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Biocompatibilidad del fosfato tricalcico con quitosano para su uso en regeneracion osea.

Biocompatibility of Tricalcium Phosphate with Chitosan for Bone Regeneration Purposes

Biocompatibilidade do fosfato tricalcico com quitosano para seu uso na regeneracao ossea

INTRODUCCION

El hueso es un tejido conectivo sumamente vascularizado e inervado compuesto por celulas y minerales de la matriz organica. Es capaz de regenerarse y remodelarse por medio de un proceso de reabsorcion y aposicion osea. Ademas, es regulado por factores geneticos, nutricionales, mecanicos, vasculares, hormonales y locales, entre los cuales se encuentran factores de crecimiento, citocinas y proteinas de la matriz osea. La reparacion y regeneracion de defectos de tamano variable que resultan de traumas, tumores e infecciones representan un reto para las cirugias ortopedica, reconstructiva periodontal y maxilofacial que usan trasplantes oseos (1-3).

Entre los injertos oseos, el hueso autologo es el patron de referencia (gold standard) en cirugia reconstructiva, debido a sus propiedades osteogenica, osteoconductiva y osteoinductiva. Sin embargo, presenta limitaciones como la disponibilidad de las cantidades adecuadas y la necesidad de dos sitios quirurgicos (donante y receptor), lo cual aumenta la morbilidad para el paciente (3). Como alternativa al hueso autologo se dispone del tejido oseo procesado, que se origina de donantes humanos (vivos o muertos), por medio de bancos de tejidos y organos. Ellos ofrecen la posibilidad de disponer de cantidades mayores de tejido a costos razonables (2,4), asi como de materiales procedentes de otras especies como bovinos, porcinos y corales (2).

Los materiales originados en otras especies (xenoinjertos) y los procedentes de donantes (homoinjertos) no estan exentos de posibilidad de transmision de enfermedades al paciente (5-7). Ello justificaria el desarrollo de materiales de origen sintetico como una alternativa en regeneracion osea (8).

En disenos experimentales y en situaciones clinicas, existe el defecto de tamano critico o volumen critico. Este tipo de defecto es una preparacion en la cual la perdida de tejido oseo es tan grande que el tejido es incapaz de regenerarse por si mismo en un periodo de 8 meses desde cuando se produce la lesion (9). La regeneracion de defectos de tamano critico implica el uso de materiales bioactivos, como los sustitutos oseos tipo aloinjertos o xenoinjertos, que son productos bioinertes que al ser aplicados en estos tipos de defectos pueden generar un encapsulamiento fibroso. Se comportan solo como material de relleno, a diferencia de los materiales bioactivos, capaces de generar una interfaz funcional con el hueso circundante (8).

El desarrollo tecnologico ha posibilitado el surgimiento de sustitutos oseos con propiedades de biocompatibilidad y de osteoconduccion, asi como la posibilidad de ser bioactivados mediante tecnicas de ingenieria tisular. Con ello se brindan cualidades de osteopromocion u osteoinduccion (10,11). Por lo tanto, los biomateriales sinteticos para uso en regeneracion osea presentan ventajas como seguridad biologica, biocompatibilidad, disponibilidad ilimitada y bajo costo.

Dentro de los biomateriales sinteticos, se ha investigado y usado el fosfato tricalcico como sustituto oseo en formas densas y porosas en procedimientos de regeneracion osea (10,12,13). Debido a su composicion quimica y su estructura porosa, el fosfato tricalcico es de facil manipulacion, es biocompatible y tiene propiedades de reabsorcion y osteoconduccion, lo que permite que ocurra cicatrizacion y remodelado oseo. De hecho, se ha encontrado neoformacion activa de hueso alrededor y en intimo contacto con el fosfato tricalcico, aun despues de 6 meses de su implantacion en defectos oseos (14), asi como una respuesta inflamatoria minima (10). Adicionalmente, el fosfato tricalcico, junto con el quitosano, se ha empleado para mejorar la osteoconduccion y la quimiotaxis de las celulas osteogenicas para estimular la formacion osea (15).

El quitosano es un deacetilado derivado de la quitina, responsable de las interacciones electrostaticas con los aniones de glicosaminoglicanos, proteoglicanos (citocinas) y otras moleculas cargadas negativamente, lo que le permite retener y concentrar factores de crecimiento secretados por las celulas osteogenicas, ejercer un efecto quimiotactico y aumentar la osteoconduccion (16). Ademas, es un biomaterial reabsorbible, ya que se degrada mediante hidrolisis por accion de la lisosima y no provoca reaccion de cuerpo extrano ni encapsulacion fibrosa. Su cicatrizacion se da mediante un tejido de granulacion asociado a una angiogenesis acelerada. Ademas, posee una propiedad antimicrobiana intrinseca, ya que interrumpe el transporte de compuestos organicos e inorganicos a traves de la pared celular bacteriana, lo que provoca la muerte de la bacteria y reduce la tasa de infeccion en la zona que se busca regenerar. Por esta razon, el quitosano se ha usado, junto con alginatos, hidroxiapatita, acido hialuronico, fosfato de calcio y factores de crecimiento, entre otros biomateriales, para su uso en ortopedia (16,17).

El quitosano se anade al cemento de fosfato de calcio y se usa in vivo para el relleno de defectos oseos en huesos del craneo, lo que ha permitido comprobar su biocompatibilidad, osteoconduccion, reabsorcion y remodelado. A su vez, se ha observado que al anadir quitosano al cemento de fosfato de calcio, se crean macroporos y se obtiene un efecto de sinergia como material osteoconductor (16,17).

El objetivo de este estudio fue caracterizar y describir in vivo macroscopica e histologicamente el comportamiento de una nueva formulacion de un biocompuesto experimental del sistema [beta]-fosfato tricalcico/ quitosano al ser usado como injerto en piel, musculo y hueso bajo condiciones fisiologicas.

MATERIALES Y METODOS

Este estudio de diseno experimental fue aprobado por el Comite de Etica Animal de la Universidad del Valle, en Cali, Colombia. Se utilizaron 15 ratas wistar adultas, machos de tres meses de vida, cuyo peso promedio fue 350 g. Se distribuyeron en 5 grupos, para un total de 3 biomodelos por grupo como indica la norma ISO 10993-6 (18). En los 2 primeros grupos (A y B) se implantaron 2 muestras del material experimental y 2 muestras del control (esponjas de colageno) a cada lado de la linea media corporal. La ubicacion en el grupo A fue subdermica y en el B fue intramuscular lumbar. Los grupos C, D y E fueron intervenidos para la preparacion de defectos oseos bilaterales de 5 mm de diametro y 0,8 mm de profundidad total en los huesos parietales. Por tratarse de un defecto de tamano critico, se realizo el modelo de control del tejido oseo por defecto vacio.

Protocolo de sedacion de los biomodelos

La sedacion de los biomodelos se realizo con una mezcla de barbituricos: maleato de acepromacina, 6 mg/kg via intramuscular; xilacina al 2 %, 6 mg/kg via intramuscular; y ketamina 7 mg/kg via intramuscular. Los biomodelos se pesaron para aplicar las dosis necesarias de los medicamentos anestesicos y obtener la sedacion deseada.

Protocolo de implantacion del fosfato tricalcico con quitosano en piel y musculo

En el grupo A se realizo sedacion, tricotomia y desinfeccion con solucion de Isodine(r) en la region dorsal del biomodelo. Se hizo una incision de 2 cm con mango de bisturi No. 3 y hoja No. 15 hasta llegar al tejido subcutaneo. Se crearon 2 cavidades a lado y lado de la linea media dorsal por medio de pinzas romas. El fosfato tricalcico con quitosano se implanto en la cavidad del lado derecho y como material de control se implanto una esponja de colageno en el lado izquierdo. La incision se suturo con puntos simples en la piel utilizando sutura absorbible 4,0 y se aplico gentamicina topica sobre la herida. Como cuidados postoperatorios se aplicaron 600 mg intramusculares de clindamicina y 2 mg/kg de peso de tramadol; asi mismo, se suministro acetaminofen en gotas durante los 5 dias siguientes.

En el grupo B se realizo el mismo protocolo descrito en piel para acceder al musculo gluteo derecho, donde se prepararon 2 cavidades en el centro del musculo y en direccion paralela a las fibras musculares. Se implanto el fosfato tricalcico con quitosano en el gluteo derecho, y el material de control, en el gluteo izquierdo. La incision se suturo con puntos simples en la piel con sutura absorbible 4,0 y se aplico gentamicina topica. Se llevaron a cabo los mismos cuidados postoperatorios ya mencionados.

Protocolo para implantacion del fosfato tricalcico con quitosano para tejido oseo

Para los biomodelos de los grupos C, D y E se realizo tricotomia y se desinfecto la region del craneo con solucion de Isodine[R]. Sobre la linea media del craneo, se hizo una incision que se extendio desde la zona frontal hasta la occipital. Se elevo un colgajo mucoperiostico y hubo preparaciones circulares de 5 mm de diametro por 0,8 mm de profundidad en la zona mas posterior del hueso parietal. Estas se consideraron defectos oseos de tamano critico. Se retiraron las tapas oseas hasta exponer la duramadre. Las preparaciones del lado derecho recibieron injertos de fosfato tricalcico con quitosano; mientras que las preparaciones control del lado izquierdo se dejaron vacias. Se confrontaron y suturaron los margenes de la herida con sutura absorbible 4,0. Se realizaron los mismos cuidados postoperatorios mencionados.

Protocolo para procesamiento de muestras y analisis histomorfometrico

Se sacrificaron los biomodelos de los grupos A y B a los 20 dias, y los biomodelos de los grupos C, D y E, a los 20, 40 y 60 dias, respectivamente. Para el procedimiento eutanasico se utilizo Eutanex[R] intraperitoneal previa sedacion con barbituricos. Las muestras se cortaron con microtomo para obtener un grosor de 5 [micron]m, se fijaron en formol amortiguado y se enviaron al Laboratorio de Histologia de la Universidad del Valle, para su analisis histomorfometrico.

En este ultimo analisis, las muestras se tineron con hematoxilina-eosina, acido periodico (tincion de PAS), alcian blue y tricromica. Se determinaron los tipos celulares, asi como la presencia de vasos sanguineos y espiculas oseas en cada grupo. La respuesta inflamatoria se evaluo por medio del recuento de celulas en terminos de porcentaje: ninguna (0 %), baja (> 30 %), moderada (30-50 %) y alta (> 50 %), para determinar si el material era biocompatible o no.

RESULTADOS

Descripcion macroscopica

El analisis macroscopico en la piel mostro una cicatrizacion completa. Tanto el material experimental como el de control se observaban bien definidos, sin senales de ulceracion ni exudado purulento (figura 1).

Macroscopicamente, se encontro cicatrizacion completa el tejido muscular. Tanto los materiales experimentales como los de control estaban bien localizados. No se observaron signos de exudado inflamatorio ni purulento (figura 2).

Durante la descripcion macroscopica del tejido oseo, se observo piel, periostio y tejido oseo alrededor de los sitios de injerto y control sin signos de exudado inflamatorio ni purulento. En el defecto vacio (control), se observo una capa delgada de tejido blando; mientras que en la cavidad injertada con el biomaterial experimental habia evidencia de biointegracion (figura 3).

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Descripcion histologica del fosfato tricalcico con quitosano en piel, musculo y hueso

La descripcion histologica en la piel mostro epidermis, dermis e hipodermis de aspecto normal con presencia de un cuerpo extrano amorfo. Este se hallaba en estado de disolucion con infiltrado inflamatorio mixto constituido por celulas mononucleadas, granulocitos y polvillo granular. Alrededor del cuerpo extrano se observo tejido conectivo denso con moderada cantidad de vasos sanguineos (figura 4).

[FIGURA 4 OMITIR]

En el tejido muscular, el biocompuesto experimental presentaba un infiltrado inflamatorio constituido principalmente por linfocitos y macrofagos. A su vez, el material de control mostraba invasion por celulas gigantes multinucleadas. De hecho, ambos tejidos, tanto piel como musculo, presentaban una cantidad de macrofagos entre moderada (30-50 %) y abundante (> 50 %) en los defectos criticos de control; en tanto que en los sitios que recibieron el injerto con el biocompuesto experimental se observaba una cantidad abundante (> 50 %) de linfocitos y baja (> 30 %) de macrofagos, neutrofilos, granulocitos y fibroblastos, lo que representa una respuesta inflamatoria baja o incipiente (figura 5).

Las imagenes histologicas en tejido oseo, 20 dias despues de sacrificar los animales, revelaron una cantidad moderada (30-50 %) de linfocitos y macrofagos, tanto en el sitio experimental como en el control. Ello indica una respuesta inflamatoria aguda, comunmente observada en la fase inicial de cicatrizacion (figura 6). Despues de 40 dias del sacrificio de los biomodelos, se observo una cantidad de baja a moderada de linfocitos y macrofagos en los defectos injertados con el biocompuesto experimental. A su vez, se observo una cantidad moderada de vasos sanguineos, lo cual indica la presencia de angiogenesis. En los defectos control no se observo respuesta inflamatoria, debido a la ausencia de celulas relevantes dentro del proceso de cicatrizacion.

[FIGURA 5 OMITIR]

Despues de 60 dias, en los defectos oseos de tamano critico que recibieron injerto del biomaterial se encontraron una cantidad de baja (< 30 %) a moderada (30-50 %) de linfocitos y macrofagos y abundante (> 50 %) de fibroblastos, neutrofilos y vasos sanguineos. Asimismo, habia presencia de trabeculas y pocos osteoblastos, lo que indica presencia de osteogenesis alrededor de los sitios injertados con el biomaterial experimental. En los defectos del grupo control se encontro una cantidad baja (< 30 %) de linfocitos y macrofagos.

DISCUSION

El presente estudio se diseno para caracterizar y describir in vivo, macroscopica e histologicamente, el comportamiento del biocompuesto ceramico injertado en piel, musculo y hueso, bajo condiciones fisiologicas. El diseno de las pruebas se cino a la norma ISO 10993-6 (biocompatibilidad de los materiales y productos sanitarios dentales) (18) para la aplicacion final del biomaterial en regeneracion osea. Al conocer la necesidad de tratar defectos oseos derivados de trauma, infecciones y tumores, asi como las limitaciones que presentan autoinjertos, aloinjertos y xenoinjertos, en terminos de disponibilidad, morbilidad, seguridad biologica y costo-beneficio (5,19), este equipo investigo el comportamiento del fosfato tricalcico con quitosano in vivo en un modelo animal en diferentes momentos experimentales (20, 40 y 60 dias) para determinar su biocompatibilidad como estimulacion osea para un potencial uso en regeneracion osea.

El biocompuesto experimental se obtuvo por la combinacion del fosfato tricalcico con el quitosano, en una nueva formulacion desarrollada en el laboratorio de la Facultad de Ingenieria de la Universidad Autonoma de Occidente, en Cali, Colombia (20). Los dos materiales se seleccionaron con base en las propiedades de osteoconduccion y bioactivacion del fosfato tricalcico (21,22), su capacidad para mejorar la homeostasis y la cicatrizacion de la herida (15,23), junto con las propiedades sinergicas del quitosano (16,17). Se buscaba obtener una formulacion innovadora de un biomaterial de fosfato tricalcico con quitosano, capaz de regenerar defectos oseos de tamano critico (5 mm de diametro y 0,8 mm de profundidad), que fuera biocompatible, osteoconductora y osteoinductora, y garantizara la seguridad biologica para el paciente.

Las pruebas de biocompatibilidad realizadas in vivo mostraron que, tanto macroscopica como microscopicamente, el fosfato tricalcico con quitosano presento una reaccion inflamatoria asociada al proceso de cicatrizacion en los tres tejidos evaluados (piel, musculo y hueso). El tejido muscular mostro la mayor reaccion inflamatoria en respuesta al biocompuesto, donde se identifico la presencia de linfocitos y macrofagos de forma abundante (> 50 %). En el sitio control se observo una reaccion inflamatoria mayor con presencia de celulas gigantes multinucleadas.

En el analisis histologico del tejido oseo se identifico una inflamacion inicial ocasionada por el trauma quirurgico, asi como por la presencia del material experimental. Sin embargo, se observo una disminucion en la intensidad de la respuesta inflamatoria y evidencia de reparacion osea despues de 60 dias con presencia de angiogenesis y osteogenesis, que estaba caracterizada por la presencia de vasos sanguineos y trabeculas oseas. Estos hallazgos estan de acuerdo con los resultados encontrados en previos estudios (22).

Es importante resaltar que no se encontro tejido conectivo encapsulando el hueso neoformado. Por el contrario, las trabeculas oseas se observaron al lado de las particulas fosfato tricalcico con quitosano. Estos hallazgos coinciden con los resultados obtenidos in vitro por Klokkevold y colaboradores, en 1996 (23), quienes encontraron formacion osea a expensas de celulas osteoformadoras atraidas y unidas a las superficies del quitosano y a una aparente inhibicion de los fibroblastos, lo que explicaria la poca produccion de colageno.

La limitacion del presente estudio se asocia con el tamano de la muestra. El presente estudio se baso en la norma ISO 10993-6, de biocompatibilidad de los materiales y productos sanitarios dentales, ya que sugiere experimentar a partir de tres biomodelos como numero minimo para obtener resultados significativos. A su vez, de acuerdo con el Comite de Etica Animal de la Universidad del Valle, se recomienda trabajar siguiendo el principio de las tres R, formulado por Russel y Burch, en 1959 (24), que plantea los tres requisitos basicos que debe cumplir toda experimentacion con animales: a) reduccion, que se refiere a la utilizacion del minimo numero de animales necesario para obtener un resultado fiable que permita alcanzar el objetivo buscado en la investigacion; b) refinamiento, que se entiende como la implementacion de metodos para evitar o minimizar el dolor de los animales por medio de tecnicas no invasivas, y c) remplazo, que hace referencia a la implementacion de estrategias que eviten o sustituyan el uso de animales por la utilizacion seres vivos invertebrados que carecen de sistema nervioso, como modelos celulares, microrganismos o plantas.

Por otro lado, a pesar de que tanto el fosfato tricalcico como el quitosano se han reportado como biocompatibles, la biocompatibilidad y la citotoxicidad del quitosano depende de su grado de desacetilizacion (25). El presente estudio permitio confirmar la biocompatibilidad del fosfato tricalcico con quitosano en piel, musculo y hueso despues de 20 dias de ser injertado. Ademas, debido a que se encontro hueso neoformado, vasos sanguineos y reabsorcion del biomaterial en defectos oseos de tamano critico despues de 60 dias, se podria explorar su potencial uso en procedimientos de regeneracion osea en humanos.

Los resultados acerca de la biocompatibilidad del material estan de acuerdo con los resultados obtenidos por Arce y colaboradores (20), quienes reportaron un relleno de defectos oseos de tamano critico en tibias de conejos, usando el fosfato tricalcico con quitosano como sustituto oseo. Adicionalmente, esta investigacion muestra un sustituto oseo biocompatible con efecto potencial en la regeneracion de tejidos oseos, sobre todo en defectos de tamano critico.

CONCLUSIONES

El presente estudio confirmo la biocompatibilidad in vivo del fosfato tricalcico con quitosano en piel, musculo y hueso bajo condiciones fisiologicas, en un diseno basado en recomendaciones de la norma ISO 10993-6 (biocompatibilidad de los materiales y productos sanitarios dentales). Ademas, se encontro el biocompuesto rodeado por hueso neoformado en defectos oseos de tamano critico despues de 60 dias, lo que indica una posible estimulacion de la regeneracion osea. Por lo tanto, el fosfato tricalcico con quitosano podria ser una alternativa para su utilizacion como sustituto oseo en procedimientos de regeneracion osea, al presentar ventajas como biocompatibilidad, seguridad biologica, osteoconduccion, osteopromocion, adecuada disponibilidad (cantidad) y bajo costo para el paciente.

RECOMENDACIONES

A futuro se sugiere investigar la biocompatibilidad, el efecto de osteoconduccion y la osteopromocion del fosfato tricalcico con quitosano en defectos oseos de volumen critico en humanos. Adicionalmente, seria conveniente realizar investigaciones adicionales para entender el proceso osteogenico por medio pruebas avanzadas de inmunohistoquimica, que permitan caracterizar elementos de la matriz extracelular, como material osteoide, fibras de colageno y proteinas como el periostin.

doi. 10.11144/Javeriana.uo34-73.bftq

Recibido para publicacion. 13/11/2014

Aceptado para publicacion: 12/10/2015

Disponible en: http://www.javeriana.edu.co/universitasodontologica

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CORRESPONDENCIA

Edison Andres Cruz Olivo

andrescruz.perio@gmail.com

Shirley Gonzalez Morales

shirliodon02@hotmail.com

Carolina Moncada Quilindo

carito17377@hotmail.com

Sandra Arce

sarce@uao.edu.co

Carlos Humberto Valencia

Edison Andres Cruz Olivo Odontologo, especialista en Periodoncia, Universidad del Valle, Cali, Colombia. Estudiante de Maestria en Odontologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil.

Shirley Gonzalez Morales Odontologa, especialista en Periodoncia, Universidad del Valle, Cali, Colombia. Practica privada.

Carolina Moncada Quilindo Odontologa, especialista en Periodoncia, Universidad del Valle, Cali, Colombia. Practica privada.

Sandra Arce Ingeniera mecanica, magistra en Ciencias, docente de la Facultad de Ingenieria, Universidad Autonoma de Occidente, Cali, Colombia.

Carlos Humberto Valencia Odontologo, especialista en Implantologia, Fundacion Universitaria CIEO (UniCIEO), Bogota, Colombia. Candidato a doctor en Ciencias Biomedicas, Universidad del Valle, Cali, Colombia.
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Title Annotation:CIENCIA BASICAS, BIOTECNOLOGIA Y BIOINFORMATICA
Author:Cruz Olivo, Edison Andres; Gonzalez Morales, Shirley; Moncada Quilindo, Carolina; Arce, Sandra; Humb
Publication:Universitas Odontologica
Date:Jul 1, 2015
Words:4388
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