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Behavior of Sexed Frozen-Thawed Bovine Semen on in vitro Fertilization (IVF) Capacitated with two Concentrations of BO versus Percoll/ Comportamiento del Semen Bovino Sexado Congelado-Descongelado en Fertilizacion in vitro (FIV) Capacitado Mediante BO en dos Concentraciones versus Percoll.

INTRODUCCION

En vaquillonas lecheras el rango de prenez por inseminacion artificial (IA) es del 67 % aproximadamente, siendo la relacion entre los sexos machos y hembras 50/50. Es de gran importancia lograr predeterminar el sexo de las crias ya que en la cria para leche son de valor las hembras y muy poco valor los machos. Se hicieron muchos intentos en este sentido que no fueron aplicables. La obtencion de mayor numero de terneras en proporcion significativa respecto a los machos se hizo posible a partir de la creacion del citometro de flujo con capacidad de seleccionar los espermatozoides X e Y por la diferencia del ADN (aproximadamente 4 % en bovinos), con una confiabilidad del 90 % (Xu et al., 2009). Es el unico metodo validado para la seleccion del sexo precoz actualmente (de Graaf et al., 2009).

Esta tecnologia solo se ha desarrollado en el uso comercial en la especie bovina. El uso de semen sexado aumenta la eficiencia reproductiva, permite la seleccion de hembras superiores para reposicion, posibilitando un incremento de la ganancia genetica (Weigel, 2004; Moce et al., 2006; Rath & Johnson, 2008).

El citometro de flujo clasifica los espermatozoides, los cuales son cargados por medio de vibracion de alta frecuencia en gotas individuales (Schenk et al., 1999). Estos espermatozoides tenidos previamente con bisbenzimidazol (Hoechst 33342) el cual se fija de manera selectiva al ADN (Schenk et al.), generan fluorescencia cuando son sometidos a luz laser y a traves de sensores es posible distinguir un indice de reflexion superior del espermatozoide X respecto al espermatozoide Y (Seidel, 2007).

Las gotas son cargadas positiva o negativamente y son desviadas por una placa con la carga opuesta de manera que el esperma es dirigido a un vaso colector para cada una, de forma que los espermatozoides X van a un vaso colector y los espermatozoides Y a otro y el desecho a otro (espermatozoides muertos y/o no reconocidos).

Se pueden producir unas 6 a 8 dosis inseminantes, de aproximadamente 2.000.000 de espermatozoides, por hora, con una eficacia promedio del 90 % del sexo deseado (Ferre & Cattaneo, 2013).

La baja concentracion de espermatozoides en cada dosis de SX (1,5-2 millones/pajuela de 0,25 ml) podria ser un factor de la menor tasa de concepcion con respecto al uso de NS (Xu et al.) en IA. Para optimizar los resultados, las pajuelas sexadas deberian usarse en vaquillonas que no formen parte de un programa de inseminacion a tiempo fijo o en programas de transferencia de embriones (Xu et al.). En IA cuando la dosis de SX es equivalente a la utilizada con semen convencional el rango de prenez para el SX se mantiene en el orden del 60-80 % de prenez respecto al convencional (Wheeler et al., 2006).

Los primeros terneros nacidos por FIV con SX, nacieron en 1993 (Cran et al, 1993).

A traves de la FIV es posible incrementar la eficiencia del SX ya que mientras con una dosis en IA se fertiliza como mucho a una hembra bovina, en FIV es posible fertilizar gran numero de ovocitos.

Su aplicacion a la produccion en combinacion con la aspiracion folicular in vivo guiada por ultrasonografia (OPU), permitiria obtener mayor cantidad de embriones de alta genetica y sexados a menor costo.

Por otro lado, la FIV constituye un modelo experimental para estudiar la fertilidad del SX comercial (Larocca & Filipiak, 2017).

La capacitacion de los espermatozoides en la FIV es substancial para la obtencion de buenos indices de produccion de embriones. Se han desarrollado diferentes medios de cultivo, de los cuales la centrifugacion en gradientes de densidad de Percoll tiene la capacidad de seleccionar los espermatozoides vivos de los muertos, a diferencia de otros medios como el BO (Brackett & Oliphant, 1975), que los capacita sin seleccionarlos. El medio BO permite la capacitacion de los espermatozoides por su contenido de cafeina y heparina y es de bajo costo.

Los gradientes de densidad requieren de una solucion (Percoll) diluida en medio de capacitacion, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior, en la cual el semen es suspendido y al centrifugar, los espermatozoides moviles y con acrosoma intacto migran a traves de los gradientes. El Percoll es un medio muy costoso y a veces dificil de obtener, solo permitido su uso veterinario (Palma et al., 2008). La centrifugacion en gradiente de Percoll permite que los espermatozoides se desplacen por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son identicas, por lo cual tambien se le llama centrifugacion isopinica. En este punto no se producira una sedimentacion posterior debido a que flotan sobre un "colchon" de material que posee una densidad superior a la suya propia. Como los espermatozoides intactos son de mayor densidad y por lo tanto no son retenidos en los estratos de mejor densidad, estos migran hacia el fondo del tubo, teniendo la ventaja de poder separarlos aun partiendo de muy baja concentracion (Palma et al.).

Es de interes evaluar el efecto de diferentes concentraciones de espermatozoides de SX, para definir si la dosis comercial es suficiente para una buena tasa de clivaje y desarrollo en FIV.

Los objetivos de esta investigacion fueron: Comparar la fertilidad del SX en FIV capacitado con Percoll vs. BO, medido por la TD y el DE y comparar la fertilidad in vitro de una dosis de 5 x [10.sup.6] espermatozoides sexados/ml vs. 10 x [10.sup.6] espermatozoides sexados, capacitados con BO en FIV, medido por la TD y el DE.

MATERIAL Y METODO

Los COC se obtuvieron de ovarios de hembras bovinas faenadas en mataderos. Fueron transportados en menos de 5 horas en solucion salina isotonica a 37[degrees]C. El contenido de los foliculos de 2 a 8 mm de diametro fue aspirado mediante jeringa con aguja hipodermica 18G, utilizando medio buffer fosfato salino modificado (m-PBS), con 5 % de suero fetal bovino (SFB) y antibioticos (PenicilinaEstreptomicina). Se utilizaron los COC, clases A y B (normas de la IETS); se lavaron en m-PBS en cajas de Petri de 35 mm de diametro y se cultivaron para su maduracion en TCM-199 + 5 % de SFB + 0.005 U/ml de (FSH-p) + 10 IU hCG/ml + 1 [micro]g Estradiol (E2)/ml, en gotas de 100 ml conteniendo 15 COC por gota, cubiertas con aceite mineral, en incubadora (38,5[degrees]C, 5 % de C[O.sub.2] y 95 % de humedad) por 22 horas.

Para la fecundacion in vitro se formaron 4 grupos al azar con similar numero de COC, se realizaron simultaneamente y en las mismas condiciones dos experimentos: Experimento I: El G1 se fecundo con NS a una concentracion de 5 x [10.sup.6] espermatozoides/ml (spz/ml), evaluando tambien el comportamiento in vitro del SX a una concentracion de 5 x [10.sup.6] spz/ml (G2) y al doble de concentracion (G3) midiendo la TD a las 48 horas de la FIV y el DE en el dia 7. Experimento II: Se evaluo el comportamiento del SX capacitado con BO (G2) respecto al capacitado con gradientes de Percoll (G4), en ambos diluyendo el semen a 5 x [10.sup.6] spz /ml. El G2 esta incluido en ambos experimentos ya que al ser SX capacitado con BO, es capaz de enfrentarse tanto al G1 y G3 (Experimento I), pudiendo comparar con el G1 siendo el mismo metodo de capacitacion, pero difiere en que es SX, mientras que el G1 es convencional. Tambien se lo enfrenta con el G3 comparando la diferencia entre las concentraciones espermaticas, siendo el doble en el G3. Para el Experimento II se utiliza el mismo grupo con el fin de comparar los resultados con ambos metodos de capacitacion espermatica (BO vs. Percoll). En todas las replicas se uso semen comercial (Nueva Zelanda), congelado-descongelado, del mismo toro y la misma partida.

Las pajuelas de semen (0,25 ml) fueron descongeladas 10 segundos a temperatura ambiente y 30 segundos a 36 [degrees]C en bano Maria. En cada replica se calculo la concentracion inicial mediante camara de Neubauer. Se estudio la motilidad individual y el vigor al descongelado y a las 2 horas. La capacitacion del semen para los grupos G1, G2 y G3 se realizo por centrifugacion (500 G), en medio BO de lavado se aspiro el sobrenadante, el pellet que quedo en el fondo del tubo se diluyo con solucion BO de dilucion ajustando a una concentracion de 5 x [10.sup.6] spz/ml para los grupos G1 y G2 y de 10 x [10.sup.6] spz/ml para el G3, despues de estudiar la concentracion total, utilizando la camara de Neubauer. Para el G4 la capacitacion se realizo mediante gradientes de Percoll diluidos en Talp-Sperm (90-45 %). Se centrifugo a 2500 G, por 20 minutos, se aspiro el sobrenadante. Al pellet se le agrego medio Talp-Sperm y se volvio a centrifugar 5 minutos a 2500 G, se retiro el sobrenadante y el pellet se ajusto a una concentracion de 5 x [10.sup.6] spz/ml con solucion Talp-Fert. En platina caliente (36[degrees]C) se formaron gotas de 100 ml con el semen, se cubrio con aceite mineral y se colocaron en las gotas los ovocitos madurados, en una relacion de 15 COC por gota. El cocultivo se coloco en estufa a 38,5 [degrees]C, con 5 % de C[O.sub.2] y 95 % de humedad por un lapso de 18 horas.

Luego de la fecundacion, los presuntos cigotos se denudaron mediante vortex en medio TCM-199 HEPES, con 5 % de SFB y antibioticos por 5 minutos, se lavaron y cultivaron para desarrollo en medio CR1aa + 5 % de SFB, en incubadora.

Se estudio la division a las 48 horas (clivaje). A los 7 dias a partir de la fecundacion se evaluo el desarrollo a embriones transferibles. Para el estudio de los resultados se utilizo el Test de [chi square]. Los analisis se realizaron con nivel de significacion del 5 %.

RESULTADOS Y DISCUSION

La concentracion inicial promedio de las pajuelas del SX fue de 2 x [10.sup.6] spz/pajuela de 0,25 ml, con una motilidad individual promedio del 6 5 % y 3,5 de vigor (escala 0 a 5) y tras 2 horas de incubacion a 36[degrees]C tuvo una motilidad individual de 50 % y 3 de vigor. El SN tuvo una concentracion promedio de 14,6 x [10.sup.6] esp/pajuela de 0,25 ml y un promedio de motilidad individual 70 % y 4 de vigor. Tras 2 horas de incubacion la motilidad individual promedio fue de 60 % y 3,5 de vigor.

Los resultados obtenidos en la FIV se muestran en las Tablas I (Experimento I) y II (Experimento II). En el Experimento I, en el clivaje el G1 y el G3 no tuvieron diferencias significativas (p<0,05) entre si, en tanto que ambos grupos fue significativamente mayor respecto al G2. En el DE (desarrollo/clivaje) no hubo diferencias significativas entre los tres grupos. Si bien el grupo inseminado con la mayor concentracion mostro un mejor clivaje, en el desarrollo obtuvo resultados similares al de menor concentracion. En el Experimento II, no hubo diferencias significativas en el clivaje (p>0,05) entre los grupos G2 y G4. La capacitacion del SX con Gradientes de Percoll (G4) arrojo resultados significativamente superiores (p<0,05) a la capacitacion con BO (G2) en el DE.

Nuestros estudios realizados anos anteriores (2014) arrojaron mejores resultados en clivaje y DE (Larocca & Filipiak), el ano 2016, en el que se realizaron estos ensayos, en Uruguay fue un ano con serios problemas climaticos, abundantes y prolongadas lluvias y como consecuencia falta de alimento para el ganado y deficiente estado corporal, lo cual podria estar vinculado. En estudios anteriores capacitando el NS con BO obtuvimos mayor DE en primaveraverano que en otono invierno (Filipiak & Larocca, 2012; Filipiak & Larocca, 2016).

Los estudios de Xu et al. obtuvieron un clivaje de 61,7 [+ or -] 0 % y un 20,2 [+ or -] 2,5 % de desarrollo con SX en FIV, en nuestra investigacion se obtuvieron mayores resultados en DE al utilizar SX.

Se ha sostenido la necesidad de estudios que evaluen el comportamiento in vitro de SX y NS, del mismo toro y en lo posible del mismo eyaculado a la descongelacion (Wilson et al., 2006), ya que al estudiar el SX y NS de diferentes toros en FIV no obtuvieron diferencias en la tasa de clivaje, sin embargo, obtuvieron diferencias significativas en la produccion de embriones a favor del NS. Resultados similares obtuvieron Trigal et al. (2012) al obtener mayor clivaje y mayor desarrollo de embriones (diferencias significativas), en el NS, respecto al SX. En nuestro trabajo se estudio el comportamiento in vitro del SX y NS del mismo toro y partida, comparando a su vez distintos metodos de capacitacion.

Machado et al. (2009) capacitando el SX con gradientes de Percoll obtuvieron con 4 toros diferentes un rango de clivaje de 65 a 85 % y de DE de 17 a 47 %, nosotros si bien obtuvimos al usar el Percoll un menor clivaje, el DE fue mayor.

Katska-Ksiaz kiewicz et al. (2006), utilizando SX, semen sexado Y (SY) y NS (congelado-decongelado), reportan diferencias significativas en la tasa de clivaje del NS respecto al semen sexado (X e Y), sin embargo, el DE a blastocistos fue similar para el NS y el SX. Puglisi et al. (2006), estudiando el comportamiento en la FIV de SX y NS provenientes de diferentes toros, reportan una menor tasa de clivaje para el SX, no encontrando diferencias significativas en el DE. Coincidente a los resultados de KatskaKsiazkiewicz et al. y de Puglisi et al., el DE fue similar entre el SX y el NS, salvo al capacitar nosotros el semen con Percoll aumento significativamente la produccion de embriones con SX. Promthep et. al. (2016), utiliza distintos gradientes de Percoll (7 gradientes) con SX y obtiene los mejores resultados en el estudio del semen y en la FIV utilizando el semen obtenido del gradiente con 65 y 70 % de concentracion de Percoll. Ellos obtuvieron un 88 % de clivaje y un 34 % de desarrollo, si bien obtuvieron un clivaje mayor, el resultado en embriones es similar a este estudio. La mayoria de los laboratorios de FIV en bovinos, emplean para la capacitacion de semen el metodo de los gradientes de Percoll con semen no sexado y/o sexado.

Un reciente estudio compara tres concentraciones diferentes en FIV, 0,1 x [10.sup.6], 1 x [10.sup.6] y 10 x [10.sup.6] spz/ml y obtiene menor clivaje y DE en el grupo de mayor concentracion de semen. En ese mismo estudio compara tambien dos metodos de capacitacion de semen, el metodo del Percoll vs. centrifugacion simple en Talp-Sperm (sin seleccionar vivos de muertos) y obtuvieron un mayor clivaje y DE con el metodo del Percoll que selecciona vivos de muertos. Ademas, encontraron que se producen anomalias cromosomicas cuando el semen esta mas concentrado, asi como cuando no se separa a los espermatozoides muertos (Demyda-Peyras et al., 2015).

La FIV puede ser una herramienta para producir embriones de sexo deseado en la produccion bovina, aumentando los remplazos y disminuyendo el costo relativo del SX al obtenerse mayor cantidad de embriones. La capacitacion del SX mediante gradientes de Percoll resulta ser mas eficiente en la produccion de embriones que el medio BO, sin embargo, su costo es mayor. Aumentar la concentracion del semen capacitado con BO no parece ser necesario para obtener mejores resultados en la FIV.

AGRADECIMIENTOS . A Luis Roses, Dra. Ana Aznares y Dra. Elizabeth Pechiar.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Brackett, B. G. & Oliphant, G. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro. Biol. Reprod., 12(2):260-74, 1975.

Cran, D. G.; Johnson, L. A.; Miller, N. G.; Cochrane, D. & Polge, C. Production of bovine calves following separation of X- and Y-chromosome bearing sperm and in vitro fertilisation. Vet. Rec., 132(2):40-1, 1993.

de Graaf, S. P.; Beilby, K. H.; Underwood, S. L.; Evans, G. & Maxwell, W. M. Sperm sexing in sheep and cattle: the exception and the rule. Theriogenology, 71(1):89-97, 2009.

Demyda-Peyras, S.; Dorado, J.; Hidalgo, M. & Moreno-Millan, M. Influence of sperm fertilising concentration, sperm selection method and sperm capacitation procedure on the incidence of numerical chromosomal abnormalities in IVF early bovine embryos. Reprod. Fertil. Develop., (27):351-9, 2015.

Ferre, L. & Cattaneo, L. Biotecnologias reproductivas: produccion in vitro de embriones y semen sexado. (?La pareja perfecta?). Rev. Med. Vet. (B. Aires), 94(2):28-36, 2013.

Filipiak, Y. & Larocca, C.E. Efecto de las Estaciones del Ano en los Resultados de la Fertilizacion In vitro en Bovinos (Bos Taurus) en Zonas Templadas. Casilda, XVII Jornadas de Divulgacion Tecnico-Cientificas 2016, Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de Rosario, 2016.

Filipiak, Y. & Larocca, C.E. Use of trypan blue to determine viability of bovine oocytes for in vitro fertilization. Arch. Zootec., 61(234):309-12, 2012.

Katska-Ksiazkiewicz, L.; Rynska, B.; Bochenek, M.; Opiela, J. & Jurkiewicz, J. In vitro production of bovine embryos using flow-cytometrically sexed sperm. Arch. Tierz. Dummerstorf., 49(2):133-40, 2006.

Larocca, C. & Filipiak, Y. In vitro embryo production with frozen-thawed bovine semen sexed. Int. J. Morphol., 35(1):371-5, 2017.

Machado, G. M.; Carvalho, J. O., Filho, E. S.; Caixeta, E. S.; Franco, M. M.; Rumpf, R. & Dode, M. A. Effect of Percoll volume, duration and force of centrifugation, on in vitro production and sex ratio of bovine embryos. Theriogenology, 71(8):1289-97, 2009.

Moce, E.; Graham, J. K. & Schenk, J. L. Effect of sex-sorting on the ability of fresh and cryopreserved bull sperm to undergo an acrosome reaction. Theriogenology 66(4):929-36, 2006.

Palma, G. A.; Olivier, N. S., Neumuller, Ch. & Sinowatz, F. Effects of sex-sorted spermatozoa on the efficiency of in vitro fertilization and ultrastructure of in vitro produced bovine blastocysts. Anat. Histol. Embryol., 37(1):67-73, 2008.

Promthep, K.; Satitmanwiwat, S.; Kitiyanant, N.; Tantiwattanakul, P.; Jirajaroenrat, K.; Sitthigripong, R. & Singhapol, C. Practical use of percoll density gradient centrifugation on sperm sex determination in commercial dairy farm in Thailand. Indian J. Anim. Res., 50(3):310-3, 2016.

Puglisi, R.; Vanni, R.; Galli, A.; Balduzzi, D.; Parati, K.; Bognioni, G.; Crotti, G.; Duchi, R.; Galli, C.; Lazzari, G. & Aleandri, R. In vitro fertilisation with frozen-thawed bovine sperm sexed by flow cytometry and validated for accuracy by real-time PCR. Reproduction, 132(3):519-26, 2006.

Rath, D. & Johnson, L. A. Application and commercialization of flow cytometrically sex-sorted semen. Reprod. Domest. Anim, 43Suppl. 2:338-46, 2008.

Schenk, J. L.; Suh, T. K.; Cran, D. G. & Seidel, G. E. Jr. Cryopreservation of flow-sorted bovine spermatozoa. Theriogenology, 52(8):1375-91, 1999.

Seidel, G. E. Jr. Overview of sexing sperm. Theriogenology, 68(3):443-6, 2007.

Trigal, B.; Gomez, E.; Caamano, J. N.; Munoz, M.; Moreno, J.; Carrocera, S.; Martin, D. & Diez, C. In vitro and in vivo quality of bovine embryos in vitro produced with sex-sorted sperm. Theriogenology, 78(7):1465-75, 2012.

Weigel, K. A. Exploring the role of sexed semen in dairy production systems. J. Dairy Sci., 87Suppl.:E120-30, 2004.

Wheeler, M. B.; Rutledge, J. J.; Fischer-Brown, A.; VanEtten, T.; Malusky, S. & Beebe, D. J. Application of sexed semen technology to in vitro embryo production in cattle. Theriogenology, 65(1):219-27, 2006.

Wilson, R. D.; Fricke, P. M.; Leibfried-Rutledge, M. L.; Rutledge, J. J.; Penfield, C. M. & Weigel, K. A. In vitro production of bovine embryos using sex-sorted sperm. Theriogenology, 65(6):1007-15, 2006.

Xu, J.; Chaubal, S. A. & Du, F. Optimizing IVF with sexed sperm in cattle. Theriogenology, 71(1):39-47, 2009.

Direccion para Correspondencia

Dra. Yael Filipiak

Facultad de Veterinaria

Area Biotecnologia de la Reproduccion

Departamento de Reproduccion Animal

Universidad de la Republica

Montevideo

URUGUAY

E-mail: yael.filipiak@fvet.edu.uy

Recibido: 22-06-2017

Aceptado: 21-09-2017

Filipiak, Y.; Larocca, C. & Martinez, M.

(1) Facultad de Veterinaria. Area Biotecnologia de la Reproduccion, Departamento de Reproduccion Animal.Universidad de la Republica. Montevideo, Uruguay.
Tabla I. TD y DE entre los grupos capacitados con BO (NS vs. SX).

                                   TD            DE (desarrollo/
Grupo    Numero total de                            divididos)
         COC inseminados       N         %         N         %

G2             225          117 (b)    52,00    48 (a)     41,03
G4             215          109 (b)    50,70    73 (b)     66,97

Distintos superindices difieren significativamente (p<0,05)

Tabla II. TD y DE entre el semen capacitado con Percoll vs. BO.

                                                  DE (desarrollo/
                                     TD             divididos)
Grupo     Numero total de
          COC inseminados       N         %         N        %

G1              242          152 (a)    62,81    50 (a)    32,89
G2              225          117 (b)    52,00    48 (a)    41,03
G3              158          100 (a)    63,29    43 (a)    43,00

Distintos superindices difieren significativamente (p<0,05)
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Author:Filipiak, Y.; Larocca, C.; Martinez, M.
Publication:International Journal of Morphology
Date:Dec 1, 2017
Words:3420
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