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Biotransformacion de metales pesados presentes en lodos riberenos de los rios Bogota y Tunjuelo.

Biotransformation of heavy metals present in mud bordering the Bogota and Tunjuelo rivers

Introduccion

La contaminacion ambiental generada por las actividades industriales, es uno de los problemas que cursa el planeta y que altera el equilibrio biologico de la Tierra. Los metales pesados son uno de los desechos contaminantes mas toxicos que se arrojan como desechos industriales; que aunque son imprescindibles para el desarrollo de los organismos, en cantidades excesivas pueden llegar a ser letales. Una vez emitidos se absorben muy facilmente a traves de las membranas biologicas por su elevada afinidad quimica a las proteinas no siendo de facil degradacion y dificultando su eliminacion. Es asi como se hace necesario contrarrestar estos contaminantes utilizando tecnicas para su transformacion y/o inactivacion del ambiente.

La toxicidad de los metales pesados es muy alta. Su accion directa sobre los seres vivos ocurre a traves del bloqueo de las actividades biologicas, es decir, la inactivacion enzimatica por la formacion de enlaces entre el metal y los grupos sulfhidrilos (-SH) de las proteinas, causando danos irreversibles en los diferentes organismos. Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad, estos deben encontrarse disponibles para ser captados por los seres vivos, es decir que el metal debe estar biodisponible. El concepto de biodisponibilidad se encuentra intimamente relacionado con las condiciones fisicoquimicas del ambiente, que determinan la especiacion y por lo tanto la concentracion de metal libre y labil. Por ello es fundamental, al determinar el grado de contaminacion por metales pesados de un ambiente, conocer su biodisponibilidad, es decir, la concentracion de metal libre y labil presente en la muestra (1,2).

Una de las aplicaciones mas recientes en la biotecnologia es la correccion biologica que permite aborda en la mayor parte de los casos el tratamiento de suelos contaminados. Todas las interacciones entre los microorganismos y los metales u otros elementos como carbono, nitrogeno, azufre y fosforo son componentes fundamentales de los ciclos biogeoquimicos. Las interacciones metal-microbiota son estudiadas en profundidad en el contexto de la biotecnologia ambiental, con el objeto de implementar metodos de remocion, recuperacion o detoxificacion de metales pesados y radionuclidos (3-5).

Dependiendo del estado de oxidacion que se presente un metal y la especie que este conformando, un microorganismo puede realizar dos transformaciones posibles. Una corresponderia a la movilizacion del metal, es decir el pasaje de un estado insoluble inicial (metales asociados a suelos, sulfuros u oxidos metalicos, por ejemplo) correspondiente a una fase solida, a un estado soluble final, en fase acuosa. Este proceso se conoce con el nombre de lixiviacion microbiana. El otro corresponde a la inmovilizacion del metal, es decir el pasaje de un estado soluble inicial en fase acuosa a uno insoluble final en fase solida. A su vez existen en la naturaleza diferentes mecanismos por los cuales la inmovilizacion del metal puede llegar a ocurrir (6).

[FIGURA 1 OMITIR]

El interes en descontaminar los suelos se produce debido a que el flujo del agua transporta la mayoria de los contaminantes y estos tienden a absorberse sobre las superficies presentes o forman fases liquidas, quedando atrapadas en la matriz solida. Uno de los metodos de correccion biologica que se utiliza en la actualidad es la biorremediacion, la cual surge como una rama de la biotecnologia que busca resolver los problemas de contaminacion (7).

Segun la Environmental Protection Agency (EPA), la biorremediacion se define como los procesos en los que se usan microorganismos o enzimas producidas por estos para transformar o degradar contaminantes toxicos en los ecosistemas (8); esta estrategia biologica depende de las propiedades catabolicas que presentan los microorganismos, quienes utilizan los contaminantes para su desarrollo. Los contaminantes que se liberan en las superficies pueden ser transportados vertical y lateralmente a los suelos de aguas y eventualmente pueden ser inhalados o ingeridos atraves de aguas para el consumo humano, ademas pueden ser absorbidos por las plantas y los tejidos animales. Estos contaminantes son llamados tambien xenobioticos (termino que se refiere a las sustancias artificiales que no pertenecen a los sistemas biologicos naturales) (9).

En la absorcion microbiana, llamada bioacumulacion, las especies metalicas son efectivamente retenidas al interactuar con los fosfatos, proteinas y lipidos en el citoplasma celular compitiendo con los iones sodio, potasio y calcio en los mecanismos biologicos; sus posibilidades de desarrollar una mayor capacidad absorbente dependen del tipo de microorganismo y su etapa de crecimiento (10). En la Figura 1 se esquematiza la interaccion entre los metales pesados y los microorganismos, Figura 1.

Una caracteristica quimica importante de las paredes celulares es que poseen igualmente grupos funcionales; las tecnicas analiticas muestran que en ellas estan presentes polimeros sustituidos con grupos aminos, amidos, carboxilicos, hidroxilicos, fosfatos. Una vez que la biomasa obtenida principalmente de los desechos de la industria que realizan procesos de fermentacion ha sido secada, el residuo es un absorbente eficaz en la remocion de especies metalicas desde efluentes. Este proceso se denomina bioabsorcion; igual que en la bioacumulacion el tipo de microorganismo determina los biopolimeros presentes en la biomasa seca y asimismo la concentracion de los grupos funcionales disponibles como sitios de adsorcion. Este conocimiento ha permitido que otras investigaciones se orienten al uso directo de los biopolimeros, desarrollando aun mas la biosorcion como tecnica de metales toxicos desde efluentes mineros (10).

El ambiente mas favorable para la mayor parte de los microorganismos (bacterias, hongos y algas) (11,12) es:

* Temperatura: 15-45[grados]C.

* pH: entre 5,5 y 8,5.

* Relacion de nutrientes carbono: nitrogeno: fosforo de 120:10:1.

* Presencia de agentes oxidantes y/o reductores que permitan las reacciones metabolicas de los microorganismos.

Ademas de estas condiciones, para que la biorrecuperacion sea efectiva, es necesario que los microorganismos sean los apropiados para el contaminante y que estos no sean toxicos para los microorganismos. El principal problema de los metales pesados en el ambiente es que no pueden ser biodegradados; sin embargo los microorganismos pueden interaccionar con ellos transformandolos los cuales obedecen a cambios en el estado de oxidacion; esto influye de forma drastica en la movilidad del contaminante, ya que en algunos casos aumenta la solubilidad de los productos de alteracion, favoreciendo asi su eliminacion del medio, y en otros casos disminuye produciendose una inmovilizacion del contaminante. La eleccion entre una u otra transformacion dependera de si se pretende eliminar la contaminacion o si se quiere evitar su llegada a zonas especificas. Ademas los microorganismos pueden actuar y biodegradar la materia organica y los compuestos organicos (acidos humicos principalmente), modificando igualmente su movilidad.

Las reacciones responsables de los procesos de biotransformacion y biodegradacion estan relacionadas con el metabolismo de los microorganismos existentes. Para que dichos microorganismos puedan crecer y desarrollar sus funciones vitales necesitan un aporte de nutrientes, basicamente carbono, nitrogeno y fosforo; asi como donantes y aceptores de electrones (13). Estos ultimos son imprescindibles como fuente de energia, ya que la transferencia catalizada de electrones entre donantes y receptores libera la energia requerida para que se produzcan las reacciones bioquimicas vitales. Algunos metales pesados pueden actuar como donantes y aceptores de electrones, o como fuente de energia, y por ello es posible su biotransformacion. Los organismos que utilizan metales como fuentes principales de energia son los denominados chemolitoautotrofos.

Las principales transformaciones de los metales pueden ser directas, por medio de cambios en el estado de valencia cuando actuan como donantes o receptores de electrones e indirectas, por medio de agentes oxidantes y reductores producidos por los microorganismos y que son responsables de cambios en el pH y del potencial redox (11). En la respiracion aerobia los organismos chemolitoautotrofos utilizan C[O.sub.2] como fuente de alimentacion y de energia. En la respiracion anaerobia, los procesos estan condicionados por el tipo de aceptor de electrones, ya que no existe oxigeno disponible para hacer dicha funcion. Los principales aceptores de electrones en medios anaerobios son C[O.sub.2]; N[O.sub.3-]; S[O.sub.4.sup.2-] y [Fe.sup.3+].

Las formas oxidadas de los metales son altamente solubles y por lo tanto moviles, en las aguas subterraneas en condiciones aerobias. Su reduccion enzimatica produce formas reducidas insolubles, lo que provoca su precipitacion intra o extracelular (11). Ademas de la reduccion enzimatica directa de metales pesados, algunos microorganismos, como las bacterias reductoras de metales y las bacterias reductoras de sulfatos, pueden llevar a cabo la reduccion indirecta de especies oxidadas solubles. Esto se produce acoplando la oxidacion de compuestos organicos a la reduccion del [Fe.sup.3+], [Mn.sup.4+] y S[O.sub.4.sup.2-]. Las especies reducidas [Fe.sup.2+], [Mn.sup.2+] y [H.sub.2]S, interaccionan quimicamente con los metales contaminantes solubles produciendo especies multicomponentes insolubles que precipitan.

La solubilizacion de metales bioabsorbidos y coprecipitados puede producirse por procesos microbianos tanto de forma directa como indirecta, aunque la solubilizacion de metales pesados a partir de coprecipitados con las fases minerales del acuifero, requiere una solubilizacion parcial previa de dichas fases minerales, oxidos principalmente. La reduccion directa de oxidos de hierro por bacterias reductoras de metales, favorece la solubilizacion de un gran rango de metales pesados que pudieran estar coprecipitados en dichos oxidos. Asimismo, la creacion de acidos organicos durante el metabolismo de los microorganismos, es capaz de bajar el pH del sistema, hasta valores que permitan interferir con las cargas electrostaticas que mantienen unidos los metales pesados a la superficie de los oxidos e hidroxidos de hierro y ser desplazados por los iones de hidrogeno liberados al sistema.

materiales y metodos

Basandonos en los reportes de algunos trabajos de grado de Universidades como la Distrital y los Andes, entre otras, y los informes de la Contraloria Distrital y la Secretaria Distrital de Ambiente, se determino la zona media del rio Tunjuelo y la zona media del rio Bogota. El proyecto identifico dos ambientes tipicamente contaminados (suelos y lodos) con metales pesados (Cr, Pl, Hg), en los cuales se tomaron muestras en forma continua durante los 12 meses en que se desarrollo el proyecto, para lo cual se realizaron visitas y muestreos directos.

Partiendo de la determinacion de la zona de muestreo y haciendo una caracterizacion fisica, quimica y climatica de la zona, se pudo estandarizar los protocolos microbiologicos a seguir en el laboratorio, y se utilizo la absorcion atomica como tecnica para la determinacion de estos metales pesados. Con la zona de muestreo estudiada, los protocolos microbiologicos establecidos, se procedio a la toma de las muestras de los lodos semiliquidos dadas las condiciones de las riveras de estos dos rios. Se tomaron muestras por duplicado en frascos de 500 mL, color ambar y conservados a 4[grados]C, (una para quimica y otro para microbiologia). Las muestras fueron recogidas con herramientas manejables (paletas o espatulas) previamente esterilizadas en el laboratorio o bien a la llama inmediatamente antes de la toma. En el caso de los suelos siempre se trato de muestras superficiales (20 o 30 cm).

El proceso de preparacion paso por un pequeno cribado manual para retirar trozos de roca y vegetales de modo que la muestra presentara un aspecto homogeneo, sin fragmentos superiores a 5mm. Es importante conseguir una solucion convenientemente clara, representativa y reproducible para los cultivos en placa. Para ello, a un peso de cada muestra (10 g) se le anadio una cantidad de un agente disgregante (pirofosfato de sodio -[Na.sub.4][P.sub.2][O.sub.7].10[H.sub.2]O al 0,1%) en una relacion constante volumen/peso de 2,5 (14). El recipiente esteril se agito, machacando las particulas de suelo con una varilla de vidrio tambien esteril hasta reposar y se observo el grado de dispersion alcanzado. El proceso se detuvo cuando se dispersaron por completo las particulas mayores. Este procedimiento actua a escala macroscopica (15) la dispersion de las particulas de suelo y la ruptura de agregados que pudieran disminuir la eficiencia de la extraccion de los microorganismos. En el ambito microscopico se consigue una desorcion de las celulas suficiente para conseguir una suspension microbiana.

Las muestras se sometieron a analisis quimica para poder establecer el nivel de contaminacion de estos lodos por Cr hexavalente, Pl y Hg. Las muestras microbiologicas se concentraron mediante centrifugacion a 12000 rpm durante 5 minutos en forma fraccionada y se tomo el sobrenadante, llevando a un volumen final de 50 mL, para iniciar el proceso de diluciones y siembra en medio TSA e incubarlos por 48 horas a una temperatura de 25[grados]C. Se realizaron repiques y aislamiento de los microorganismos presentes (biotransformantes y biotolerantes), para ser sometidos a pruebas bioquimicas (16) iniciales de identificacion y establecer las tecnicas de enriquecimiento selectivo en matraces de 250 mm con medio de cultivo (lodo esteril) a 5000 rpm y 25[grados]C durante siete dias, al cabo de los cuales se tomo 1 mL para diluciones (17), siembra, recuento aislamiento e identificacion (15, 18, 19).

Todos los procedimientos que se pueden usar para el calculo del numero de microorganismos viables en una muestra natural tienen implicitos errores; los recuentos en placa no son excepcion. Efectivamente, el numero de microorganismos que se pueden aislar con esta tecnica es muy inferior al total de los presentes en la misma muestra; tanto es asi que, segun los casos, se habla de un 10% a 15% del total (20,21). Se tomaron 25 mL del matraz y se resembro en un nuevo matraz medio de cultivo liquido (lodos esterilizados), repitiendo tres veces el procedimiento anterior, (enriquecimiento selectivo).

Se implementaron nuevos matraces de 250 mL, con medio de cultivo esteril, (lodos analizados quimicamente para garantizar la ausencia de metales pesados) suplementados con adicion de concentraciones especificas de Cr, Pl y Hg para observar el comportamiento de los microorganismos aislados (biotolerantes y biotransformadores).

Es importante senalar que el contenido de cada matraz fue enviado a analisis quimico para hacer seguimiento a la biotransformacion de cada uno de estos metales. Se utilizaron tecnicas de biologia molecular, para la identificacion de los microorganismos asi como el analisis de sus relaciones filogeneticas, mediante la secuenciacion del ARN ribosomico (rRNA), o de los genes que se codifican, rDNA. El proceso completo paso por fases de amplificacion (PCR) del gen del RNAr 16S, secuenciacion y finalmente comparacion con las secuencias de referencia en las bases de datos existentes (15).

La aportacion principal de estas tecnicas en el campo de biorremediacion es la identificacion precisa de los microorganismos implicados en la biotransformacion. Los arboles filogeneticos que se pueden elaborar con esta metodologia permiten conocer las relaciones de las bacterias detectadas con otros grupos microbianos, incluso sin haber sido cultivadas previamente.

Los metodos utilizados para identificar las cepas aisladas tras diversas fases de cultivo fueron: obtencion de ADN (22), amplificacion-purificacion: mediante el uso del kit GFX PCR DNA and Gel Band purification (Amersham Bioscience) segun el protocolo del fabricante y leyendo el ADN obtenido en 60 [micron]L de agua destilada; secuenciacion: 10 [micron]L de ADN purificado (a una concentracion aproximada de 30 ng/[micron]L) mediante el uso del kit Thermo sequenase dye terminator cycle sequencing premix (Amersham Bioscience) y 5 [micron]L del cebador pH a una concentracion de 5 pM en un secuenciador automatico de ADN Multigene Termal Cycler TC9600; analisis de las secuencias de ADN: las secuencias obtenidas se introdujeron en el programa BLAST (NCBI) que busca homologias al nivel de nucleotidos o de aminoacidos con secuencias presentes en bases de datos (23).

Resultados

Los resultados de los analisis quimicos de los lodos de ambos rios (Bogota y Tunjuelo), que fueron llevados a cabo en el Laboratorio de Quimica de la Universidad de Oviedo, Espana, fueron los siguientes:

* Cromo hexavalente mayor a 0.005 mg de Cr/L.

* Plomo: mayor a 0.049 mg de Pl/L

* Mercurio: mayor a 0.001 mg de Hg/L.

La evidencia de su presencia es superior a lo establecido por la norma. Igualmente a las muestras se les realizo pruebas para determinar su pH (Laboratorio de Microbiologia de la Facultad de Ingenieria Ambiental de la Universidad Antonio Narino), obteniendose los siguientes resultados:

* Muestra A1 (azul): 7.17

* Muestra A1 (blanca): 7.04

* Muestra B1: 6.83.

Los resultados son la expresion de un ANAVA aplicado al numero total de muestras y su ponderacion. Igualmente, de estas muestras, tomadas en forma consecutiva (cada 15 dias), se obtuvieron diferentes colonias, el predominio fenotipico y comportamiento a la prueba bioquimica de Gram y oxidasa se muestran en la Tabla 1.

Se realizaron repiques para hacer pruebas de identificacion mediante la tecnica de CRYSTAL RAPID, determinandose de esta forma la presunta presencia de los siguientes microorganismos: Corynebacterium genitalium, Corynebacterium diphteriae, Bacillus megaterium, Micrococcus sedentarius, Bacillus meguterium, Aeromonas hydrophila, Aeromonas spp., Pantoea agglomerans y Pseudomonas spp. Los anteriores resultados son producto de la ponderacion del recuento directo de la siembra en medio de cultivo TSA, por triplicado:

La literatura reporta la relacion de algunos de estos microorganismos en la presencia de metales pesados, bien sea como tolerantes o como biotransformadores, y entre ellos tenemos como ejemplo a Corynebacterium genitalium, que presenta sensibilidad al cromato y resistencia al mercurio, resistencia al plomo, Gram positivo; Corynebacterium diphteriae, ha sido aislado de suelos contaminados con metales pesados (cromo VI); Aeromonas hydrophila: Gram negativa, sensibilidad al cromato, resistencia al mercurio y resistencia al plomo; Pantoea agglomerans, crece entre 18[grados]C-25[grados]C, bacilos Gram negativo, aislado en suelos contaminados con cromo VI; Pseudomonas sp, resistencia a cromo VI (11,24), Figura 2.

[FIGURA 2 OMITIR]

Igualmente se realizaron diferentes aislamientos por enriquecimiento, y las especies que demostraron que intervienen, de alguna forma, en tolerancia en el proceso de biotransformacion se relacionan en las Tablas 2-6.

Discusion

En el momento de realizar el analisis de los resultados se debe tener una consideracion importante, dado que, muy a pesar de los grandes adelantos que se presentan en biologia molecular, y el grado de las secuencias con las diferentes bases de datos existentes, hay que considerar que tan solo se ha llegado a aislar el 10% de los microorganismos existentes en el medio ambiente y por esto mismo las bases de datos reportan generos y especies en esta misma proporcion. Debido a las anteriores consideraciones se reportan los resultados de semejanza expresados en genero mas no en especie.

De los resultados, tanto de los aislamientos por triplicado directos, como de los diferentes enriquecimientos, evaluadios mediante un analisis de varianza, se obtuvo la siguiente informacion: de los enriquecimientos directos se presenta una estandarizacion cuantitativa en la presencia de los generos Corynebacterium, Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Micobacterium, Aspergillus, sin embargo la presencia del genero Micrococcus, paso casi que inadvertida, lo cual fue cambiando a traves de los enriquecimientos selectivos y de los enriquecidos con metales, llegando a dominar con su presencia.

[FIGURA 3 OMITIR]

Con lo anterior, se ratifica la importancia de no descartar ningun microorganismo de los aislamientos directos, los cuales pueden aparecer en forma poco significativa frente a las dominantes que pueden estar degradando metabolitos intermedios u otros sustratos presentes producto de la degradacion del mismo medio, Figura 3.

La biotransformacion de estos metales, tanto en los enriquecimientos con medio de cultivo con lodos como en los que se les adiciono Cr, Pl y Hg a los lodos esterilizados, fue casi total, demostrando la eficiacia de todos los generos presentes bien sea trasformado los metales directamente o suplementando otros bioelementos para facilitar este proceso.

Agradecimientos

A la Direccion Nacional de Investigaciones de la Universidad Antonio Narino, por la financiacion de este proyecto. Igualmente al laboratorio de Quimica de la Universidad de Oviedo por los analisis quimicos de las muestras.

Referencias

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Catherine Soto [1], Sonia Gutierrez [1], Alexandra Rey-Leon [1], Edwin Gonzalez-Rojas [1]

[1.] Grupo de Investigacion GRESIA, Universidad Antonio Narino Correspondencia: edwigonzalez@uan.edu.co

Recibido: 16-07-10/Aceptado: 02-12-10
Tabla 1. Caracteristicas morfologicas de los microorganismos aislados.

Colonias           A1             A2           A3          A4

Color            Beige         Blancas       Blancas    Amarilla
aparente

Morfologia    Cocobacilos      Bacilos       Bacilos     Bacilos
                             esporulados

Gram            Negativo      Positivas     Negativo    Negativo

Oxidasa         Negativo      Positivas     Negativa    Negativo

Colonias         A5           A6             A7            A8

Color          Rosada      Amarilla       Rosadas       Blancas
aparente

Morfologia     Bacilos    Cocobacilo    Cocobacilos      Cocos

Gram          Negativo     Negativo       Negativo     Positivos

Oxidasa       Negativo     Positiva       Negativo      Positivo

Tabla 2. Primer enriquecimiento.

     MUESTRA AI-1                       MUESTRA AI-2

Colonias blancas: Bacilos        Colonias blancas: Cocos Gram
Gram positivos                   positivos
Corynebacterium ge nitaliutn/    Micrococcus stdenlarius
  diphteriae

Colonias amarillas: Bacilos      Colonias beige: Cocos Gram
Gram positivos                   positivos
Bacillus, spp                    Corynebacterium genitalium

                                 Colonias crema: Cocos Gram
                                 positivos
                                 Micrococcus sedentarios

                                 Colonias amarillas: Bacilos
                                 Gram positivos
                                 Pantoae spp.

     MUESTRA AI-3                     MUESTRA AI-4

Colonias blancas;                Colonias amarillas: Bacilos
Cocos Gram positivos             Gram positivos
Micrococcus sedentarios          Corynebactyerium

Colonias amarillas: Bacilos      Colonias blancas: Bacilos Gram
Gram positivos                   positivos

                                 Colonias beige; Cocos Gram
                                 positivos

Tabla 3. Cepas aisladas del segundo enriquecimiento.

     MUESTRA BI-1                     MUESTRA BI-2

Colonias blancas: Bacilos        Colonias blancas: Bacilos
Gram positivos                   Gram positivos
Corynebacterium genitalium/
  diphtheriae

Colonias beige: Bacilos Gram     Colonias beige: Bacilos Gram
positivos                        positivos
Corynebacterium genitalium /     Corynebacterium
  especies de Corynebacterium      pseudogenitalium

Colonias transparentes:          Colonias crema: Cocos Gram
Bacilos Gram positivos.          positivos
                                 Micrococcus seden tarius

     MUESTRA BI-3                     MUESTRA BI-4

Colonias beige:                  Colonias blancas: Cocos Gram
Bacilos Gram positivos           positivos
                                 Micrococcus seden tari us

                                 * Colonias beige:
                                 Bacilos medianos Gram positivos

Tabla 4. Del tercer enriquecimiento tenemos.

MUESTRA CI

Agar Nutritivo                           Agar Sabouraud

Colonia blancas                        Colonia amarillas
Corynebacterium                        Pantoea aglomeraos

MUESTRA CI

Agar Nutritivo                           Agar Sabouraud

Colonia blancas                        Colonia amarillas
Aeromonas hydrophila                    Corynebacterium
                                          genitalium/
                                          diphtheriae

Tablas 5 y 6. Resultados del cuarto enriquecimiento.

MUESTRA AI-1                           MUESTRA
                                       AI-2/A-2

Colonia blanca                 Colonia blanca
Corynebacterium genitalium/    Micrococcus sedentarius
  diphtheriae

Colonia amarilla               Colonia beige
Pseudomonas                    Corynebacterium genitalium

                               Colonia crema
                               Micrococcus sedentarius

                               Colonias amarillas: Bacilos
                                 Gram
                               positivos
                               Pseudomanas

MUESTRA AI-3/A3                        MUESTRA
                                       AI-4/A4

Colonia blanca                 Colonia amarilla
Micrococcus sedentarius        Pantoe

MUESTRA BI-1                         MUESTRA BI-2

Colonia blanca                 Colonia beige
Corynebacterium                Corynebacterium
genitalium/diphtheriae           pseudogenitalium

Colonia beige
Corynebacterium genitalium/    Colonia crema
  especies de
Corynebacterium                Micrococcus sedentarius

MUESTRA BI-3                        MUESTRA BI-4

Colonia beige                  Colonia blanca
                               Micrococcus sedentarius
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Title Annotation:ARTICULO PRODUCTO DE LA INVESTIGACION
Author:Soto, Catherine; Gutierrez, Sonia; Rey-Leon, Alexandra; Gonzalez-Rojas, Edwin
Publication:NOVA
Date:Jul 1, 2010
Words:4497
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