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Capacidad discriminatoria y concordancia entre el ELISA-F29 y la PCR en individuos con infeccion por T. cruzi.

Discriminatory Power and Concordance between ELISA-F29 and PCR in Individuals with Infection due to T.cruzi

Capacidade discriminatoria e acordo entre o ELISA-F29 e a PCR em individuos infectados com T. cruzi

Introduccion

La enfermedad de Chagas, causada por el parasito tisular Trypanosoma cruzi, representa un evento de vigilancia de salud publica en los paises de America Latina. Aunque se ha reportado que la carga de la enfermedad ha disminuido entre 1990 y 2001 a una cuarta parte, se estima que aparecen cerca de 50,000 casos nuevos al ano en las zonas endemicas. Asimismo, se ha documentado que cerca del 30% de los infectados pueden desarrollar enfermedad cronica con riesgo de presentar complicaciones cardiacas y/o digestivas (1,2).

Para el diagnostico de la infeccion en las etapas asintomatica y cronica en la actualidad se dispone de pruebas serologicas y moleculares. Mientras las primeras son pruebas indirectas y se basan en la deteccion de anticuerpos generados contra el parasito, el diagnostico molecular se fundamenta en la deteccion directa del ADN del parasito y no depende del estado inmunologico del paciente ni del tiempo de adquisicion de la infeccion (3,4).

La Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR), mediante el empleo de los primers S35-S36, ha permitido la deteccion de T cruzi en tejidos infectados con cepas I y II del parasito y ha sido utilizada para monitorear pacientes con cardiomiopatia chagasica. Por su parte el ELISA-F29, que emplea una proteina ligadora de calcio del T cruzi, ha sido utilizado como marcador temprano de reversion de la infeccion con Chagas (5,6).

El objetivo del estudio fue evaluar la capacidad discriminatoria y la concordancia de los niveles de anticuerpos contra el antigeno F29 con relacion a la prueba de Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) en individuos con diagnostico serologico convencional confirmado para infeccion por T. cruzi.

Metodologia

Poblacion y muestra

De una cohorte prospectiva de donantes de bancos de sangre del area metropolitana de Bucaramanga reclutados entre los anos 2000-2003, los cuales hacen parte del estudio Cardiovascular Health Investigation and Collaboration to Assess the Markers and Outcomes of Chagas disease (CHICAMOCHA), se evaluo una muestra de 95 individuos con diagnostico serologico convencional confirmado para infeccion por T. Cruzi. El protocolo fue aprobado por el Comite de Etica en Investigaciones de la Universidad Autonoma de Bucaramanga (UNAB) donde los participantes firmaron consentimiento informado, de acuerdo con lo establecido en la resolucion 8430 de 1993 del Ministerio de Salud de Colombia.

Procedimientos

Se definio diagnostico serologico convencional confirmado, al resultado consistentemente positivo de minimo 2 de 3 pruebas (ELISA, Inmunofluorescencia Indirecta [IFI] y Hemoaglutinacion Indirecta [HAI]), en aquellos donantes que tuvieran un tamizaje positivo en bancos de sangre.

Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR)

En el laboratorio de Genetica de la UNAB, se realizo la estandarizacion de la (PCR) en sangre periferica. La muestra se mezclo con 7 ml de clorhidrato de guanidina y EDTA a temperatura ambiente por inversion durante 15 minutos. Posteriormente se hizo almacenamiento temporal en posicion vertical por 8 dias a temperatura ambiente, seguido de almacenamiento definitivo a 4[grados]C. Se realizo extraccion de ADN con el Kit QIAamp DNA Blood Midi de Qiagen[R]: La muestra fue precalentada durante 15 minutos a 100[grados]C, tomando 2 ml que se mezclaron con proteinasa k y buffer de lisis. El buffer de lisis se ajusto para permitir fijar el ADN a la membrana. El ADN se absorbio por la membrana de silica gel durante la centrifugacion. Las condiciones de pH en el lisado aseguraron que las proteinas y otros contaminantes que pudiesen inhibir la PCR y otras reacciones enzimaticas, no fueran retenidos en la membrana. Se procedio a realizar lavados con el fin de eliminar contaminantes.

Con el fin de verificar si el proceso de extraccion de ADN se efectuo adecuadamente, se realizo una PCR empleando una pareja de cebadores que amplificaron un fragmento del gen de la b-actina. Este fragmento sirvio como control interno de la reaccion de amplificacion, dado que debia amplificar en todas las muestras que contuvieran DNA genomico humano. Para la identificacion de T cruzi, se escogieron tres grupos de primers. Para los tres juegos de primers, se realizaron cuatro variaciones en las condiciones de la master Mix, con el fin de estandarizar la tecnica. Para los montajes se emplearon siete muestras y un control negativo (agua grado molecular). Todos los ensayos presentaron amplificacion en el control positivo y los controles negativos sin amplificacion, lo cual valido cada montaje. De esta forma se establecio un protocolo de extraccion y de master Mix. Los primers finalmente escogidos para el estudio fueron S35 (5'-AAA TAA TGT ACG GGK GAG ATG CAT GA-3')-S36 (5'-GGG TTC TGG GGT TGG TGT-3') y 121(5'-AAA TAA TGT ACG GGT GAG ATG CAT GA-3')-122 (5'-GGT TCG ATT GGG GTT GGT GTA ATA TA-3'), que se emplearon para evaluar a los participantes en dos momentos con un intervalo de aproximadamente un ano.

Ensayo Enzimatico Ligado a una Enzima (ELISA)

Se realizo una prueba de ELISA con antigeno F29 paralelamente a la evaluacion de PCR. El antigeno F29 correspondio a una proteina flagelar, ligadora de calcio de T. cruzi. Brevemente, microplacas de poliestireno de 96 pozos fueron revestidas con el antigeno recombinante y posteriormente las muestras de suero fueron incubadas a 37[grados]C para que se generara la reaccion antigeno-anticuerpo. Tras la adicion de conjugado anti-inmunoglobulina G humana, la actividad enzimatica fue detectada por la adicion del sustrato cromogenico p-nitrofenilfosfato. Para cada participante fue calculado el cociente entre la densidad optica de su muestra y la densidad optica del control negativo. Una prueba ELISA-F29 positiva fue determinada cuando el cociente de densidades opticas fue mayor o igual al percentil 95, tomando como referencia la distribucion de los valores de la prueba en participantes seronegativos de la cohorte.

Analisis estadistico

Se describen las variables continuas empleando medias (desviacion estandar) y las discretas mediante conteos (proporciones). Se evaluaron las diferencias del cociente de densidades opticas para ELISA-F29, de acuerdo a los resultados de PCR para cada par de primers, empleando la prueba t de student. Fue determinada la capacidad discriminatoria para dicho cociente con respecto al resultado de PCR mediante la estimacion no parametrica del area bajo la curva ROC (AUC). Adicionalmente, se estimo la sensibilidad y la especificidad esperadas fijando la tasa de falsos positivos al 25% y la sensibilidad al 75%, respectivamente. Finalmente, se determino la concordancia de los resultados dicotomizados de la prueba ELISA-F29 y el resultado de PCR mediante la estimacion de la kappa de Cohen. Para todos los estimados se presentaron sus respetivos intervalos de confianza del 95% (IC95%).

Resultados

Se realizaron pruebas de PCR en 2 ocasiones diferentes en 95 individuos (edad media: 38 anos; 64% hombres), con tasas de positividad entre 1.1-2.2% para los primers S35-S36 y entre 18.3-34.7% para los primers 121-122, respectivamente (Tabla 1). No se hallaron diferencias estadisticamente significativas entre las medias de los cocientes de densidad optica para los niveles de anticuerpos para el ELISA-F29 al comparar individuos con PCR [+] y PCR [-] para los primers S35-S36. Por otra parte, observamos mayores niveles de anticuerpos entre los individuos con PCR [+] para los primers 121-122, comparados con aquellos con PCR [-], aunque solo cuando fueron consideradas las dos determinaciones conjuntamente (Figura 1): Diferencia media entre los cocientes de densidad optica de 0.6 unidades (IC95%: 0,1; 1,0).

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

La capacidad discriminatoria de los niveles de anticuerpos para ELISA-F29, con relacion a la prueba de PCR, solo pudo ser evaluada para la parej a de primers 121-122 (Figura 2). En este caso, el AUC estimada fue de 0.62 (IC95%: 0.53; 0.70). Fijando la sensibilidad del nivel de anticuerpos al 75%, la tasa de falsos positivos fue del 56% (IC95%: 42%-70%), es decir, una especificidad del 44%. Por otra parte, fijando la tasa de falsos positivos al 25% (especificidad del 75%), la sensibilidad estimada fue del 36% (IC95%: 22%-52%). Con base en la misma curva ROC, se determino que 2.53 es el punto de corte optimo para el cociente de absorbancia, en cuanto este maximiza simultaneamente la sensibilidad y la especificidad (59% y 60%, respectivamente).

En terminos de concordancia de los resultados de la prueba ELISA-F29 (dicotomizada) y de la PCR, para el caso de los primers S35-S36 los niveles de acuerdo observado y kappas estimados fueron: 41.1% y -0.01 (IC95%: -0.06; 0.04) para la primera medicion, 64.5% y 0.04 (IC95%: -0.02; 0.09) para la segunda medicion y 52.7% y 0.01 (IC95%: -0.03; 0.05) cuando se consideraron conjuntamente las dos mediciones. En cuanto al par de primers 121-122 los niveles de acuerdo observado y kappas estimados fueron: 52.6% y 0.10 (IC95%: -0.08; 0.28) para la primera medicion, 62.4% y 0.09 (IC95%: -0.09; 0.28) para la segunda medicion y 57.5% y 0.13 (IC95%: 0.01; 0.26) al evaluar simultaneamente las dos mediciones.

Discusion

Este estudio evaluo el desempeno de la prueba de ELISA-F29 frente a la PCR validada en nuestro laboratorio usando los primers S35-S36 y 121-122, en terminos de su capacidad discriminatoria y nivel de acuerdo en individuos asintomaticos con diagnostico serologico convencional confirmado para infeccion por T cruzi. Los resultados permiten documentar que se encontro una tasa de positividad de la prueba de PCR inferiores al 5% al emplear el par de primers S35-S36, mientras que estas oscilaron entre 18-35% para los primers 121-122.

La PCR es una prueba molecular incluida para respaldar el diagnostico de infeccion con T. cruzi desde finales de los ochenta (7). Su capacidad diagnostica en terminos de sensibilidad y especificidad depende de factores muy variables como son el volumen y conservacion de la muestra, la tecnica de extraccion del ADN, el protocolo de la prueba de PCR que incluye los primers seleccionados junto con las condiciones de termociclaje y la presencia de inhibidores que interfieren en la amplificacion del material genetico (8). Por su parte, el parasito tiene una circulacion intermitente en el torrente sanguineo del paciente infectado lo que interfiere con la sensibilidad de la prueba, a su vez se ha documentado la existencia de 6 unidades de tipificacion diferentes [DTUs] por lo que es frecuente encontrar polimorfismos dentro de la secuencia del fragmento genetico que no permite la amplificacion del ADN del T.cruzi (9).

El empleo de los primers S35-S36 y 121-122 garantiza la amplificacion de un fragmento de 330 pb de la region variable de los minicirculos de T. cruzi. En nuestro estudio, la pareja de primers 121-122 presento mejores resultados de amplificacion frente al S35-S36. Contrario a estos resultados, la tecnica con el primer S35-S36 ha sido utilizada con exito en el pais para monitorear pacientes con cardiomiopatia chagasica e identificar reactivacion de la infeccion. Estos resultados pueden deberse a la versatilidad del parasito, dada por los DTUs y a las caracteristicas de amplificacion inherentes a cada uno de los primers utilizados en cada una de las pruebas (6,9,10).

Tradicionalmente las pruebas serologicas han sido utilizadas como gold estandar para el diagnostico de la infeccion con T. cruzi en especial la prueba de ELISA (11,12). No obstante, la revision exhaustiva de estudios prospectivos para evaluar la calidad diagnostica de esta tecnica, han dado muestra de que sus caracteristicas de sensibilidad y la especificidad para el diagnostico de la enfermedad de Chagas son menos precisos de lo que se ha documentado hasta la fecha, sin embargo, hoy en dia se siguen utilizando para la clasificacion del estado de infeccion de los pacientes (13). Para aumentar la especificidad del ELISA, se han disenado antigenos recombinantes, para el caso de este estudio se utilizo el antigeno recombinante F29 que emplea una proteina ligadora de calcio del T. cruzi; esta tecnica ha sido utilizada para medir la eficacia terapeutica del tratamiento de la infeccion con Chagas (14).

Para efectos de este estudio, se evaluo la concordancia entre los niveles de anticuerpos para antigeno recombinante F29 y la PCR (S35-S36 y 121-122). Los resultados demuestran una baja concordancia evidenciada por los valores de kappa presentados. Resultados similares han sido documentados en estudios que han empleado los mismos juegos de primers que se usaron en esta investigacion y otros como el TZC1-TCZ2, obteniendose indices kappa por debajo de 0.5 (15-18).

Investigaciones realizadas en los ultimos cinco anos para evaluar la capacidad diagnostica del ELISA vs PCR en infeccion cronica no recomiendan el empleo de la PCR para el diagnostico en la practica clinica dadas las limitaciones de esta ya que en la actualidad no se dispone de reportes tecnicos estandarizados que den muestra de las cualidades de esta prueba, por lo que se han sugerido estudios para validar la tecnica de PCR (19). Revisiones de literatura realizadas para evaluar el rendimiento de la PCR para diagnostico de Chagas en fase cronica, documentan que la sensibilidad de esta tecnica oscila entre 50-90% (19,20).

Dentro de las fortalezas del estudio se destaca el seguimiento realizado a la cohorte de pacientes para hacer las mediciones sanguineas en dos momentos distintos con intervalo promedio de un ano. Una de las limitaciones fue la ausencia de cuantificacion del numero de copias del ADN, por lo anterior, se sugiere que para estudios futuros se realice PCR en tiempo real.

Conclusiones

Se observo una positividad menor al 50% para la PCR usando los primers S35-36 y 121-122, en pacientes con diagnostico de infeccion por T.cruzi. Estos resultados demuestran una baja concordancia entre la PCR y ELISA-F29 evidenciada por los valores de kappa determinados en el estudio.

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan que no tienen ningun conflicto de interes.

Financiacion

El presente estudio fue financiado con fondos de Colciencias, el Programa Jovenes Investigadores e Innovadores "Virginia Gutierrez de Pineda" y la Universidad Autonoma de Bucaramanga UNAB.

Referencias

(1.) World Health Organization. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Heal Organ Tech Rep Ser. 2012;975(v-xii):1-100.

(2.) Schofield CJ, Jannin J, Salvatella R. The future of Chagas disease control. Trends Parasitol. 2006 Dec;22(12):583-8.

(3.) Anthony R, Johnson C, Sousa O. Use of micro-ELISA for quintitanting antibody to Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. Am J Trop Hyg. 1979;28(6):969-73.

(4.) De Meis J, Morrot A, Farias-de-Oliveira DA, Villa-Verde DM, Savino W. Differential regional immune response in Chagas disease. PLoS Negl Trop Dis. 2009;3(7):e417.

(5.) Pavia PX, Roa NL, Uribe AM PC. Using S35-S36 and TcH2AF-R primer-based PCR tests to follow-up a Chagas' disease patient who had undergone a heart transplant. Biomedica. 2011;31(2):178-84.

(6.) Barrera YK, Guevara JM, Pavia PX, Montilla M, Nicholls RS, Parra E, Puerta C. Evaluation of TcH2AF-R and S35-S36 primers in PCR tests for the detection of Trypanosoma cruzi in mouse cardiac tissue. Biomedica. 2008;28(4):616-26.

(7.) Moser DR, Kirchhoff LV, Donelson JE. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA Amplification Using the Polymerase Chain Reaction. J Clin Microbiol. 1989;27(7): 1477-82.

(8.) Duffy T, Bisio M, Altcheh J, Burgos JM, Diez M, Levin MJ, et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. PLoS Negl Trop Dis. 2009;3(4).

(9.) Schijman AG, Bisio M, Orellana L, Sued M, Duffy T, Mejia Jaramillo AM, et al. International study to evaluate PCR methods for detection of Trypanosoma cruzi DNA in blood samples from Chagas disease patients. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5(1).

(10.) Pavia PX, Roa NL, Uribe AM, Puerta Bula CJ. [Using S35-S36 and TcH2AF-R primer-based PCR tests to follow-up a Chagas' disease patient who had undergone a heart transplant]. Biomedica Rev del Inst Nac Salud [revista en internet]. 2011;31(2):178-84. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22159533

(11.) Cannova D, Aguilar M, Pacheco M, Simons M, Medina M. Validacion del Inmunoensayo enzimatico (ELISA) y hemaglutinacion indirecta (HAI) para el serodiagnostico de la enfermedad e Chagas. Salus. 2002;6:4-9.

(12.) Da Silveira J, Umezawa E, Luguetti AO. Chagas disease: recombinant Trypanosoma cruzi antigens for serological diagnosis. TRENDS Parasitol. 2001;17(6):286-91.

(13.) Afonso AM, Ebell MH, Tarleton RL. A Systematic Review of High Quality Diagnostic Tests for Chagas Disease. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(11).

(14.) Fabbro D, Velazquez E, Biza L, Denner S, Oliveira V et al. Evaluation of the ELISA-F29 test as an early marker of therapeutic efficacy in adults with chronic Chagas disease. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2013;55(3):167-72.

(15.) Bianchi F, Cucunuba Z, Guhl F, Gonzalez NL, Freilij H, Nicholls RS, et al. Follow-up of an Asymptomatic Chagas Disease Population of Children after Treatment with Nifurtimox (Lampit) in a Sylvatic Endemic Transmission Area of Colombia. PLoS, Neglected Trop Dis [revista en internet]. 2015;1 0(2):e0003465. Disponible en: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pntd.0003465

(16.) Gilbet SR, Alban SM, Gobor L, De Oliveira Bescrovaine J, Myiazaki MI, Thomaz-Soccol V. Comparison of conventional serology and PCR methods for the routine diagnosis of Trypanosoma cruzi infection. Rev Soc Bras Med Trop. 2013;46(April):310-5.

(17.) Ramirez JD, Guhl F, Umezawa ES, Morillo CA, Rosas F, Marin-Neto JA, et al. Evaluation of adult chronic Chagas' heart disease diagnosis by molecular and serological methods. J Clin Microbiol [revista en internet]. 2009;47(12):3945-51 . Disponible en: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?arti d=2786654&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

(18.) Duarte LF, Florez O, Rincon G, Gonzalez CI. Comparison of seven diagnostic tests to detect Trypanosoma cruzi infection in patients in chronic phase of Chagas disease. Colombia Medica. 2014;2014:61-6.

(19.) Brasil PE a a, De Castro L, Hasslocher-Moreno AM, Sangenis LHC, Braga JU. ELISA versus PCR for diagnosis of chronic Chagas disease: systematic review and meta-analysis. BMC Infect Dis [revista en internet]. BioMed Central Ltd; 2010;10(1):337. Disponible en: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/10/337

(20.) De Winne K, Buscher P, Luquetti AO, Tavares SBN, Oliveira R a., Solari A, et al. The Trypanosoma cruzi Satellite DNA OligoC-TesT and Trypanosoma cruzi Kinetoplast DNA OligoC-TesT for Diagnosis of Chagas Disease: A Multi-cohort Comparative Evaluation Study. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(1):55.

Edgar David Gomez-Laiton, MD., Medico General, Fundacion Oftalmologica de Santander-FOSCAL.

Laura Andrea Polo-Ardila, Enf., Enfermera, Hospital Universitario de Bucaramanga Los Comuneros.

Yeny Zulay Castellanos-Dominguez, Bact., Esp., MSc, Bacteriologa y Laboratorista Clinico, Especialista en Auditoria de Servicios de Salud, Magister en Epidemiologia; Facultad de Ciencias de la Salud, Grupo de Cardiologia Preventiva. Universidad Autonoma de Bucaramanga.

Victor Mauricio Herrera-Galindo, MD., MSc., PhD., Medico, Magister y Doctor en Epidemiologia; Facultad de Ciencias de la Salud, Grupo de Cardiologia Preventiva, Universidad Autonoma de Bucaramanga.

Juan Carlos Villar-Centeno, MD., Esp., MSc., PhD., Medico, Especialista en Medicina Interna, Magister y Doctoren epidemiologia Clinica, Facultad de Ciencias de la Salud, Grupo de Cardiologia Preventiva, Universidad Autonoma de Bucaramanga.

Correspondencia: Juan Carlos Villar Centeno, Calle 157 No. 14-55, Floridablanca, Colombia. Universidad Autonoma de Bucaramanga, Telefono 6436111 extension 516. Email: jcvillar@unab.edu.co

Articulo recibido: 16 de marzo de 2015 Aceptado: 25 de julio de 2015
Tabla 1. Media del cociente de densidad optica (muestra/control
negativo) de la prueba ELISA para F29, de acuerdo al resultado de la
prueba de PCR para los primers S35 y 121 en participantes con
diagnostico serologlco confirmatorio para T. cruzi.

         Medicion           Resultado               [DELTA]
         Orden                                      (IC95%)
Primer   (n[-]/n[+l)        H           M

S35      1 (93/2)           2.8 (1.5)   3.5 (2.7)   0.7 (-1.5,2.8)
         2 (92/1)           2.1 (0.9)   4.0 (...)    ...

121      Todos * (185/3)    2.5 (1.3)   3.7 (1.9)   1.2 (-0.3,2.7)
         1 (62/33)          2.7 (1.5)   3.1 (1.6)   0.4 (-0.3,1.0)
         2 (76/17)          2.0 (0.9)   2.5 (1.5)   0.5 (-0.1,1.0)
         Todos * (138/50)   2.3 (1.2)   2.9 (1.5)   0.6 (0.1,10)

 * Diferencia e IC95% corregidos por correlacion de las mediciones
(2 por cada individuo).

[DELTA] Diferencia media entre muestras positivas y negativas,
corregida por correlacion de mediciones ... No estimable
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Title Annotation:PCR; Reaccion en Cadena de la Polimerasa
Author:Gomez-Laiton, Edgar David; Polo-Ardila, Laura Andrea; Castellanos-Dominguez, Yeny Zulay; Herrera-Gal
Publication:MedUNAB
Date:Apr 1, 2015
Words:3603
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