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Biosensor de glucosa basado en un biocomposito disperso de grafito-epoxi-platino-glucosa oxidasa.

INTRODUCCION

La necesidad de contar con resultados analiticos precisos y confiables para la monitorizacion y el control de procesos quimicos, ha originado el desarrollo de nuevos y sofisticados metodos de analisis que requieren de una costosa instrumentacion, instalacion y mantenimiento, lo que ha dado lugar a la aparicion de una sub-disciplina de la quimica analitica que es, la quimica analitica de procesos, cuyo objetivo principal consiste en suministrar informacion cualitativa y cuantitativa de un determinado proceso quimico en funcion del tiempo; informacion que ademas de permitir la monitorizacion y el control de los parametros de calidad, tambien es util para optimizar de manera eficiente y desde el punto de vista industrial, el consumo de energia y de materias primas, asi como la duracion del proceso y el aspecto final del producto terminado (Riebe, 1990; Ferreira et al., 2003).

Aunado a ello, se han desarrollado tambien pequenos, sencillos y versatiles dispositivos que permiten simplificar la adquisicion de informacion analitica, sin renunciar a la selectividad y sensibilidad que brindan los poderosos metodos instrumentales de analisis. Se trata de los sensores quimicos, simples dispositivos analiticos que responden selectiva y cuantitativamente a un tipo de analito en particular, a traves de una reaccion quimica en la que se generan senales primarias de reconocimiento, las cuales posteriormente son convertidas en senales electricas a traves de un transductor (Gomez y Alegret, 1997; Kissinger, 2005). Los sensores quimicos estan constituidos por dos partes principales: un elemento de reconocimiento molecular o receptor que solo reconoce al analito por cuantificar, y un elemento transductor de la senal de reconocimiento, en cuya superficie se encuentra inmovilizado el receptor (Fig. 1) (Thevenot et al., 2001).

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El sistema de reconocimiento o receptor (R) solo reconoce el analito por cuantificar ([DELTA]) presente en la muestra. La senal generada en el proceso de reconocimiento es convertida en una senal electrica mediante el transductor (T), la cual posteriormente es amplificada (A) y finalmente procesada y presentada en forma digital (P). El receptor puede interactuar con el analito a traves de mecanismos fisicos, quimicos o biologicos.

La escasa versatilidad en la disponibilidad de receptores sinteticos es determinante para que los sensores quimicos presenten un grado de reconocimiento limitado, lo que origino el uso de materiales biologicos como elementos de reconocimiento molecular, mucho mas selectivos y versatiles que los de tipo sintetico. A estos sensores quimicos que incorporan materiales biologicos como elementos de reconocimiento molecular, se les dio el nombre de biosensores (Wang, 2001; Sharma et al., 2003; Kissinger, 2005). Debido a su alta selectividad y sensibilidad, las enzimas destacan como los elementos de reconocimiento molecular mas utilizados en la construccion de biosensores (Dornelles y Tatsuo, 2002, Leonard et al., 2003).

El primer biosensor fue un analizador de glucosa desarrollado por Clark y Lyons en 1962 y comercializado a partir de 1975 por Yellow Springs Instrument Company. Este biosensor se denomino "enzyme electrode" y consistia en un dispositivo que contenia la enzima glucosa oxidasa acoplada a un electrodo para oxigeno (Chaubey y Malhotra, 2002). Desde entonces, el desarrollo de los biosensores se ha centralizado en el campo del diagnostico clinico debido a lo cual, el biosensor de glucosa ha sido el biosensor mas desarrollado a nivel mundial (Wang, 2001, Newman y Turner, 2005; Kissinger, 2005). Gracias al apoyo de los instrumentos de la biotecnologia y a la investigacion postgenomica, los biosensores actualmente suponen potentes herramientas de analisis que encuentran numerosas aplicaciones en la industria agroalimentaria medioambiental, quimico, farmaceutico y militar (Rekha et al., 2000; Patel, 2002; Ferreira et al., 2003). En la industria agroalimentaria, las tres grandes areas de aplicacion de los biosensores son: seguridad alimentaria, calidad alimentaria y control de procesos (Gonzalez et al., 2005).

Las caracteristicas mas destacables que convierten a los biosensores en opciones altamente atractivas para competir en el mercado con otras tecnologias son: su especificidad, su alta sensibilidad, su corto tiempo de analisis, su capacidad de inclusion en sistemas integrados, su facilidad de automatizacion, su capacidad de trabajar en tiempo real, su versatilidad que permite el diseno de dispositivos a la carta, y su bajo coste, entre otras (Gonzalez et al., 2005)

Desde sus origenes y hasta la actualidad se han desarrollado diferentes configuraciones del biosensor de glucosa, en la mayoria de ellas se utiliza la enzima glucosa oxidasa (GOD) inmovilizada de diversas formas y empleando diferentes sistemas de transduccion de la senal (Wang, 2001; Patel, 2002; Nakamura y Karube, 2003; Zhou et al., 2008). La reaccion basica catalizada por esta enzima es la siguiente:

Glucosa + [O.sub.2] [??] Acido gluconico + [H.sub.2][O.sub.2]

Estos prototipos presentan un reducido intervalo de concentracion de respuesta lineal, asi como un corto tiempo de vida media debido a la constante perdida de material sensor (enzima y mediador electroquimico) desde el cuerpo del biosensor al seno de la solucion (Chaubey y Malhotra, 2002; Dornelles y Tatsuo, 2002; Shan et al., 2007). Es por ello que, el objetivo del presente trabajo consistio en desarrollar un biosensor de glucosa de matriz de fase solida, en donde se aprovechan las propiedades electroquimicas del platino para regenerar la enzima glucosa oxidasa y para conducir el flujo de electrones desde la enzima hacia la superficie del electrodo del amperimetro, buscando con ello mejorar el intervalo de respuesta y la estabilidad del biosensor.

MATERIALES Y METODOS

Materiales

Resina EpoTek-H77 (Epoxy Technology, USA), grafito en polvo (BDH Laboratory Supplies, England), platino en polvo (Sigma-Aldrich, USA) y glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4) con 160 UA/mg de solido (Sigma, USA), Frudex 55, 70, 80 y 90 (Arancia, Mexico). Glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, galactosa, acido ascorbico, acido citrico y acido malico (Sigma, USA). El, resto de los reactivos fueron grado analitico y en la preparacion de las soluciones se utilizo agua bidestilada.

Construccion del Biosensor

La construccion del biosensor de glucosa se baso en el modelo descrito por Gomez y Alegret, (1997). El biosensor esta formado por dos partes: el biocomposito y el cuerpo. El biocomposito esta constituido por una fase conductora de la electricidad (grafito), dispersa en una fase polimerica (resina epoxi) que aglutina e inmoviliza los constituyentes del sistema sensor integrados por la enzima glucosa oxidasa y el platino en polvo como mediadores redox. La proporcion en que se combinan estos constituyentes es 63:17:17:3. Por su parte, el cuerpo del biosensor consta de un tubo de PVC en el que se introduce un conector electrico unido a una lamina de cobre (Fig. 2). El hueco entre el tubo y la lamina se rellena con el biocomposito y se somete a un curado termico a 40[grados]C/6 dias, al cabo de los cuales la superficie del biosensor es pulida con papel alumina (Orion, USA). El biosensor se mantuvo en refrigeracion a 4[grados]C cuando no era utilizado.

[FIGURA 2 OMITIR]

Caracterizacion del Biosensor

El potencial de trabajo del biosensor se determino por voltamperometria de barrido lineal en un analizador electroquimico Autolab PGSTAT20 (Eco Chemie, Holanda). El barrido de potencial se realizo entre 0 a 800 mV y a una velocidad de 50 mV/s. Inicialmente el barrido se realizo sobre el electrolito soporte (solucion reguladora de fosfatos 0.1M mas KCl 0.1M a pH de 7.5 y 25[grados]C) y posteriormente sobre soluciones de glucosa de diferente concentracion; todas ellas preparadas con el mismo electrolito soporte como disolvente. Una vez conocido el potencial de trabajo se realizo la caracterizacion de la respuesta del biosensor a diferentes condiciones de trabajo, para ello se utilizo un detector amperometrico LC-4C (Bioanalytical Sistems Inc. USA). En todos los casos, las determinaciones se realizaron en una celda electroquimica de 50 mL provista de doble pared para control de temperatura y a un pH de 7.5 y temperatura de 25[grados]C, excepto cuando se estudia el efecto del pH y la temperatura sobre la respuesta del biosensor, respectivamente. De esta forma se determino el efecto del tiempo de reaccion, el efecto del pH, el efecto de la temperatura y de la concentracion de sustrato sobre la respuesta del biosensor desarrollado (Habermuller et al., 2000; Rekha et al., 2000). Finalmente tambien se evaluo la estabilidad de la respuesta del biosensor con respecto al tiempo; para ello se hicieron evaluaciones diarias durante los primeros quince dias despues de su construccion, posteriormente las determinaciones se hicieron cada cinco dias durante un mes y por ultimo cada quince dias durante cuatro meses. El biosensor se utilizo como electrodo de trabajo frente a un electrodo de referencia de Ag/AgCl (Orion USA), y un electrodo auxiliar de platino modelo 108053117 (Ingold, Suiza). La superficie del biosensor fue pulida entre determinaciones sucesivas y las lecturas fueron tomadas un minuto despues de adicionar el sustrato. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado y puliendo la superficie del electrodo entre determinaciones sucesivas.

Analisis estadistico de los resultados

Los datos reportados corresponden a la media aritmetica de tres determinaciones sucesivas puliendo la superficie del biosensor entre una determinacion y otra. Adicionalmente se realizaron analisis de varianza (ANOVA) y se identificaron las diferencias en los valores promedio mediante la prueba de Duncan con un factor de confianza del 95%, utilizando el software estadistico SPSS version 9.0 para Windows (Fry, 1996).

RESULTADOS Y DISCUSION

Determinacion del potencial de trabajo (E)

El biosensor desarrollado respondio a la concentracion de glucosa en el medio de reaccion y su respuesta fue maxima a un potencial de trabajo de 600 mV (Fig. 3). Este potencial de trabajo del biosensor de glucosa desarrollado es relativamente elevado comparado con el de biosensores de segunda o tercera generacion (Habermuller et al., 2000, Newman y Turner, 2005), lo que conlleva a posibles interferencias de especies electroactivas como el acido ascorbico, las cuales pueden estar presentes en muestras reales (Dornelles y Tatsuo, 2002).

[FIGURA 3 OMITIR]

Estimacion del tiempo de respuesta

A partir del momento en que se adiciona la glucosa a la celda electroquimica, el tiempo minimo requerido para alcanzar la estabilidad de la senal del biosensor fue de 20 segundos; es decir, para llegar al 95% de la intensidad maxima de la senal. Este tiempo de respuesta es similar al que presentan algunos biosensores reportados en la literatura (Zhang et al., 2010). No hubo diferencias estadisticas significativas en la intensidad de corriente registrada a mayores tiempos de respuesta y a las diferentes concentraciones de glucosa ensayadas (Fig. 4).

[FIGURA 4 OMITIR]

Efecto de la Temperatura y el pH

Dado que la actividad de una enzima y por lo tanto la respuesta y la estabilidad de un biosensor enzimatico dependen del pH y de la temperatura del medio de reaccion, la temperatura y el pH de trabajo de un biosensor debe cumplir con dos requisitos: proporcionar la maxima sensibilidad y estabilidad al biosensor (Retama et al., 2005; Ricci et al., 2007). La respuesta del biosensor de glucosa fue maxima a una temperatura de 30[grados]C (Fig. 5-A) y a pH de 7.5 (Fig. 5-B). A mayores valores de temperatura y pH se inicia la inactivacion de la enzima y por ende, disminuye la respuesta del biosensor. La intensidad de la respuesta del biosensor se incremento en 1.87 veces dentro del intervalo de temperatura comprendido entre 20-30[grados]C. Por lo anterior, con objeto de garantizar la estabilidad del biosensor desarrollado, todas las determinaciones posteriores se realizaron a un pH de 7.5 y a una temperatura de 25[grados]C.

[FIGURA 5 OMITIR]

Efecto de la concentracion de glucosa

La respuesta del biosensor fue directamente proporcional a la concentracion de glucosa dentro del un intervalo de concentraciones comprendido entre 0.1 a 5 mM de glucosa (r=0.9925 para n=3 determinaciones)(Fig. 6).

[FIGURA 6 OMITIR]

Dentro del intervalo de concentraciones de respuesta lineal (de 0.1 a 5 mM), la maxima sensibilidad del biosensor fue de 1.468 [micron]A/mM y su limite de deteccion inferior fue de 0.05 mM, el cual se obtuvo a una relacion senal:ruido de 3.0, mientras que el limite de deteccion superior se establece a traves de la curva de calibracion y en este caso fue de 5.0 mM de glucosa y corresponde a la concentracion de glucosa donde el valor del coeficiente de correlacion de la curva de calibracion es mayor de 0.99; en nuestro caso, r=0.9925. Al comparar este intervalo de operacion del biosensor desarrollado con los que se encuentran reportados en la literatura para biosensores similares, podemos darnos cuenta de que dichos intervalos de operacion dependen tanto del sistema de transduccion de la senal empleado como del diseno mismo del biosensor; es decir, de su configuracion (Dorneles y Tatsuo 2002; Ricci et al., 2005; Njagi y Andreescu, 2007; Pemberton et al., 2009; Zhang et al., 2010). Desde el punto de vista operativo, es importante que los biosensores presenten un amplio intervalo de concentraciones de respuesta lineal, especialmente cuando se pretende que operen en procesos continuos, donde no es posible ajustar las concentraciones de los analitos dentro de los intervalos de respuesta lineal de dichos instrumentos (Rekha et al., 2000), pero en el caso de operar en procesos discontinuos o por lote, resulta irrelevante que tan amplio sea este intervalo de concentraciones de respuesta lineal del biosensor, puesto que aun asi es necesario ajustar la concentracion del analito en las muestras por analizar, a fin de que dicha concentracion caiga dentro del intervalo de respuesta lineal del biosensor (Ferreira et al., 2003; Montanez et al., 2006).

Reproducibilidad de la senal

La reproducibilidad de la respuesta del biosensor se determino en dos modalidades; una de ellas fue puliendo su superficie con papel alumina entre una determinacion y otra, mientras que la otra se hizo sin pulir su superficie entre determinaciones sucesivas. La utilizacion continua del biosensor se ve acompanada de una notable disminucion de su sensibilidad, cuando su superficie no es pulida entre una calibracion y otra, a tal grado que despues de 10 calibraciones sucesivas (Fig. 7, calibraciones 1-10), el biosensor de glucosa mantiene solo el 25% de su sensibilidad inicial; pero dicha sensibilidad se recupera al 100% y se mantiene practicamente constante (DER=1.14 para n=10) mediante un simple pulido de su superficie con papel de alumina (Fig. 7: calibraciones 11-20); lo cual es indicativo de la homogeneidad en la mezcla del biocomposito, puesto que en cada pulida del biosensor se renueva la superficie sensitiva integrada por la enzima y el elemento transductor de la senal.

[FIGURA 7 OMITIR]

La disminucion de la sensibilidad del biosensor de glucosa cuando no se pule su superficie entre una calibracion y otra, puede atribuirse a la perdida de la enzima que se encuentra en la superficie del biosensor debido a fenomenos de solubilidad o bien, por una desnaturalizacion progresiva de la misma; fenomeno que ya ha sido observado por otros investigadores (Montanez et al., 2006).

Estabilidad y vida de operacion

La sensibilidad del biosensor de glucosa se mantuvo practicamente constante durante los primeros 120 dias (Fig. 8), ya que durante este periodo no se presento una diferencia estadistica significativa en la sensibilidad relativa del biosensor, lo cual es apoyado por el relativamente bajo valor de la desviacion estandar relativa de la serie (DER=1.26% para n= 51).

[FIGURA 8 OMITIR]

Despues 24 meses el biosensor de glucosa desarrollado aun conserva el 85% de su sensibilidad inicial; es decir, durante ese tiempo su sensibilidad ha disminuido solo en un 15%. Esta perdida de sensibilidad del biosensor de glucosa con respecto al tiempo, podria deberse a una inactivacion progresiva de la enzima que se encuentra inmovilizada en el biocomposito; de aqui la importancia de almacenar el biosensor en refrigeracion a 4[grados]C cuando no se esta utilizando.

De acuerdo con estos resultados, podemos decir que el biocomposito actua como reservorio de enzima y de mediador electroquimico, por lo que la vida util de estos dispositivos queda determinada por el tiempo que tarde en agotarse el material sensor que integra el biocomposito, y este a su vez, de la frecuencia con que se utilice el biosensor, ya que entre una determinacion y otra, cada vez que se pule la superficie del biosensor se va perdiendo parte del material sensor que integra el biocomposito (Montanez et al., 2006).

Selectividad de la respuesta del biosensor

La selectividad se refiere a la capacidad del biosensor para evitar la respuesta que pueden causar sustancias interferentes, ya sea que interfieran con la enzima del biosensor, o bien, sustancias electroactivas que puedan sufrir reacciones de oxido-reduccion al potencial de trabajo del biosensor (Rekha, 2000). Para determinar la selectividad del dispositivo, la respuesta del biosensor de glucosa desarrollado se midio en presencia de algunas posibles sustancias interferentes tales como fructosa, sacarosa, maltosa, galactosa, lactosa, acido ascorbico, acido citrico y acido malico. Las determinaciones se realizaron a un potencial de trabajo de E=600 mV y empleando un electrodo de Ag/AgCl como electrodo de referencia; como electrolito soporte se utilizo una solucion reguladora de fosfatos 0.1M mas KCl 0.1M a pH de 7.5 y 25[grados]C y a una concentracion de glucosa 2 mM e igual concentracion de las sustancias interferentes (Montanez et al., 2006). En presencia de cualquiera de las posibles sustancias interferentes, el biosensor respondio selectivamente a la glucosa, que es el sustrato natural de la enzima glucosa oxidasa, pero su respuesta se vio notablemente alterada en presencia del acido ascorbico, el cual causo un incremento del 8.5 [+ o -] 0.6% en la respuesta del biosensor de glucosa. Esto demuestra que por el lado de la accion de la enzima el biosensor es altamente selectivo, propiedad que le confiere la enzima glucosa oxidasa utilizada como elemento de reconocimiento molecular. El inconveniente surge por el lado del potencial de trabajo del biosensor, el cual es mayos que el potencial redox de algunas especies electroactivas como el acido ascorbico, el cual puede encontrarse en muestras reales.

Determinacion del contenido de glucosa en muestras reales

El contenido de glucosa en cuatro diferentes jarabes de maiz de alto contenido de fructosa (Frudex 55, 70, 80 y 90) fue determinado con el biosensor de glucosa desarrollado y por medio de la cromatografia de liquidos de alta presion (Versele y Van Dame, 1987). Para ello se utilizo un Cromatografo de Liquidos LDC modelo 3200 (Variant, USA) equipado con un detector de indice de refraccion modelo 350 (Variant, USA) y una bomba LDC Analytical. Se utilizo una columna SPHEREX 5NH2 de 250mm de longitud y 4.6mm de diametro. Como fase movil se utilizo una solucion de acetonitrilo:agua en relacion 85:15. Las condiciones de trabajo fueron: velocidad de flujo de 0.4 mL/min, temperatura de 35[grados]C y los estandares se inyectaron a una concentracion de 2 mg/mL. Los resultados promedio de tres determinaciones sucesivas obtenidos por ambos metodos se muestran en la tabla 1.

No existe diferencia estadistica significativa en los resultados de concentracion de glucosa obtenidos por ambos metodos analiticos para cada uno de los cuatro diferentes jarabes de maiz con alto contenido de fructosa analizados y en todos los casos, se obtuvo una desviacion estandar relativa inferior al 2%, lo cual es indicativo de la alta correlacion que existe entre los resultados obtenidos de concentracion de glucosa obtenidos con el biosensor desarrollado, y los proporcionados por la cromatografia de liquidos de alta presion como metodo de referencia.

CONCLUSIONES

El alto potencial de trabajo (E = 600 mV) requerido por el biosensor desarrollado implica el tener que trabajar con muestras reales libres de especies electroactivas que puedan interferir en la respuesta del dispositivo.

El biocomposito constituye una mezcla homogenea de material sensor, pues no existen diferencias estadisticas significativas entre las respuestas del biosensor cuando su superficie es pulida entre una determinacion y otra.

Su reducido tiempo de respuesta y su amplio intervalo de concentraciones de respuesta lineal, convierten a este biosensor en una prometedora herramienta analitica para el monitoreo y control de procesos donde existe la necesidad de cuantificar la glucosa.

La aplicacion del biosensor desarrollado proporciona datos analiticos similares a los obtenidos por cromatografia de liquidos de alta presion al cuantificar el contenido de glucosa en muestras reales.

El dispositivo responde selectivamente a la concentracion de glucosa presente en la muestra, excepto cuando en la misma se encuentra el acido ascorbico

La vida util del biosensor esta determinada por su frecuencia de uso, ya que el biocomposito actua como reservorio de enzima y mediador electroquimico para sucesivas aplicaciones.

doi: 10.4067/S0718-07642011000100005

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Jose L. Montanez (1), Emma G. Ramos (2), Salvador Alegret (3) y Raul J. Delgado (4)

(1) Centro Interdisciplinario de Investigacion para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR-IPN-MICH). Justo Sierra 28, C.P. 59510. Jiquilpan, Mich.-Mexico (e-mail: montasoto@yahoo.com.mx)

(2) Depto. de Biotecnologia y Vioingenieria, Centro de Investigacion y Estudios Avanzados, Instituto Politecnico Nacional, (CINVESTAV-IPN), Avenida IPN 2508, C.P. 07300, Mexico, D.F.-Mexico

(3) Departamento de Quimica, Grupo de Sensores y Viosensores, Universidad Autonoma de Barcelona, 08193 Vellaterra, Cataluna (Espana) (e-mail: salvador.alegret@uab.cat)

(4) Centro de Investigacion en Biotecnologia Aplicada, Instituto Politecnico Nacional, Km 1.5 Carretera Tecuexcomac-Tepetila, C.P. 90600, Tlaxcala, Mexico. (e-mail: rdmacuil@yahoo.com.mx)

Recibido May. 04, 2010; Aceptado Jun. 04, 2010; Version Final recibida Jun. 23, 2010
Tabla 1: Contenido de glucosa determinado por HPLC y con el biosensor
de glucosa desarrollado

Muestra            HPLC              Biosensor         Desviacion
             Glucosa (g/100g)     Glucosa (g/100g)      estandar
                                                      relativa (%)

Frudex 55   46.84 [+ o -] 0.75   46.76 [+ o -] 0.25       1.55
Frudex 70   30.75 [+ o -] 0.56   30.45 [+ o -] 0.36       1.25
Frudex 80   20.65 [+ o -] 0.35   20.50 [+ o -] 0.28       1.15
Frudex 90   10.35 [+ o -] 0.45   10.15 [+ o -] 0.55       1.05
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Author:Montanez, Jose L.; Ramos, Emma G.; Alegret, Salvador; Delgado, Raul J.
Publication:Informacion Tecnologica
Date:Feb 1, 2011
Words:4604
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