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Bases fisiologicas del aprendizaje asociativo en mamiferos (1).

RESUMEN

El condicionamiento clasico del reflejo corneal es un modelo muy utilizado en el estudio de los procesos de aprendizaje y memoria. Nuestro grupo de investigacion ha estudiado las caracteristicas cineticas de las respuestas palpebrales reflejas, voluntarias, emocionales y aprendidas, asi como la fisiologia de las motoneuronas que inervan el musculo orbicularis oculi, encargado de realizar dichos movimientos. Las motoneuronas faciales codifican la velocidad de cierre de los parpados durante respuestas reflejas y su posicion durante respuestas aprendidas. Esta diferencia indica un diferente procesamiento (y/u origen) de ambas ordenes motoras. Tanto la corteza paravermal como el nucleo interposito posterior del cerebelo estan relacionados con los movimientos palpebrales reflejos y aprendidos, contribuyendo a su correcta realizacion, pero no a su aprendizaje. A su vez, el hipocampo interviene en la determinacion del valor predictivo del estimulo condicionado, durante condicionamientos de tipo pavloviano.

Palabras clave: cerebelo, hipocampo, condicionamiento clasico, parpado, mamiferos.

ABSTRACT

Classical conditioning of the corneal reflex is an useful model for the study of learning and memory processes. Our research group has studied the kinematics of reflex, voluntary, emotional and learned eyelid responses, as well as the physiology of facial motoneurons innervating the orbicularis oculi muscle; i.e., the muscle responsible for those eyelid movements. Facial motoneurons encode eyelid velocity during reflex lid responses, but eyelid position during learned lid responses. This functional difference reveals a selective processing (and/or origin) of both motor commands. Both the paravermal cerebelar cortex and the posterior interpositus nucleus are related to reflex and acquired eyelid responses, contributing to its proper performance, but not to its acquisition. At the same time, the hippocampus participates in the determination of the predictive value of the conditioned stimulus, when using classical conditioning procedures.

Key words: cerebellum, hippocampus, classic conditioning, eyelid, mammals.

INTRODUCCION

El presente texto contiene los resultados obtenidos en nuestro laboratorio a lo largo de 20 anos sobre las bases fisiologicas del aprendizaje y la memoria, a los que se ha anadido los ultimos hallazgos experimentales obtenidos por nuestro grupo, sobre todo en relacion con la contribucion del cerebelo y del hipocampo a la adquisicion de nuevas habilidades motoras y cognitivas (Jimenez-Diaz et al., 2004; Leal-Campanario et al., 2005) y al desarrollo de modelos de condicionamiento clasico en ratones silvestres y transgenicos (Gruart et al., 2005). Hemos tratado de hacer aqui una presentacion asequible y atractiva de un tema de investigacion bastante arido a menudo. En su caso, una descripcion mas detallada desde el punto de vista cuantitativo, y contrastada con la bibliografia disponible, se puede encontrar en varios articulos publicados por nuestro grupo de investigacion, a los cuales remitimos al lector interesado (Delgado-Garcia et al., 1990; Delgado-Garcia y Gruart, 2002; Gruart et al., 1994, 1995, 1997, 2000a, 2000b, 2000c, Gruart y Delgado-Garcia, 1994; Magarinos-Ascone et al., 1999, Munera et al., 2001, Trigo et al., 1999a, 1999b). Existen tambien numerosas revisiones globales sobre el mismo tema realizadas por otros autores (Evinger et al., 1991; Gormezano et al., 1962, 1983; Thompson, 2005; Thompson y Krupa, 1994; Woody, 1986).

En primer lugar, nos ocuparemos de la descripcion del sistema motor del parpado como un modelo experimental usado con frecuencia en el estudio de los mecanismos neuronales que subyacen al aprendizaje motor y cognitivo en los mamiferos. De hecho, el condicionamiento clasico de la respuesta palpebral (o de la membrana nictitante, en aquellas especies en que esto es posible desde el punto de vista tecnico) se viene utilizando desde hace mas de 50 anos como ejemplo de generacion de nuevas habilidades motoras mediante aprendizajes de tipo asociativo (Gormezano et al., 1962, 1983; Thompson, 2005; Thompson y Krupa, 1994). Seguidamente, se presentara la metodologia que se sigue en este tipo de estudios, una descripcion de la mecanica palpebral y de la fisiologia de las motoneuronas que inervan el musculo orbicularis oculi y, finalmente, la contribucion del cerebelo y del hipocampo a este tipo de aprendizaje motor. En tiempos recientes, ha crecido el apoyo a argumentos que consideran los procesos de aprendizaje motor desde el exclusivo punto de vista de la plasticidad neuronal, con especial referencia a los "sitios" (lugares del sistema nervioso central) donde aquellos tienen lugar (Thompson y Krupa, 1994), asi como de sus substratos moleculares (Bliss y Collindrige, 1993; Brachay Bloedel, 1996; Edwards, 1995; Hawkins et al., 1983; Inda et al., 2005; Ito, 1989; Malenka, 1995). Por el contrario, se ha prestado una menor atencion a los aspectos funcionales que tienen lugar in vivo, durante el momento mismo del aprendizaje (Delgado-Garcia y Gruart, 2002). Ademas, hemos podido mostrar en un trabajo reciente que conviene separar de forma experimental aquellos fenomenos que corresponden al proceso de aprendizaje per se y aquellos otros que corresponden a la expresion motora o verbal de lo aprendido, evitando asi errores importantes en la ubicacion de las estructuras cerebrales que elaboran las respuestas aprendidas (Jimenez-Diaz et al., 2004). A estos aspectos funcionales se dedicara una atencion especial en esta breve revision sobre el condicionamiento clasico de la respuesta palpebral en mamiferos.

EL SISTEMA MOTOR PALPEBRAL COMO MODELO PARA EL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS NEURONALES QUE SUBYACEN AL APRENDIZAJE MOTOR Y COGNITIVO

En la Figura 1 se ilustra el modelo experimental utilizado en este tipo de estudios. Al animal se le implantan de forma cronica (hasta 3-4 meses) electrodos bipolares para el registro de la actividad electromiografica del musculo orbicularis oculi (orbicular de los parpados) y una pequena bobina metalica en el parpado superior, para el registro de la posicion palpebral por el metodo del seguidor magnetico de la posicion. El seguidor magnetico de la posicion es un instrumento que genera un campo magnetico, de frecuencia y energia controladas, en dos planos del espacio: horizontal y vertical. Este instrumento es inocuo para el animal experimental y, de hecho, el seguidor magnetico de la posicion se utiliza en la clinica humana para estudios de la motorica ocular y palpebral. El animal experimental se coloca en el centro del campo magnetico de modo que, cuando el parpado se mueve, la bobina implantada en el mismo se mueve tambien e induce un voltaje proporcional al angulo y plano de desplazamiento (Becker y Fuchs, 1988; Gruart et al., 1995).

[FIGURA 1 OMITIR]

El animal experimental se prepara tambien para el registro de la actividad electrica unitaria neuronal en estructuras seleccionadas, como el nucleo motor facial (a, en Figura 1A), el nucleo interposito del cerebelo (b, en Figura 1A), o las celulas piramidales del hipocampo (c, en Figura 1A). El registro se realiza con pipetas de vidrio de alta resistencia (3-5 Mohmios). Los registros de potenciales extracelulares de campo se suelen llevar a cabo con electrodos metalicos (acero inoxidable o tungsteno) de pequeno diametro (50 [micro] m), implantados de forma cronica, sobre todo si los experimentos se realizan en mamiferos de pequeno tamano (rara, raton). Las neuronas registradas se identifican in vivo mediante su activacion antidromica desde sus sitios de proyeccion. Por ejemplo, las motoneuronas faciales se activan antidromicamente desde el nervio facial, las neuronas del nucleo interposito del cerebelo desde el nucleo rojo y las celulas piramidales de CA3 del hipocampo desde el fornix (Gruart et al., 2000a; Munera et al., 2001; Trigo et al., 1999a).

Como prueba de aprendizaje asociativo se suele utilizar el condicionamiento clasico del reflejo corneal, con paradigmas tanto de traza como de demora (Figura 2). En el paradigma de traza se presenta un breve (20 ms) soplo de aire en la cornea izquierda (1 Kg/[cm.sup.2]) o un tono (600-2400 Hercios, 90 dB) como estimulo condicionado. Unos 250-500 ms despues de terminado el estimulo condicionado se presenta un intenso (100 ms, 3 Kg/[cm.sup.2]) soplo de aire en la misma cornea, como estimulo incondicionado. Por el contrario, en el paradigma de demora se presenta un sonido (600-2400 Hercios, 90 dB) como estimulo condicionado, el cual se mantiene por unos 350 ms. A los 250 ms de iniciado el sonido se presenta un soplo intenso en la cornea izquierda (100 ms, 3 Kg/ [cm.sup.2]) como estimulo incondicionado, que termina simultaneamente con el estimulo condicionado. La frecuencia del sonido utilizado depende de la especie que se utiliza: a menor tamano mayor frecuencia. Tambien hay que indicar que, en algunos casos, como por ejemplo en especies dificiles de inmovilizar (rara, raton) los soplos de aire se sustituyen por estimulos electricos (pulsos cuadrados bifasicos de 50-500 [micro] s) de intensidad variable (< 1 mA, 1-3 x Umbral). En cada sesion de condicionamiento se presentan las parejas de estimulos condicionado e incondicionado entre 60 y 120 veces, segun la especie animal a condicionar, separadas en bloques de 10 parejas. Se pueden encontrar mas detalles de este modelo experimental en trabajos mas especializados de nuestro grupo (Gruart et al., 1995; 2000c).

CARACTERISTICAS CINETICAS Y FUNCIONALES DEL SISTEMA MOTOR PALPEBRAL

El sistema motor facial es peculiar por diversas razones. Desde el punto de vista evolutivo, este sistema motor es de aparicion tardia, desarrollandose principalmente en felinos y primates. Un dato importante, olvidado con frecuencia, es que el sistema motor facial es un conjunto muscular de origen visceral modificado, lo que explica en cierto modo su facil entrenamiento con el condicionamiento clasico o pavloviano, mas facil de aplicar en el sistema vegetativo autonomo (secrecion salivar, por ejemplo) que en el sistema motor estriado (contraccion de una extremidad). En el hombre, la musculatura facial esta compuesta por mas de 20 musculos diferentes. Una caracteristica comun a casi todos los musculos faciales es su pequena masa, por lo que se afectan escasamente por la fuerza de la gravedad. Los musculos faciales, y entre ellos los que mueven el parpado, se denominan de carga constante, porque no estan sometidos a cambios en el peso que deben movilizar cuando se contraen; en esto se diferencian de la musculatura espinal y de las extremidades, que son de carga variable; es decir, que estan preparados para soportar pesos diferentes sin que ello impida su funcionamiento.

Gran parte de la musculatura facial (incluyendo la de los parpados) presenta una disposicion plana, en mapa, ya que cada unidad motora ocupa un lugar preciso y exclusivo dentro del musculo. Esta disposicion tiene una gran importancia funcional, pues cada motoneurona facial puede realizar una contribucion especifica y unica a la mimica de la cara. De hecho, las motoneuronas faciales estan distribuidas en subnucleos dentro del nucleo o complejo motor facial. Incluso, las motoneuronas faciales mantienen un alto grado de somatotopia dentro de cada subnucleo (Morcuende et al., 2003; Trigo et al., 1999a). En este sentido, se sabe que a cada subnucleo llegan aferencias especificas para cada pequena agrupacion de motoneuronas. Por ejemplo, las motoneuronas que inervan la porcion palpebral (tarsal) del musculo orbicularis oculi se localizan en la region mas dorsal del nucleo intermedio facial y se activan principalmente durante respuestas reflejas originadas por estimulos mecanicos de la cornea y de la piel de los parpados. Por el contrario, las motoneuronas que inervan la porcion orbitaria (septal) del musculo orbicularis oculi se activan preferentemente durante expresiones faciales de relacionadas con el estado emocional interno del sujeto, por lo que sus aferencias son preferentemente de origen limbico (Gordon, 1951; Trigo et al., 1999a). Basicamente, el musculo orbicularis oculi descansa sobre los bordes del hueso de la orbita, llamada area orbicular y sobre una parte movil, denominada area palpebral, que forma el parpado propiamente dicho. En la zona palpebral se distingue una division pretarsal, cercana a los bordes de los parpados superior e inferior, y circundando a esta, una parte preseptal, que se continua con la parte orbital (Lander et al., 1996). Las fibras que forman el borde de los parpados (pretarsales) son pequenas y mayoritariamente fasicas, participando en contracciones rapidas del parpado. En las partes mas alejadas de la porcion pretarsal se encuentran las fibras tipo 1 (tonicas), mas gruesas y lentas, y que alcanzan una proporcion de 120%. Este gradiente en tamano y composicion se conserva constante en las diferentes especies estudiadas (cortejos, monos, seres humanos, etc.) (McLoon y Wirtschafter, 1991).

Con alguna excepcion, los musculos faciales y, en concreto, los del parpado, carecen de propioceptores tipicos. Desde el punto de vista funcional, esto se traduce en que no hay reflejo miotatico directo, o de estiramiento, en la musculatura palpebral (ver referencias en Trigo et al., 1999b). Esta es probablemente la causa de que las motoneuronas que inervan el musculo orbicularis oculi carezcan de informacion relativa a la posicion que ocupa el parpado sobre el globo ocular. La posicion palpebral durante la vigilia la determina el musculo elevador de los parpados, ya que las motoneuronas que inervan este musculo tienen informacion de la posicion del ojo en la orbita (mirada hacia arriba o abajo) como el resto de la musculatura extraocular que mueve el ojo en el plano vertical (Becker y Fuchs, 1998; Delgado-Garcia, 2000). Durante los movimientos palpebrales rapidos que acompanan a las sacadas oculares, el musculo orbicularis oculi esta completamente relajado. Este musculo se activa exclusivamente cuando los parpados se cierran de forma refleja (por estimulos de la piel, sonoros o visuales) y durante movimientos voluntarios, aprendidos, o de origen emocional. Llama la atencion que la respuesta palpebral condicionada (aprendida mediante condicionamiento clasico) se parece mas en su cinetica a la respuesta palpebral de tipo emocional que a la respuesta de tipo reflejo o al movimiento palpebral voluntario (Gruart et al., 1995). Esto sugiere que los mecanismos neuronales que producen las respuestas palpebrales aprendidas pueden compartir determinados circuitos efectores con los que generan las respuestas palpebrales de origen emocional.

Los parpados se pueden cerrar de forma pasiva cuando se relaja el musculo elevador que los mantiene abiertos, incluso si nos colocamos cabeza abajo. Por tanto, el cierre pasivo de los parpados (por ejemplo, al dormir) no ocurre por accion de la gravedad, sino por la liberacion de las tensiones acumuladas en los tendones y aponeurosis palpebrales, tras la relajacion del musculo elevador de los parpados (Evinger et al., 1991; Trigo et al., 2003). Hay que tener en cuenta que el cierre activo de los parpados en los primates es el resultado exclusivo de la contraccion del musculo orbicularis oculi, mientras su apertura depende de la accion del musculo elevador. Pero, en animales con membrana nictitante (la mayoria de vertebrados terrestres) existe un musculo que se inserta en el polo posterior del globo ocular, el musculo retractor bulbi, que retrae el ojo hacia el rondo de la orbita, para permitir el deslizamiento de dicha membrana por la superficie corneal. Esta retraccion del globo ocular contribuye tambien al cierre de los parpados (Evinger et al., 1991; Gruart et al., 1995). El musculo retractor bulbi esta formado por fibras grandes y de contraccion rapida; cada unidad motora cuenta con unas 70 fibras y no tiene inervacion multiple (Lennerstand, 1975). Debido a estas caracteristicas, el musculo retractor bulbi participa en movimientos rapidos como el parpadeo reflejo; asi, su funcion basica es la de proteccion del ojo. Por el contrario, el musculo orbicularis oculi participa tambien en la expresion de las emociones (Bach-y-Rita, 1971) y en la generacion de respuestas aprendidas (Trigo et al., 1999). Por ultimo, algunas especies como el cortejo y el gato son capaces de co-contraer los cuatro musculos rectos que se insertan en el globo ocular, sobre todo en respuesta a estimulos corneales muy intensos, lo que hace que el ojo se retraiga hacia el fondo de la orbita, contribuyendo al cierre de los parpados (Gruart et al., 2000c).

Por lo tanto, un movimiento tan simple en apariencia con el de cerrar los parpados es el resultado motor de la accion de muy diversos musculos, gobernados a su vez por diferentes centros motores troncoencefalicos. Asimismo, con los parpados se pueden realizar movimientos palpebrales muy diferentes (pasivos, reflejos, automaticos, voluntarios, aprendidos y de origen emocional), todos ellos de una extraordinaria velocidad, precision y expresividad.

FISIOLOGIA DE LAS MOTONEURONAS FACIALES QUE INERVAN EL MUSCULO ORBICULARIS OCULI

Hemos registrado la actividad de las motoneuronas faciales (Figura 3A) que inervan al musculo orbicularis oculi en el gato despierto y alerta durante la realizacion de respuestas palpebrales reflejas y condicionadas (Trigo et al., 1999a), asi como la de las motoneuronas que inervan el musculo retractor bulbi, localizadas en el nucleo accesorio del motor ocular externo. La identificacion de las motoneuronas faciales se lleva a cabo mediante la activacion antidromica de las neuronas registradas al aplicar pulsos de corriente en los electrodos implantados en la rama palpebral del nervio facial, o VII par craneal (Figura 3A). Las motoneuronas de los musculos orbicularis oculi y retractor bulbi generan dos brotes de potenciales de accion (a los 4-6 y 10-16 ms) en respuesta a la presentacion de un soplo de aire intenso a la cornea homolateral (Figura 3B). En el gato, las motoneuronas faciales, pero no las del orbicularis oculi, responden a la presentacion de tonos o de flases de luz. Mediante analisis lineales de la regresion se ha comprobado que las motoneuronas faciales codifican la velocidad con que el parpado se cierra durante el reflejo corneal, pero no la posicion del parpado sobre el globo ocular (Trigo et al., 1999a). De hecho, y como ya se ha indicado mas arriba, la posicion del parpado sobre el ojo se determina por la actividad de las motoneuronas que inervan el musculo elevador de los parpados (Becker y Fuchs, 1988).

[FIGURA 2-3 OMITIR]

Las motoneuronas faciales funcionan de un modo muy distinto al descrito durante la realizacion de respuestas palpebrales aprendidas (Figura 3C). En el gato, las motoneuronas que inervan el musculo retractor bulbi no se activan durante las respuestas palpebrales condicionadas (Trigo et al., 1999a), aunque se asume que si lo hacen en el conejo. Esto puede deberse a que la respuesta aprendida tiene una velocidad pico que no llega al 10% de la que se alcanza durante las respuestas palpebrales reflejas, lo que sugiere que la serial de activacion que llega a las motoneuronas del musculo retractor bulbi durante el condicionamiento no es suficientemente intensa para despolarizarlas. Por el contrario, las motoneuronas faciales que inervan el musculo orbicularis oculi si se despolarizan lo suficiente para producir potenciales de accion ante la presentacion de los estimulos condicionado e incondicionado. De todas formas, la activacion de estas motoneuronas durante el condicionamiento clasico del reflejo corneal es mas debil que la que presentan durante la realizacion de respuestas palpebrales reflejas. Es importante senalar que las motoneuronas faciales no codifican la velocidad del desplazamiento del parpado durante las respuestas condicionadas, sino su posicion. De hecho, en la Figura 3 se puede observar el disparo preferentemente fasico (o en brotes) que tienen estas motoneuronas durante las respuestas palpebrales reflejas (Figura 3B) y preferentemente tonico durante las respuestas palpebrales aprendidas (Figura 3C). Estos datos sugieren que las respuestas reflejas se elaboran en el soma de las motoneuronas, por lo que producen una gran despolarizacion de la misma, mientras que las respuestas aprendidas se elaboran en las dendritas, causando una despolarizacion sostenida, pero menos intensa (Trigo et al., 1999a). Recientemente, se ha descrito que determinados aferentes colinergicos a las motoneuronas faciales pueden intervenir en la generacion del disparo tonico que caracterizalaproduccion de respuestas palpebrales aprendidas (Magarinos-Ascone et al., 1999), de un modo probablemente similar al descrito por nuestro grupo para la generacion de la serial de posicion ocular tras la realizacion de un movimiento sacadico del ojo (ver Navarro-Lopez et al., 2004).

?DONDE Y COMO SE GENERAN LAS RESPUESTAS PALPEBRALES APRENDIDAS?

Como consecuencia de lo expuesto anteriormente, surge la cuestion acerca del origen de las senales neuronales que generan las respuestas motoras condicionadas, o aprendidas. En un trabajo realizado en colaboracion con la Dr. Ugolini del CNRS, Gyf-sur-Yvette, Francia (Morcuende et al., 2002), hemos identificado el complejo sistema pre-motor que proyecta sobre las motoneuronas que inervan el musculo orbicularis oculi. Este estudio se realizo usando el viras atenuado de la rabia como marcador transinaptico retrogrado. Para ello, se inyecto una pequenisima cantidad de este virus en el parpado superior de ratas y, con un anticuerpo especifico, se revelaron las proyecciones desde el musculo facial. El estudio se realizo en distintos periodos tras las inyeccion del virus, para conocer cuales eran las conexiones directas o motoras (es decir de las motoneuronas faciales) y las pre-motoras (es decir, las correspondientes a las neuronas que proyectan sobre las motoneuronas). Asi, se fueron localizando las estructuras cerebrales a las que llega el virus mediante transporte transinaptico retrogrado al cabo de un dia, de dos, de tres, etc. De dicho estudio se concluye que hay numerosos centros troncoencefalicos, cerebelosos, y de la corteza cerebral, relacionados mas o menos directamente con la elaboracion de las diferentes ordenes motoras que determinan la produccion de movimientos palpebrales reflejos, voluntarios, emocionales y aprendidos. A continuacion se presentan los estudios electrofisiologicos realizados en algunas de las estructuras cerebrales identificadas por su caracter pre- o pre-pre-motor; es decir, que proyectan mono, bi- o poli-sinapticamente sobre las motoneuronas del musculo orbicular de los parpados.

Existen dos estructuras que se han propuesto con gran enfasis como el (posible) sitio o sitios donde ocurren los procesos moleculares que subyacen al aprendizaje motor; estas son el hipocampo y el cerebelo (Bracha y Bloedel, 1996; Clack y Squire, 1998; Gruart et al., 2000a, Jimenez-Diaz et al., 2004; Munera et al., 2001; Thompson, 2005; Thompson y Krupa, 1994; Woody, 1986). Concretamente, se ha sugerido que en el hipocampo ocurren procesos funcionales y estructurales relacionados con la potenciacion a largo plazo (o LTP, siglas en ingles de long-term potentiation), mientras que en el cerebelo se tienen lugar mecanismos de inhibicion a largo plazo (o LTD, siglas en ingles para long-term depression). Hasta el momento, la mayoria de estudios realizados sobre ambos fenomenos lo han sido en preparaciones in vitro (Bliss y Collingridge, 1993; Edwards, 1995; Hawkins et al., 1983; Ito, 1989; Malenka, 1995; Woody, 1986). A la vista de esta situacion, nuestro grupo ha prestado un interes especial al estudio de la actividad neuronal que se registra en dichas estructuras en el animal en condiciones fisiologicas y durante el proceso mismo de la adquisicion de las respuestas palpebrales condicionadas.

PARTICIPACION DEL CEREBELO EN EL CONDICIONAMIENTO CLASICO DEL REFLEJO CORNEAL

En un estudio inicial (Gruart y Delgado-Garcia, 1994) describimos que en los nucleos profundos del cerebelo se encuentran neuronas relacionadas de un modo u otro con los movimientos reflejos del parpado, producidos por estimulos trigeminales, acusticos y visuales. Enefecto, el marcaje de los nucleos cerebelosos tras la inyeccion del virus atenuado de la rabia en el parpado superior indica una localizacion difusa de neuronas nucleares relacionadas con la motorica palpebral, principalmente en la region lateral del nucleo interposito posterior y en la cara medial del nucleo dentado (Morcuende et al., 2002). Asipues, existe una zona nuclear del cerebelo donde se concentra un importante cumulo de neuronas relacionadas con los movimientos palpebrales. Esta zona se ubica, tanto en la rara como en el gato, en el polo rostral del nucleo interposito posterior, en inmediata vecindad con el nucleo dentado (Gruart et al., 1994, 2000a; Gruart y Delgado-Garcia, 1994; Morcuende et al., 2002) y se pueden identificar durante el registro electrofisiologico mediante la activacion antidromica desde el nucleo rojo (Figura 4A).

[FIGURA 4 OMITIR]

Las neuronas del polo rostral del interposito posterior presentan una actividad electrica claramente relacionada con respuestas palpebrales reflejas y condicionadas. De acuerdo con los resultados obtenidos en diversos estudios (Delgado-Garcia y Gruart, 2002; Gruart et al., 2000a; Gruart y Delgado-Garcia, 1994; Jimenez-Diaz et al., 2004), dichas neuronas se pueden clasificar en dos tipos (A y B) en funcion de la actividad electrica que presentan durante el movimiento palpebral. Las neuronas tipo Ase activan unos 20 ms despues del inicio del movimiento palpebral (ver Figura 4B) y el perfil de su frecuencia instantanea de disparo semeja a veces el perfil del movimiento palpebral. Sin embargo, no se ha podido demostrar que la frecuencia instantanea de disparo de estas neuronas tipo A este linealmente relacionado con la posicion, velocidad o aceleracion del parpado durante movimientos reflejos, voluntarios o aprendidos. Las neuronas tipo A tienen una frecuencia media de disparo de 10-60 potenciales de accion/s en el gato despierto y alerta. Esta frecuencia se incrementa considerablemente (hasta los 300 potenciales de accion/s) durante los movimientos palpebrales reflejos y aprendidos (Figura 4B). Por otra parte, las neuronas tipo B, que se localizan entremezcladas con las neuronas tipo A en el mismo polo rostral del interposito posterior se inhiben durante el movimiento palpebral, ya sea de origen reflejo o condicionado (ver Figura 4C). Las neuronas tipo B tienen una frecuencia espontanea de disparo de 30-80 potenciales de accion/s, frecuencia que disminuye hasta practicamente desaparecer durante el movimiento palpebral. En este caso tambien, la inhibicion en el disparo neuronal se inicia unos milisegundos despues que el movimiento palpebral.

Los cambios en frecuencia (activacion o inhibicion) que se observan durante el registro electrofisiologico de las neuronas tipo A y B del nucleo interposito posterior del cerebelo no tienen lugar al inicio de las sesiones de condicionamiento, sino que ocurren con una pendiente muy poco pronunciada (del orden de 0,05 potenciales de accion/s/ensayo). Esta pendiente indica que dichas neuronas aumentan (las tipo A) o disminuyen (las tipo B) sus frecuencias medias de disparo de potenciales de accion alrededor de 5 potenciales de accion/s cada 100 ensayos; es decir, cada sesion de entrenamiento. Ademas, es importante resaltar que este incremento en actividad solo es detectable en el intervalo entre la presentacion del estimulo condicionado y el inicio del estimulo incondicionado; es decir, durante la realizacion de la respuesta palpebral aprendida. En cualquier caso, la actividad de estas neuronas esta ligada a la aparicion de la respuesta condicionada y no a la mera presentacion de la pareja de estimulos condicionado e incondicionado. Este ultimo punto indica que el nucleo interposito posterior del cerebelo esta claramente relacionado con la realizacion del movimiento palpebral aprendido, pero no con su iniciacion o genesis, ya que la activacion (tipo A) o inhibicion (tipo B) no precede, sino que sigue al inicio de la respuesta condicionada (Delgado-Garcia y Gruart, 2002; Jimenez-Diaz et al., 2004).

Recientemente, hemos publicado un experimento que pone en evidencia el importante papel del nucleo interposito posterior del cerebelo en la realizacion de la respuesta palpebral aprendida o condicionada (Jimenez-Diaz et al., 2004). El experimento consiste en la micro-estimulacion de la zona habitual de registro, ubicada en el polo rostral del nucleo interposito posterior. Esta micro-estimulacion produce una respuesta palpebral de perfil cinetico similar al de la respuesta condicionada, sobre todo si se acompana de la presentacion de un estimulo condicionado (ver Figura 5 en Jimenez-Diaz et al., 2004). Por el contrario, la microinyeccion de muscimol (un conocido agonista del receptor GABAA) en la misma zona produce una disminucion en la amplitud de la respuesta palpebral condicionada (ver Figura 3 en Jimenez-Diaz et al., 2004). En este ultimo caso, la inhibicion de las neuronas del nucleo interposito por la aplicacion local de muscimol disminuye su efecto facilitador (a traves del nucleo rojo) sobre la activacion de las motoneuronas que inervan el musculo orbicularis oculi. El resultado motor es la elaboracion de una respuesta palpebral aprendida de menor amplitud de lo normal.

[FIGURA 5 OMITIR]

Asi pues, el nucleo interposito posterior del cerebelo contribuye a la despolarizacion de las motoneuronas faciales durante el intervalo de tiempo entre el inicio del estimulo condicionado y del incondicionado, momento en que aparece la respuesta palpebral condicionada. Este efecto se ejerce preferentemente por las neuronas tipo A, las cuales proyectan a la region dorso-medial del nucleo rojo, mientras que las neuronas rubrales proyectan monosinapticamente sobre las motoneuronas del musculo orbicularis oculi (Morcuende et al., 2002). A su vez, es probable que las neuronas tipo B proyecten sobre interneuronas localizadas en las proximidades del nucleo del tercer par craneal y que contribuyan a inhibir (o desfacilitar) la actividad de las motoneuronas del musculo elevador de los parpados, favoreciendo asi el cierre de los mismos durante la respuesta condicionada (Gruart y Delgado-Garcia, 1994). De acuerdo con estos datos experimentales, el cerebelo no parece funcionar como un organo coordinador, integrador y computador del movimiento aprendido (Thompson y Krupa, 1994), sino mas bien como un organo reforzador (Delgado-Garcia y Gruart, 2002; Jimenez-Diaz et al., 2004) de la orden motora procedente de alguna otra estructura cerebral, probablemente de la corteza motora y pre-motora (Aou et al., 1992; Gruart et al., 2000b; Leal-Campanario et al., 2005).

PARTICIPACION DEL HIPOCAMPO EN EL CONDICIONAMIENTO CLASICO DEL REFLEJO CORNEAL

Nuestro grupo de investigacion ha abordado tambien el estudio de la actividad electrica de las neuronas piramidales de las zonas CA3 y CA1 del hipocampo durante la realizacion de respuestas palpebrales reflejas y aprendidas (Munera et al., 2001). Las neuronas registradas se activaron antidromicamente desde el fornix (Figura 5A). Las celulas piramidales registradas en el gato despierto y en condiciones fisiologicas producen un brote de pocos potenciales de accion unos 60-80 ms despues de presentado un estimulo novedoso, como un sonido, o un breve soplo de aire aplicado a la cornea del lado contralateral al de registro (ver Figura 5). Esta respuesta electrica neuronal tiende a desaparecer con la presentacion repetida del mismo estimulo. Sin embargo, cuando un estimulo condicionado (el mismo tono o soplo debil de aire) se empareja repetidamente con un estimulo incondicionado (soplo de aire fuerte, de unos 3 Kg/[cm.sup.2] de presion, aplicado a la cornea), la respuesta neuronal al estimulo condicionado aumenta considerablemente a lo largo de las sesiones de condicionamiento, mientras que la respuesta al estimulo incondicionado disminuye o se mantiene igual (ver Figura 1 en Munera et al., 2001). Este incremento en la frecuencia instantanea de disparo de las celulas piramidales tiene una pendiente que se asemeja (aproximadamente 0,05 potenciales de accion/s/ensayo) a la ya descrita para las neuronas del cerebelo, lo que sugiere que los procesos neuronales relacionados con este aprendizaje asociativo pueden estar ocurriendo a la vez en lugares del cerebro tan diversos como las motoneuronas faciales, el cerebelo y el hipocampo. De acuerdo con la hipotesis que hemos propuesto en una revision reciente (Delgado-Garcia y Gruart, 2002) estos cambios en la actividad neuronal corresponderian a un estado funcional particular que abarcaria numerosas estructuras cerebrales y que seria especifico para este tipo de aprendizaje.

En repetidas ocasiones se ha propuesto que el hipocampo solo estaria relacionado con la adquisicion de condicionamiento clasico utilizando paradigmas de traza, pero no en los de demora, para los que se requeriria el cerebelo (Clark y Squire, 1998; Thompson, 2005; Thompson y Krupa, 1994). Esta afirmacion se podria poner en duda de acuerdo a los resultados experimentales ilustrados en la Figura 5B. Dicha figura muestra que las neuronas piramidales del hipocampo en el gato despierto responden practicamente del mismo modo con los paradigmas de traza y de demora. Se puede afirmar incluso que la respuesta de las celulas piramidales del hipocampo parece independiente de la modalidad sensorial del estimulo condicionado utilizado [soplo de aire debil (B), tono breve (C), o tono prolongado (D), ver Figura 5]. De acuerdo, pues, con estos resultados, el hipocampo parece estar mas relacionado con la relevancia, saliencia o valor predictivo del estimulo condicionado (Munera et al., 2001 ; Rescorla, 1988) que con la determinacion del intervalo de tiempo entre los estimulos condicionado e incondicionado (Thompson y Krupa, 1994), o con el paradigma de traza en exclusiva (Clark y Squire, 1998).

Recientemente, hemos emprendido el estudio de la actividad sinaptica individual a lo largo del circuito del hipocampo en ratones silvestres y transgenicos (Gruart et al., 2005). Para ello, el animal se implanta con electrodos de estimulacion en la rama supraorbitaria del nervio del trigemino y con electrodos de estimulacion en el musculo orbicularis oculi. Ademas, el animal se implanta con electrodos de estimulacion en las colaterales de Schaffer en el hipocampo contralateral, asi como con electrodos de registro en la zona de las dendritas apicales de la capa CA1 del hipocampo (stratum radiatum). Se realiza un condicionamiento de traza similar al descrito mas arriba, con la diferencia de que a los 300 ms de la presentacion del estimulo condicionado se da un breve (50 [micro]s) pulso electrico en las colaterales de Schaffer y se registra el potencial monosinaptico extracelular que se produce en CA1. Asi se puede seguir la evolucion funcional de esta sinapsis a lo largo del condicionamiento. Los resultados preliminares disponibles indican que el potencial sinaptico evocado en CA1 por estimulacion de las colaterales de Schaffer incrementa ligeramente en su pendiente (mV/s) a lo largo del aprendizaje. Esto sugiere la presencia de una facilitacion de dicho paso sinaptico, debida al proceso de condicionamiento (Gruart et al., 2005). Tambien hemos podido demostrar que la induccion artificial de potenciacion a largo plazo (LTP) en dicha sinapsis es capaz de bloquear el aprendizaje del animal experimental. Esta tecnica tiene un interes especial porque permite ser aplicada en ratones transgenicos, knock-out condicionales, mutantes espontaneos, etc. Esto supone la disponibilidad de tecnicas de estudios conductuales y de aprendizaje in vivo en estos pequenos roedores.

LINEAS FUTURAS DE EXPERIMENTACION

Por lo dicho hasta aqui, una pregunta aun pendiente de respuesta es donde y como se genera o elabora la respuesta palpebral condicionada. Estudios electrofisiologicos en gatos (Aou et al., 1992) y conejos (Leal-Camapanario et al., 2005) y estudios recientes sobre genes de expresion temprana (Gruart et al., 2000b) sugieren que amplias zonas de la corteza motora y sensorial podrian estar relacionadas con el aprendizaje de este tipo de respuesta motora y/o con los aspectos cognitivos de la misma. Asi pues, parece necesario estudiar en detalle estas zonas corticales durante el momento mismo de la adquisicion del movimiento palpebral condicionado; es decir, realizando experimentos in vivo, con el animal en perfectas condiciones fisiologicas. Mas arriba se ha indicado la importancia que tendria la realizacion de registros de la actividad neuronal de modo simultaneo en muy diversas regiones corticales y sub-corticales relacionadas con el movimiento palpebral (Morcuende et al., 2002) durante el proceso de aprendizaje. El objetivo a medio plazo seria determinar no ya el sitio, sino el estado funcional subyacente al aprendizaje motor. A esta linea experimental estan dedicados, pues, todos nuestros esfuerzos.

Recepcion: Julio de 2005

Aceptacion final: Octubre de 2005

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AGNES GRUART

y

JOSE M. DELGADO-GARCIA (2)

Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, Espana

(1) Este trabajo ha sido realizado con una ayuda del MCyT (BFI2002-00936).

(2) Correspondencia: Prof. Jose M. Delgado-Garcia Division de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide. Ctra. de Utrera, Km. 1. 41013-Sevilla, Espana Tlfno: + 34-954-349374. Fax: + 34-954-349375. Correo electronico: jmdelgar@upo.es
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Author:Gruart, Agnes; Delgado-Garcia, Jose M.
Publication:Revista Latinoamericana de Psicologia
Date:Jan 1, 2007
Words:7448
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