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Bacterias productoras de histamina en tres especies de pescado.

RESUMEN

La presente investigacion tiene como objetivo identificar las bacterias productoras de histamina, responsables de las escombrotoxicosis, en tres diferentes especies de pescado: armadillo (Hipostomus watwata), bocachico (Pochilodus reticulalius) y lisa (Mugil curema), de elevado consumo en Venezuela. A 36 muestras de las tres especies se les realizo la medicion del pH por el metodo de Kelleger y col., asi como un recuento de aerobios mesofilos (RTA), siguiendo la metodologia propuesta por la Asociacion Americana de Salud Publica (APHA). Las muestras se sembraron en los medios de Me. Conkey (MC) y eosina azul de metileno (EMB), especificos para el aislamiento de Gram Negativos. Para la identificacion de las bacterias Gram Negativas productoras de histamina se utilizo el medio de Niven modificado y las pruebas de bioquimica primaria y secundaria segun la tablas de Zinsser. Los resultados mostraron valores promedio de pH muy similares entre las especies de pescado estudiadas (6,40-6,66). El RTA del armadillo no estuvo dentro de los limites recomendados por la ICMSF ([10.sup.5]-[10.sup.7]). Los generos bacterianos productores de histamina fueron: Escherichia coli, Aeromonas sp, Enterobacter, Citrobacter y Plesiomona shigelloides. Se observo un patron comun en bocachico y armadillo en relacion con la produccion de histamina por parte de Escherichia coli y en lisa y bocachico con el genero Aeromonas. Se concluye que las bacterias productoras de histamina en las especies de pescado armadillo, bocachico y lisa, son de los generos Escherichia, Aeromonas, Enterobacter, Citrobacter y Plesiomona, las cuales son similares a las reportadas en otras especies de pescado.

Palabras clave: Histamina, bacterias, pescado, Gram negativos.

ABSTRACT

The objective of this research was to identify the Gram negative histamine producing bacteria, responsible for scombroid intoxication in three fish species: armadillo (Hipostomus watwata), bocachico (Pochilodus reticulates) and lisa (Mugil curema). All of these are highly commercial fish in Venezuela. Thirty six samples were taken and pH was measured, following the Kelleger et al. methodology. Aerobic mesophilic bacteria (RTA) were also determined using American Public Health Association (APHA) criteria. All strains were cultured in Mc. Conkey (MC) and eosin-methylene blue media (EMB), for specific Gram negative isolation. To identify Gram negative histamine producing bacteria, Niven's modified media by Yoshinaga et al. was used, as well as Zinsser's tables for primary and secondary biochemistry. Results showed similar values for pH in all species studied (6.40-6.66). Armadillo RTA was higher than values recommended by ICMSF ([10.sup.5]-[10.sup.7]). Histamine producing genera were: Escherichia coli, Aeromonas sp, Enterobacter, Citrobacter and Plesiomona shigelloides. A common pattern was observed in armadillo and bocachico in histamine production by: E. coli, and similar patterns were also observed in lisa and bocachico for Aeromonas. The conclusion of this work is that Histamine producing bacteria in armadillo, bocachico and lisa are Escherichia, Aeromonas, Enterobacter, Citrobacter and Plesiomona, similar to those reported in other fish species.

Key words: Histamine, bacteria, fish, Gram negative.

Histamine Producing Bacteria on Three Fish Spices

INTRODUCCION

Venezuela, como pais costero del Atlantico Centra Occidental, tiene una ubicacion favorable desde el punto de vista pesquero, que ha llevado al pais a ocupar una posicion importante entre los productores latinoamericanos [11]. Actualmente, este rubro ha registrado un progresivo crecimiento con una produccion pesquera nacional para el ano 1998 de 536.190,47 TM [13].

La region zuliana cuenta con una red fluvial formada por un gran numero de rios de cauces permanentes, ademas del Lago de Maracaibo, cuya area es de 16.360 [Km.sup.2]. Para el ano 1998 la estimacion pesquera regional fue de 56.300 TM, ocupando el tercer lugar despues de los estados Falcon y Oriente con un aporte del 10,5% a la produccion pesquera nacional [11].

En el estado Zulia la pesca se localiza principalmente en los municipios que circundan el Lago de Maracaibo y es llevada a cabo de manera artesanal. Dentro de las principales especies que se capturan en estas zonas se tiene: armadillo (Hipostomus watwata), bocachico (Pochilodus reticulates) y lisa (Mugil curema), entre otras.

Luego de que el pescado es capturado comienza a sufrir una serie de cambios quimicos, produciendose variaciones en sus caracteristicas organolepticas (sabor, olor, color), debido a procesos de autolisis, oxidacion, hidrolisis de las grasas y crecimiento microbiano [3].

Uno de los metodos para retrasar estos procesos consiste en reducir la temperatura del producto, por refrigeracion o congelacion despues de su captura [10,12], Se ha reportado que la temperatura es el factor ambiental que mas influencia ejerce en el mantenimiento de este producto [9, 10].

Una inadecuada manipulacion y conservacion del pescado influye favorablemente en el crecimiento bacteriano. Existen, ademas de estos factores extrinsecos de descomposicion, otros definidos por Huss [5] como intrinsecos: alta actividad de agua, elevado pH post mortem, altas concentraciones de nitrogeno no proteico (NNP) y la condicion del pescado como organismo poiquilotermo.

Dentro de la gran cantidad de especies que pueden crecer bajo estas condiciones, existe un conjunto de bacterias que generan producto de su metabolismo la endoenzima histidina descarboxilasa y por lo tanto pueden producir histamina a partir de la histidina libre [10, 12]. Esta amina biogena es la responsable de las escombrotoxicosis, cuando su concentracion en el musculo del pescado sobrepasa las 200 partes por millon (ppm) [14].

Muchos de los expendios de la ciudad de Maracaibo y sus alrededores, se encuentran al aire libre y sin refrigeracion, y sin condiciones sanitarias adecuadas; por lo tanto la calidad microbiologica del pescado que alli se expende es pobre, existiendo en este alta posibilidad de encontrar bacterias formadoras de histamina.

En este trabajo se determino el pH muscular, el recuento de aerobios mesofilos e identificacion de los generos productores de histamina, en tres especies de pescado que se expenden en la ciudad de Maracaibo, estado Zulia, Venezuela.

MATERIALES Y METODOS

Recoleccion de las muestras

Se recolectaron doce pescados de cada una de las siguientes especies: armadillo (Hipostomus watwata), bocachico (Pochilodus reticulatus), y lisa (Mugil curema). Los pescados previamente eviscerados tenian un peso aproximado de 350 a 450 g, fueron adquiridos en un centro de acopio que se caracteriza por expender sus productos pesqueros sin refrigeracion a una temperatura promedio de 30[grados]C. Los pescados fueron transportados en hielo al laboratorio, donde se realizaron los siguientes analisis.

pH muscular

Se determino pesando 10 g de musculo y homogenizandolos en 50 mL de agua bidestilada desionizada durante 1 min en un homogenizador Virtis. La lectura del pH se realizo utilizando un potenciometro marca Metrohm/620 [9].

Analisis microbiologico

El recuento de aerobios mesofilos se realizo siguiendo el metodo propuesto por la Asociacion Americana de Salud Publica (APHA) [1], Para ello se realizaron cortes en diferentes zonas del musculo del pescado: cabeza, lomo, cola, con la ayuda de un bisturi esteril. Se pesaron 11 g y se colocaron en 99 mL de agua peptonada esteril al 0,1%. Las muestras se homogenizaron en un aparato marca Virtis a 3500 r.p.m. por un tiempo de 2 min.

De la suspension se tomo 1 mL para realizar diluciones seriadas ([10.sup.-2] [10.sup.-6]) en tubos de ensayo que contenian 9 mL de agua peptonada al 0,1%. Luego se agrego 0,1 mL de cada dilucion en las placas de Plate Count agar, Mac Conkey (MC), y Eosina Azul de Metileno (EMB), todos de la marca Merck[R]. Las diluciones fueron sembradas en placas por extension e incubadas en una estufa marca Thelco a 37[grados]C por 48 horas; una vez transcurrido este tiempo se realizo el contaje de microorganismos en un cuenta colonias marca Fisher Intruments, USA.

Se seleccionaron de las placas de MC, colonias termentadoras y no termentadoras de la lactosa y, del EMB, colonias verde metalizadas y violeta, y subcultivadas en el agar nutritivo en tubo (Merck[R]) a 37[grados]C por 24 h.

Identificacion de bacterias Gram negativas productoras de histamina

A partir del tubo de agar Nutritivo (AN) fueron sembradas las cepas en un medio selectivo formulado para la identificacion de bacterias productoras de histamina denominado medio de Niven modificado propuesto por Yoshinaga y col. [15], incubado a 37[grados]C por 24 a 48 h. Este medio tiene una composicion de 0,5% de Triptona; 0,5% de extracto de levadura; 2% de L-Histidina; 0,5% de Cloruro de Sodio (NaCl); 0,02% de Rojo de Cresol. La positividad de la prueba se evidencia a traves de la formacion de gas (tubo de Durham) y el viraje del indicador Rojo de Cresol de pardo naranja a rojo.

Las colonias aisladas que resultaron positivas a la produccion de histamina, fueron inoculadas a partir del tubo de AN en el medio de Triple Azucar Hierro (TSI) marca Merck[R] y en placas de AN para realizar la prueba de la oxidasa.

Dependiendo de los resultados del TSI y la oxidasa se realizaron los siguientes test para la identificacion de las colonias: string-test, manitol, inositol, lisina, arginina, ornitina descarboxilasa, indol, hidrolisis de la urea citrato de Simmons y motilidad. Las mismas fueron interpretadas empleando las tablas de Zinsser [16],

Analisis estadistico

El diseno experimental fue completamente aleatorizado y los datos analizados utilizando el analisis de varianza de una sola via de clasificacion, apoyados por el software estadistico Statistix. En caso de encontrar diferencias significativas por especies, las medias se compararon usando la prueba de Tukey con un nivel de significacion de 0,05 [2].

RESULTADOS Y DISCUSION

pH muscular

En la TABLA I se presentan los valores de pH del musculo de las especies estudiadas. Los mismos no presentaron diferencias (P<0,05) entre si. La especie con mayor pH fue el armadillo, con 6,66 y la de pH menor fue la lisa con 6,41. El pH del musculo se acerco a la neutralidad debido a la baja produccion de acido lactico, consecuencia de la escasa presencia de glucogeno en el musculo del pescado, menor al 0,5% [12]. Estos valores de pH favorecen el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, entre los cuales se encuentran algunas especies bacterianas productoras de histamina [5, 12]; los valores de pH son optimos para la actividad enzimatica de la histidina descarboxilasa.

Recuento total de aerobios mesofilos

La TABLA I muestra los valores promedios del recuento de microorganismos aerobios mesofilos (RTA) expresados en [log.sub.10] UFC/g, presentes en el musculo de las diferentes especies de pescados estudiadas. La especie armadillo presento un contaje de microorganismos de 6,62; mientras que en las especies lisa y bocachico fue de 5,69 y 5,62, respectivamente. El analisis de varianza demostro que no hubo diferencias significativas en el RTA de las especies estudiadas.

Al comparar los valores de RTA obtenidos, con los limites microbiologicos establecidos por la Comision Internacional de Especificaciones Microbiologicas para Alimentos (ICMSF) para pescado fresco [6], 6-7 [log.sub.10] UFC/g, se encontro que las tres especies se ubican en los limites microbiologicos establecidos, lo que podria interpretarse como un valor aceptable, sin embargo la presencia de bacterias productoras de histamina indica una elevada potencialidad de riesgo de intoxicacion si se considera que es un alimento expendido en precarias condiciones higienicas.

Al comparar los valores de RTA obtenidos en la presente investigacion, con los limites establecidos por la APHA para este tipo de alimento [1], se observa que las tres especies de pescado presentaron recuentos por encima de la cifra establecida como maxima, que es de 5 [log.sub.10] UFC/g. Esto podria ocurrir por falta de una adecuada refrigeracion y por la exposicion a periodos de tiempo largos a temperatura ambiente [3, 12]; factores que favorecen el crecimiento acelerado de los microorganismos. Aunado a esto, la elevada humedad de las especies estudiadas, entre 70,49 y 72,47% [7], y la alta disponibilidad de aminoacidos libres favorecen la rapida proliferacion bacteriana [12].

Identificacion de generos bacterianos

En la TABLA II se muestran los generos bacterianos productores de histamina presentes en las especies de pescados estudiadas, identificadas con la ayuda del medio de Niven modificado por Yoshinaga y col. [15], El genero bacteriano aislado en la especie lisa fue Aeromonas sp., mientras que en la especie armadillo se aislaron los generos Enterobacter sp y Escherichia coli y en la especie bocachico los generos Plesiomona shigelloides, Citrobacter sp, Aeromonas sp. y Escherichia coli.

Dichos resultados son similares a los reportados por Lopez y col. [10] en atun (Thunnus thynnus) almacenado a 0, 8 y 20[grados]C, quienes encontraron microorganismos, tales como Aeromonas, Enterobacter, Citrobacter. Es importante destacar que el atun tuvo en comun con la especie lisa analizada en esta investigacion la presencia del genero bacteriano Aeromonas; lo que podria deberse a elevados niveles de histidina libre en el musculo de ambos pescados, siendo para atun 745 mg/g y para lisa 206 mg/g [8], Hardy y col. [4], tambien reportaron el genero Escherichia coli como productor de histamina en caballa (Scomber scombrus) y atun.

Las bacterias formadoras de histamina encontradas en las tres especies estudiadas no constituyen parte de su microflora natural, por lo que su presencia podria ser el resultado de la recontaminacion post mortem [4]. El crecimiento de dichas especies se vio favorecido por la temperatura de almacenamiento. Pan y col. [12] reportan que la histidina descarboxilasa presenta una temperatura optima de 37[grados]C, lo que llevo a considerar que podria haber una alta probabilidad de encontrar histamina en concentraciones de riesgo para el consumidor [4, 10].

CONCLUSIONES

De las especies de pescado armadillo, bocachico y lisa que se expenden sin refrigeracion en el mercado de Maracaibo puede concluirse que:

--EI pH del musculo de las especies estudiadas es cercano a 7, lo que favorece el crecimiento bacteriano.

--EI RTA, se encuentra por encima de los limites microbiologicos establecidos por la APHA.

--EI RTA se encuentra por debajo de los limites establecidos por la ICMSF, sin embargo el aislamiento y deteccion de bacterias productoras de histamina tiene relacion con el tiempo de almacenamiento, temperatura, pH y la seguridad de estas especies como alimento.

--Los generos bacterianos productores de histamina identificados en la especie de pescado armadillo fueron: Enterobacter sp, Escherichia coli; en bocachico Plesiomona shigelloides, Citrobacter sp, Aeromonas sp, y Escherichia coli; en la especie lisa se identifico el genero bacteriano Aeromonas sp.

--La exposicion del pescado a la temperatura ambiental y su permanencia en esta por largos periodos de tiempo favorece el crecimiento bacteriano y la actividad enzimatica por parte de las bacterias que descarboxilan la histidina libre.

RECOMENDACIONES

Ampliar el estudio de la produccion de histamina en las especies estudiadas.

Cuantificar la concentracion de histidina libre presente en el musculo de las especies de pescados analizadas mediante la realizacion de un perfil de aminoacidos.

Estudiar la presencia de histamina en especies de pescado de elevado consumo en la region zuliana que se expenden en similares condiciones.

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de La Universidad del Zulia (CONDES-LUZ), por el financiamiento del presente trabajo.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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[16] ZINSSER, J. Microbiologia. Ed. Panamericana. Buenos Aires. 20a edicion. Cap. 2. 1696 pp. 1992.

Pedro Izquierdo (1), Maria Aliara (1), Gabriel Torres (1), Andreina Fernandez (2), Maryan Paulinkevicius (2) y Jenny Fuenmayor (2)

(1) Unidad de Investigacion Ciencia y Tecnologia de Alimentos (UDICTA), Facultad de Ciencias Veterinarias.

(2) Escuela de Bioanalisis, Facultad de Medicina, La Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

E-mail poic@telcel.net.ve; allara@mipunto.com

Recibido 06/02 / 2001. Aceptado: 16 / 09 / 2001.
TABLA I
VALORES DE pH MUSCULAR Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS
MESOFILOS (RTA) EN LAS ESPECIES DE PESCADO ESTUDIADAS

Especie de pescado    PH    RTA *    Norma ICMSF   Norma APHA

Armadillo            6,66   6,62
Bocachico            6,53   5,69       6-7           5
Lisa                 6,41   5,62

* [Log.sub.10] UFC/g. Norma ICMSF [6], Norma APHA [1].

TABLA II
GENEROS BACTERIANOS PRODUCTORES DE
HISTAMINA EN LAS ESPECIES DE PESCADO
ESTUDIADAS

Especie de Pescado   Generas Bacterianos

Armadillo            Enterobacter sp.
                     Escherichia coli

Bocachico            Plesiomona shigelloides
                     Citrobacter sp.
                     Aeromonas sp.
                     Escherichia coli

Lisa                 Aeromonas sp.
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Author:Izquierdo, Pedro; Aliara, Maria; Torres, Gabriel; Fernandez, Andreina; Paulinkevicius, Maryan; Fuenm
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Sep 1, 2001
Words:3242
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