 15 minutos. Se inoculo el sustrato, a temperatura ambiente, empleando una suspension al 10% de esporas de A. niger ANM-1 obtenida mediante el raspado de la superficie de una cuna de PDA con colonias en crecimiento, adicionando agua destilada esteril y filtrando el producto resultante para eliminar restos de micelio y conidioforos. Los matraces inoculados se introdujeron en una camara de fermentacion a 37 [grados]C durante 7 dias, para la FES. En tanto que la FS fue llevada a cabo durante un lapso de 64 horas, a 37 [grados]C y con agitacion a 300 rpm.

Actividad [beta]-1,4-endoglucanasa

Se determino la actividad de la enzima celulasa ([beta]-1,4-endoglucanasa) utilizando el metodo espectrofotometrico reportado por Olmos [14], en el que a 1 mL de una solucion de carboximetilcelulosa al 1% en buffer citrato-fosfato 0,05 M a pH 4,8 se le adiciono 1 mL de extracto enzimatico y se incubo, control y testigo (sin caldo enzimatico), durante 30 min a 50[grados]C. La reaccion fue detenida con 1 mL de acido 3,5-dinitro-salicilico [15]. Luego de enfriar se incorporaron 8 mL de agua destilada y se midio la absorbancia de los azucares reductores liberados a una longitud de onda de 575 nm. La actividad celulolitica se expreso en Unidades Internacionales (UI/mL), las cuales se definen como la cantidad de enzima que es capaz de liberar 1 [micron]mol de glucosa por minuto por cada mililitro de extracto enzimatico.

Obtencion del aditivo enzimatico

Posteriormente se efectuo el escalamiento en un fermentador de bandejas para la FES y en un fermentador Microferm New Brunswick Scientific, EUA, con 7 L de capacidad para el proceso en sumergido, a 37[grados]C, agitacion a 300 rpm y aireacion de 2vvm, empleando el sustrato que presento la mas elevada actividad celulolitica. Ademas, se monitoreo la variacion en el pH, la concentracion de azucares en el medio y la actividad de la [beta]-1,4-endoglucanasa, en los sustratos fermentados [14-16].

Los sustratos fermentados fueron recolectados y sometidos a deshidratacion en un secador de bandeja Proctor Schwartz (Philadelphia-EUA) a 50[grados]C, hasta que alcanzaron peso constante. Por ultimo, el material deshidratado fue molido para producir el aditivo enzimatico, el cual fue analizado bromatologicamente para conocer su composicion en: humedad, proteina bruta, cenizas, grasa bruta y fibra bruta [17]. Asimismo, se determinaron las actividades de las enzimas [alfa]-amilasa, glucoamilasa, [beta]-1,4-endoglucanasa [14], fitasa [18] y xilanasa [19] en los aditivos obtenidos. Adicionalmente, se midio el consumo de energia electrica en cada uno de los procesos de fermentacion [20].

Analisis estadistico y diseno experimental

Se utilizo un diseno anidado en el que se evaluo el efecto sobre la actividad celulolitica del uso de diferentes fuentes suplementarias de carbono (residuos de pasta humeda, residuos de papas, almidon, CMC y celulosa), a distintos niveles de sustitucion (5%, 10% y 15%) en el medio de cultivo a base de afrechillo de trigo, asi como del metodo fermentativo (Fermentacion sumergida (FS) o solida (FES)) empleado en la obtencion del aditivo enzimatico. Los resultados fueron analizados mediante un ANAVAR y se compararon las medias de los tratamientos (0%, 5%, 10% y 15% de sustitucion) usando la prueba de comparacion de medias de minimas diferencias significativas de Fisher a un nivel de confianza del 95%, utilizando los programas de computacion SYSTAT 7.0 y MATLAB.

Resultados y discusion

Efecto de diferentes fuentes suplementarias de carbono sobre la actividad de la [beta]-1,4-endoglucanasa

Las pruebas estadisticas (Tabla 1) senalan que la actividad de la [beta]-1,4-endoglucanasa fue influenciada de manera altamente significativa (P<0,01) por el tipo de fermentacion empleada y la fuente de carbono suplementada, mientras que los niveles de suplementacion empleados no ejercieron influencia alguna sobre la actividad de esta enzima. En general, la prueba de Fisher demostro que la actividad de la enzima [beta]-1,4-endoglucanasa fue 35,33% superior en la FES, con respecto a la FS (Figura 1a).

En el proceso en sumergido, la prueba de Fisher demostro la existencia de 2 grupos homogeneos, en donde el tratamiento con afrechillo de trigo sin suplementacion se diferencio significativamente (P<0,05) de los demas tratamientos estudiados (Figura 1b). Con respecto a la FES, se observaron 3 grupos homogeneos, diferenciandose significativamente (P<0,05) el tratamiento en el que se empleo afrechillo de trigo sin suplementacion y el tratamiento suplementado con almidon, del resto de los tratamientos estudiados (Figura 1c). En la experiencia se observo, que aun cuando la CMC y la celulosa son conocidos como inductores en la generacion de enzimas celulasas [10, 21], no se evidencio este efecto. En este sentido, otros autores senalan que un bajo nivel de celulasas en el medio de cultivo, puede ser atribuido a la represion en la sintesis de estas enzimas, debido a la acumulacion de subproductos en el medio, como la celobiosa a causa de la degradacion de los sustratos celulosicos [11, 22, 23]. Por otra parte, la adicion de otras fuentes de carbono mas facilmente metabolizables por el microorganismo, tales como los sustratos amilaceos, podrian haber favorecido la sintesis de enzimas amiloliticas, afectando la produccion de [beta]-1,4-endoglucanasa [7, 10, 23]. No obstante, este comportamiento no se corresponde a lo observado en el tratamiento suplementado con almidon (Figura 1c). La actividad de las celulasas obtenidas en la FES podria estar interrelacionada con la induccion de actividades de amilasas y xilanasas debido a la complejidad del sustrato a degradar (afrechillo). Durante este proceso se liberan azucares como la xilosa y maltosa (por estar suplementado con almidon), reportados como inductores de la actividad de xilanasas [24]. Estudios han revelado que la actividad de las hemicelulasas (xilanasas) y celulasas se encuentra bajo el control del mismo regulador transcripcional XlnR en A.niger [25].

En ambos procesos, el substrato con afrechillo de trigo como unica fuente de carbono fue el mas adecuado para inducir la sintesis de celulasas [10]. Al respecto, se ha afirmado que la composicion proximal del afrechillo de trigo parece favorecer la induccion de la sintesis de diversas enzimas, por lo que este es usado en la produccion de celulasas, amilasas y xilanasas [10, 26].

Proceso fermentativo

Sobre la base de los resultados obtenidos en los procesos fermentativos, se efectuo el escalamiento a fermentadores batch. La FS se realizo durante 30 horas, comenzando con un pH de 4,82 el cual disminuyo hasta 3,76 al final del proceso. Este efecto podria deberse a la acumulacion de acidos organicos en el cultivo como consecuencia de la actividad del hongo al degradar el substrato [27]. En cuanto al contenido de azucares en el medio se determinaron concentraciones entre 14 [micron]g/100 mL y 35 [micron]g/100 mL, en las primeras 20 horas de fermentacion, alcanzandose la maxima concentracion en azucares a las 26 horas del proceso con 3.038 [micron]g/100 mL (Figura 2a).

En cuanto a la FES, esta fue llevada a cabo durante 7 dias y registro un valor promedio de pH de 5,8. En el sustrato inoculado se determino que el pH al inicio de la fermentacion fue de 5,6, alcanzando un valor de 6,15 al final de la misma, probablemente a causa de la liberacion de grupos aminos que resulta en un incremento del pH al transcurrir un mayor tiempo de fermentacion con respecto a la FS [8, 9]. La concentracion de azucares al dia cero (0) fue de 13,5 [micron]g/100 mL, la disponibilidad de estos desde el inicio del proceso quizas se deba a que en la FES el microorganismo crece en una matriz solida lo que le permite facil acceso a las particulas que lo componen [28]. En este proceso se registro el contenido de azucar mas alto (57,28% de incremento) al tercer dia de incubacion, 31,6 [micron]g/100 mL (Figura 2b).

En cuanto a la actividad enzimatica, la Figura 3 muestra como al septimo dia del proceso fermentativo en solido se obtuvo la mayor actividad [beta]-1,4-endoglucanasa (34,42 UI/mL), mientras que en la FS se determino que 7,04 UI/mL fue la mas elevada actividad de esta enzima (30 horas). Adicionalmente, se observo en los dias finales de incubacion, que a medida que disminuyo el contenido de azucares en el substrato, a causa del consumo de los mismos por parte del hongo, se incremento la actividad de la [beta]-1,4-endoglucanasa en ambos procesos [11].

Caracterizacion de los aditivos enzimaticos

A partir del procesamiento del caldo de cultivo se obtuvieron dos aditivos deshidratados cuyos rendimientos fueron de 2,7% y 65% para FES y FS, respectivamente. El analisis estadistico de la composicion proximal efectuado a estos aditivos mostro que son significativamente diferentes en su composicion excepto en el contenido de fibra (Tabla 2), lo cual sugiere que el tipo de fermentacion empleada influye en las caracteristicas del producto final.

Por otra parte, el contenido de proteina cruda en los aditivos enzimaticos son superiores en 97,1% en la FES y en 53,31% para FS, con respecto al afrechillo de trigo. Algunos investigadores afirman que este incremento es atribuible al crecimiento del hongo en el medio de cultivo, ya que la estructura celular de este moho presenta un alto contenido de proteinas [29, 30]. Asi mismo, es importante resaltar que el contenido proteico en el aditivo obtenido por FES es superior en 26,16% al compararlo con el otro producto fermentado. Ademas, se observa que el contenido en fibra cruda en los aditivos supera en 41% (FES) y en 50% (FS) con respecto al afrechillo de trigo. Este resultado coincide con lo reportado en otros trabajos, en donde se obtuvo un mayor contenido de fibra en el sustrato fermentado con respecto a la materia prima empleada en la fermentacion [31, 32]. La razon de este incremento puede deberse a que en la pared celular de hongos y bacterias existen polisacaridos analogos a la celulosa, tal como la quitina, el cual es el segundo polisacarido en abundancia en la naturaleza y esta conformado por unidades de N-acetil-glucosamina con enlaces [beta]-1,4-glicosidicos, lo cual podria haber influido en los valores de las fracciones de fibra reportadas en este trabajo, tomando en cuenta el aporte de biomasa fungica en el producto [33, 34].

Tal como se senalo previamente, en el proceso fermentativo se lleva a cabo la induccion de diversas enzimas por A. niger lo cual se confirma en las diferentes actividades obtenidas en los aditivos tales como: [alfa]-amilasa, glucoamilasa, xilanasa, fitasa y [beta]-1,4-endoglucanasa, las cuales le confieren a los aditivos las caracteristicas de un producto multienzimatico. Al respecto, se ha senalado que utilizar aditivos que contengan estas enzimas ofrece mejores resultados ya que podria ocurrir un efecto sinergico entre estas y esto contribuiria a disminuir los requerimientos de mantenimiento y a reducir los efectos de los compuestos anti-nutricionales en la dieta de pollos y cerdos [1, 3]. Asimismo, se observo en los resultados que el producto de la FES presenta actividad [alfa]-amilasa (61%), xilanasa (68%) y fitasa (80%), significativamente superiores a las del aditivo obtenido por FS. Con respecto a la actividad [beta]-1,4-endoglucanasa, aunque no hay diferencias significativas (P>0,05), la actividad enzimatica en el producto elaborado en la FES supera en 30% a la del producto obtenido por FS. La medicion del consumo de energia electrica durante el procesamiento de los aditivos evidencio un gasto energetico 44% menor empleando la FES, lo que sugiere que el aditivo obtenido por FES presentaria mayores ventajas desde el punto de vista de la calidad del producto y su contribucion con el uso eficiente de la energia.

Conclusiones

La escogencia en los procesos biotecnologicos del tipo de fermentacion (FS y FES) a emplear resulto el principal factor de importancia sobre la induccion de la actividad de la [beta]-1,4-endoglucanasa durante el cultivo de A. niger ANM-1, asi como en las propiedades fisicoquimicas y enzimaticas de los aditivos obtenidos en este trabajo. Finalmente, la FES ofrece una alternativa amigable con el ambiente para la obtencion de productos destinados a la alimentacion animal y contribuiria con el uso eficiente de la energia electrica.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo economico al CDCH/UCV mediante el proyecto PG-01-7557 2009/1 y a la TSU Hazel Roman por su colaboracion tecnica.

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Recibido el 5 de Septiembre de 2012

En forma revisada el 25 de Noviembre de 2013

Lenis Matute (1), Annalisse Bertsch (1) *, Isabel Diaz (2)

(1) Laboratorio de Biotecnologia Agroindustrial, Instituto de Quimica y Tecnologia, Facultad de Agronomia, Universidad Central de Venezuela. Apartado postal 4579. Maracay 2101A, Venezuela. *bertscha@gmail.com

(2) Facultad de Ingenieria, Universidad Central de Venezuela, Nucleo Cagua. Telf. 0243-5507304-5507303-2465360.

Leyenda: Figura 1. Diagrama de caja para la actividad [beta]-1,4-endoglucanasa de acuerdo al tipo de fermentacion (A) y en los tratamientos estudiados en FS (B) y en FES (C). Letras diferentes indican diferencias significativas (P<0,05) segun la prueba de Fisher.

Leyenda: Figura 2. Variacion del pH ([??]) y la concentracion de azucares (*) durante la FS (A) y la FES (B).

Leyenda: Figura 3. Cinetica para la actividad [beta]-1,4-endoglucanasa durante la FES (O) y la FS (*).
Tabla 1
Resultado del ANAVAR para la actividad de la [beta]-1,4-endoglucanasa

Fuente                 Suma de     gl   Cuadrados   F      P
                       cuadrados        medios

Tipo de fermentacion   296,67      1    296,67      6,56   0,034
Fuente de carbono      362,04      8    45,25       5,64   0,001
suplementada
Nivel de               160,58      20   8,03
suplementacion
Total                  819,28      29

Tabla 2
Composicion bromatologica y actividad enzimatica de los aditivos

                           Aditivo enzimatico FES

Humedad (%)                6,30 [+ o -] 0,05 **
Proteina cruda (%) (bs)    37,49 [+ o -] 0,77 *
Extracto etereo (%) (bs)   1,47 [+ o -] 0,30 *
Cenizas totales (%) (bs)   11,98 [+ o -] 0,46 *
Fibra cruda (%) (bs)       17,90 [+ o -] 1,55
[beta]-1,4-endoglucanasa   535,62 [+ o -] 36,78
  (UI/g)
[alfa]-Amilasa (UA/g)      1.431,90 [+ o -] 20,65 **
Glucoamilasa (UI/g)        3.442 [+ o -] 199,44
Xilanasa (BXU/g)           419,81 [+ o -] 48,82 *
Fitasa (UI/mL)             5.764,80 [+ o -] 16,97 *

                           Aditivo enzimatico FS

Humedad (%)                5,85 [+ o -] 0,05 **
Proteina cruda (%) (bs)    29,16 [+ o -] 1,14 *
Extracto etereo (%) (bs)   6,81 [+ o -] 0,31 *
Cenizas totales (%) (bs)   3,15 [+ o -] 0,09 *
Fibra cruda (%) (bs)       21,15 [+ o -] 1,18
[beta]-1,4-endoglucanasa   376,79 [+ o -] 47,08
  (UI/g)
[alfa]-Amilasa (UA/g)      572,36 [+ o -] 45,93 **
Glucoamilasa (UI/g)        1.421,60 [+ o -] 150,80
Xilanasa (BXU/g)           135,90 [+ o -] 3,02 *
Fitasa (UI/mL)             1.195,00 [+ o -] 18,03 *

                           Afrechillo de trigo

Humedad (%)                9,61 [+ o -] 0,32
Proteina cruda (%)bs       19,02 [+ o -] 0,68
Extracto etereo (%)bs      3,28 [+ o -] 0,37
Cenizas totales (%)bs      5,53 [+ o -] 0,37
Fibra cruda (%)bs          10,57 [+ o -] 0,49
[beta]-1,4-endoglucanasa   --
  (UI/g)
[alfa]-Amilasa (UA/g)      --
Glucoamilasa (UI/g)        --
Xilanasa (BXU/g)           --
Fitasa (UI/mL)             --

(bs) = valores expresados en base seca. UI = Unidades Internacionales.
UA= Unidades Amlloliticas. BXU = Unidades de Xilanasas (corresponden a
1 nmol de xilosa en 1 segundo bajo las condiciones del analisis).

* = Indica que existen diferencias estadisticas altamente
significativas (P>0,01).

** = Indica que existen diferencias estadisticamente significativas
(P>0,05).
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Author:Matute, Lenis; Bertsch, Annalisse; Diaz, Isabel
Publication:Revista Tecnica
Date:Apr 1, 2014
Words:4573
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