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Bacterias celuloliticas aisladas del intestino de termitas (Nasutitermes nigriceps) con caracteristicas prebioticas y potencial en la degradacion del pasto.

Isolated cellulolytic bacteria in the gut termites (Nasutitermes nigriceps) with probiotic characteristics and potential pasture degradation

Introduccion

Las termitas han sido consideradas tradicionalmente como plagas que destruyen la madera, pero tambien poseen una importante funcion en la naturaleza como descomponedoras de materia organica rica en lignocelulosa (Ramirez y Lafranco, 2001). En la region Sucrena Colombiana, una practica tradicional entre los pequenos ganaderos es la utilizacion de termiteros arboreos como aditivo para la alimentacion de bovinos afirmando que su uso favorece la ganancia de peso en estos animales. Aunque no se han encontrado reportes cientificos especificos relacionados con este aspecto, el efecto puede ser considerado como una consecuencia de la incorporacion en el rumen de microorganismos lignoceluloliticos (Warnecke, et al., 2007) que habitan en el intestino de las termitas o en la estructura del termitero, y que pueden contribuir con el mejoramiento de la degradacion de pastos y forrajes.

Existen algunas investigaciones que argumentan la presencia de bacterias con capacidad celulolitica en el intestino de las termitas y otros estudios que indican, que la actividad metabolica de esos microorganismos es similar a la realizada por las bacterias ruminales. Breznak y Switzer, citados por Ibarra (2006), plantean que las termitas digieren sustratos lignocelulosicos gracias a microorganismos simbiontes como bacterias, protozoos y hongos que habitan en sus intestinos, transformandolos en acetato como principal fuente de energia y precursor biosintetico. Mendez y Equihua (2001), afirman que las termitas obreras son capaces de degradar la celulosa de los vegetales con la ayuda de protozoarios, bacterias y levaduras que viven dentro de su tracto intestinal y que facilitan las enzimas para este fin. Ohkuma (2008), refiere que las termitas inferiores tienen una porcion dilatada en el intestino grueso densamente poblada por microorganismos simbiontes que contribuyen en la digestion de sustancias lignocelulosicas. Warnecke et al., (2007), llevaron a cabo un analisis de metagenomica en la comunidad de bacterias que residen en el intestino grueso de termitas Nasutitermes revelando presencia de Treponema y Fibrobacter. Sakar et al., (1988), en estudios realizados en Odontotermes, encontraron que Micrococcus luteus y M. roseus degradaron varios tipos de celulosa mediante la produccion de celulasas endogenas y exogenas in vitro.

Dentro de las bacterias con capacidad celulolitica encontradas en el intestino de las termitas pueden existir algunas con propiedades probioticas las cuales pueden contribuir a mejorar la degradacion de material fibroso; los microorganismos probioticos deben poseen caracteristica importantes como son, la resistencia al acido, pH, temperatura, sales biliares y, otros, que les permite superar las barreras acida y biliar en el tracto digestivo de los animales, manteniendose asi en estado viable y concentraciones adecuadas (Tuomola et al., 2001; Rondon et al., 2008). Los microorganismos probioticos revisten una gran importancia por los efectos beneficos que aportan en la nutricion animal.

El objetivo del presente trabajo fue aislar bacterias celuloliticas del intestino de termitas arboreas (Nasutitermes nigriceps), recolectadas en la Cienaga de la Caimanera del municipio de Covenas--Sucre, para evaluar sus caracteristicas probioticas in vitro y determinar su potencial en la degradacion del pasto Maralfalfa (Pennisetum sp).

Materiales y metodos

--Recoleccion de las termitas. Se colectaron manualmente termiteros arboreos del genero Nasutitermes ubicados en la Cienaga de la Caimanera del municipio de Covenas en el departamento de Sucre y se extrajeron las termitas mediante flotacion en solucion salina 20% p/v. Las termitas aisladas fueron lavadas con detergente antibacterial y posteriormente, se procedio a separar y macerar el intestino en agua peptonada esteril 0.1% p/v, llevando la mezcla a un tubo de ensayo y agitandola en un vortex para liberar las bacterias del intestino. Se realizaron diluciones de esta mezcla y se inocularon en cajas Petri con medio Luria-Bertani (LB) suplementado con Carboximetilcelulosa (CMC) 2% p/v (Ortiz et al., 2010); las cajas fueron incubadas a 30[grados]C, durante 48 horas en condiciones anoxigenicas; finalizado el tiempo, se vertio sobre la superficie de la caja, una solucion de Rojo Congo al 1% durante 10 minutos. Pasado ese tiempo se descarto el exceso de colorante y se lavo tres veces con solucion salina; seguidamente se seleccionaron y aislaron los microorganismos que presentaron halos claros de hidrolisis sobre el fondo rojo con un diametro no menor de 5 mm y se purificaron con repiques sucesivos (Gaitan y Perez, 2007).

--Evaluacion de las caracteristicas probioticas in vitro. Las bacterias que presentaron halos con mayores dimensiones fueron sometidas a las siguientes pruebas probioticas empleando una concentracion conocida de inoculo ([10.sup.6] UFC/ml): a) tolerancia a temperatura de 30[grados] y 42[grados]C (Avila, et al., 2010); b) tolerancia a diferentes concentraciones de sales, biliares, 0.0, 0.05, 0.15, y 0.3% p/v (Guilliland et al., 1990) y de NaCl, 0, 2, 5 y 10% p/v (Rondon et al., 2008); d) evaluacion a diferentes valores de pH, 5, 6 y 7 (Ortiz y Reuto, 2007); e) pruebas de antagonismo empleando bacterias ruminales y E.coli para observar la formacion de halos de inhibicion de crecimiento en placa (Gaitan y Perez, 2007). En todos los casos de evaluo la poblacion bacteriana por conteo en placa en UFC/ml.

--Prueba de degradacion de sustratos vegetales lignocelulosicos. El experimento se realizo in vitro utilizando hojas de pasto Maralfalfa (Pennisetum sp), las cuales fueron lavadas, secadas y molidas hasta conseguir trozos de 1 a 2 mm de longitud. Seguidamente se esterilizo el pasto en autoclave y se vertio 1 g de este, en varios tubos de ensayo con medio liquido LB; los tubos fueron inoculados con las bacterias seleccionadas en una concentracion de [10.sup.6] UFC y luego incubados por 24, 48 y 72 horas; pasado el tiempo se extrajo el sobrenadante y se determino la concentracion de azucares reductores mediante la prueba del acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) utilizando un Espectrofotometro y una longitud onda de 540 nm; se utilizo una muestra control en donde se determino la concentracion inicial de azucares reductores. Todos los ensayos se llevaron acabo por triplicado (Gaitan y Perez, 2007; Sosa et al., 2006).

Para establecer la digestibilidad del pasto por parte de las bacterias seleccionadas se extrajo el medio liquido de cada tubo de ensayo con una pipeta y el precipitado se llevo a un horno a 60[grados]C por 1 hora. Pasado este tiempo se peso el material vegetal residual y se resto a la cantidad inicial de pasto en cada tubo de ensayo para calcular el porcentaje de digestibilidad de acuerdo a la siguiente ecuacion (Sosa et al., 2006):

% digestibidad = [PMS - R/PMS] x 100

PMS: Peso inicial de la materia seca.

R: Residuo o peso final de la materia seca.

--Identificacion de los microorganismos. Las bacterias que presentaron los mejores resultados en las pruebas probioticas y degradacion de pasto fueron sometidas a pruebas bioquimicas rutinarias y a traves del Kit comercial API E (bioMerieux SA) para identificar el genero y posible especie.

--Analisis estadistico. Los ensayos fueron organizados en un diseno completamente al azar, los datos obtenidos se sistematizaron y analizaron mediante una ANAVA y en el caso de la existencia de diferencias significativas se aplico una prueba de comparaciones multiples a traves de la Diferencia Minima Significativa (DMS) en el programa SPSS.

Resultados y discusion

Las termitas halladas y recolectadas en los arboles de mangle del estuario de la Cienaga de la Caimanera en el municipio de Covenas, departamento de Sucre pertenecen al genero Nasutitermes especie nigriceps (Haldeman, 1853; Abadia y Arcila, 2009), el cual se agrupa dentro de la familia Termitidae (Matsui, et al., 2009). Esta familia de termitas tiene una dieta basada principalmente en hojarasca, madera y pastos (Fernandez, et al., 2008), para lo cual, poseen bacterias intestinales con actividad celulolitica que facilitan la digestion de estos materiales. En este sentido, para el caso de las termitas Nasutitermes, segun Wenzel, et al., (2002), se ha demostrado que las bacterias que habitan en sus intestinos contribuyen con la digestion de la celulosa.

--Caracteristicas de las bacterias celuloliticas aisladas. El revelado con Rojo Congo permitio aislar 9 microorganismos con actividad celuloliticas de un total de 30 bacterias; la observacion microscopica con tincion de Gram permitio observar bacilos Gram (-) de diferente morfologia, los cuales fueron codificados como BTN1, BTN2, BTN3, BTN4, BTN5, BTN6, BTN7, BTN8 y BTN9. Asimismo, se encontro que los bacilos BTN2, BTN6, BTN7 y BTN8 presentaron los mayores halos de hidrolisis de CMC, 7, 10, 14 y 12 cm respectivamente, siendo un indicador de la actividad celulolitica de estas bacterias (tabla 1). Por lo cual, fueron seleccionadas para el desarrollo de las pruebas probioticas y de degradacion de pasto.

La presencia de los halos en el medio solido con CMC es un indicador de que las bacterias poseen enzimas que digieren celulosa. Los valores obtenidos en la prueba son similares a los reportados por Ortiz, et al., (2010), quienes obtuvieron halos de degradacion entre 3 y 15 mm de diametro con cepas de bacterias aisladas de nejayote de maiz (mezcla de agua, cal y residuos de cascarilla y endospermo de maiz).

--Caracteristicas probioticas evaluadas. Dentro de los criterios de seleccion para considerar microorganismos con potencial probiotico se encuentran, la capacidad de sobrevivir en el tracto gastrointestinal, resistir a las secreciones digestivas (gastricas, bilis, etc.) y poseer actividad antimicrobiana contra patogenos (Guillot, 2003). Los resultados obtenidos se analizan a continuacion.

a) Tolerancia a cambios de temperatura. Los bacilos BTN2, BTN7 Y BTN8 mantuvieron su crecimiento en concentraciones de [10.sup.8] UFC/ml despues de 24 horas de incubacion a temperatura de 30[grados] y 42[grados]C, indicando con ello que estas bacterias no son susceptibles a las variaciones de temperatura en este rango. Sin embargo, el bacilo BTN6 presento un aumento significativo en su crecimiento a 30[grados]C, pasando de una concentracion de [10.sup.7] a [10.sup.8] UFC/ml. De igual manera, se observo que esta bacteria no fue capaz de crecer a 42[grados]C, lo cual revela que es muy susceptible a las variaciones de temperatura (tabla 2).

Estadisticamente se observo, que el P-valor (0.067) fue mayor que alfa (0.05); la prueba DMS para comparaciones multiples permitio establecer que el crecimiento del bacilo BTN6 fue estadisticamente diferente de los bacilos BTN7 y BTN8; no se observo diferencias significativas entre los bacilos BTN2, BTN7 y BTN8, los cuales demostraron capacidad de crecer en cantidades adecuadas ([10.sup.8] UFC/ml), a temperaturas relativamente altas como las encontradas en el rumen (38[grados] y 42[grados]C) (Van Lier, 2009). Este dato es importante si se tiene en cuenta que las concentraciones mas habituales de un microorganismo probiotico oscilan entre [10.sup.8] y [10.sup.10] UFC/ml, (Acedo y Rico 1998).

b) Tolerancia a sales biliares. Se observo que los bacilos BTN2, BTN7 y BTN8 presentaron incrementos significativos en la concentracion de UFC/ml despues de 24 horas de incubacion, en presencia de sales biliares en rangos de 0.05% a 0.30%, pasando, en todos casos, de una densidad de [10.sup.7] a [10.sup.8] UFC/ml. El bacilo BTN6 no tuvo incrementos poblacionales significativos en ninguna de las concentraciones (tabla 3). El crecimiento de los bacilos no se afecto por las diferentes concentraciones de las sales biliares; este resultado es deseable en los microorganismos candidatos a probioticos puesto que aseguran su paso a traves del tracto gastrointestinal del animal hospedero pudiendo desarrollar sus actividades metabolicas sin verse inhibidas.

Estudios realizados por Avila, et al., (2010), revelaron buenos crecimientos de cepas de Lactobacillus aislados del tracto intestinal de animales de granja en presencia de sales biliares al 0.15%; Campos et al., (2009), reportaron crecimientos en placa de bacterias lacticas de 1.7 x [10.sup.7] UFC/ml en medios con 0.30% de sales biliares, los cuales son inferiores a los obtenidos en esta prueba con los bacilos nativos BTN2, BTN6 y BTN8, pero similares a los obtenidos con el bacilo BTN7. Sin embargo, en todos estos ensayos se alcanzaron densidades poblacionales de [10.sup.7] y [10.sup.8] UFC/ml, encontrandose dentro de los valores habituales establecidos para microorganismos probioticos (Acedo y Rico, 1998).

Las variaciones observadas revelan un comportamiento inversamente proporcional entre el crecimiento de las bacterias y las concentraciones de sales biliares empleadas. El analisis de varianza para esta prueba demostro la existencia de diferencias significativas en el ensayo, debido a que el P-valor (0.017) fue menor que el alfa de 0.05; la prueba de DMS para comparaciones multiples permitio establecer que existen diferencias entre los crecimientos obtenidos en ausencia y presencia de sales biliares para cada uno de los bacilos estudiados,. Asimismo, se determino que no existen diferencias significativas entre los crecimientos obtenidos en concentraciones de sales biliares de 0.05%, 0.15% y 0.03%, para cada uno de los bacilos.

c) Tolerancia a NaCl. En esta prueba se observo que el bacilo BTN2 presento un incremento en la magnitud de su densidad poblacional inicial despues de 24 horas de incubacion en presencia de NaCl al 2%, pasando de [10.sup.7] a [10.sup.8] UFC/ml, mientras que los bacilos BTN6, BTN7 y BTN8 se mantuvieron. De igual forma, se observo que para concentraciones de NaCl al 5%, los bacilos BTN2, BTN7 y BTN8 mantuvieron sus magnitudes de crecimiento, entre tanto que el bacilo BTN6 tuvo una disminucion sustancial pasando de [10.sup.8] a [10.sup.6] UFC/ml; los datos revelan que todos los bacilos en estudio presentaron disminucion de la magnitud de su densidad poblacional inicial en presencia de NaCl al 10% (tabla 4). Asimismo, se observo que el crecimiento de las bacterias seleccionadas es inversamente proporcional a la concentracion de NaCl y el bacilo BTN6 es el mas susceptible a los incrementos de salinidad, mientras que las bacterias BTN2, BTN7 y BTN8 son las tolerantes frente a este factor. A pesar de estas diferencias observables, el analisis de varianza para esta prueba revela que no hay diferencias significativas entre los crecimientos de los bacilos estudiados, en cada una de las concentraciones de NaCl ensayadas, ya que el P-valor (0.347) fue mayor que el alfa del 0.05.

En consecuencia, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en esta prueba, se puede decir que las bacterias seleccionadas en este estudio tienen capacidad para adaptarse facilmente a condiciones de salinidad relativamente altas, ya que demostraron que pueden crecer en densidades de [10.sup.6] hasta [10.sup.8] en concentraciones de NaCl entre 2% y 10% con una osmolaridad de 684 mOsm y 3400 mOsm respectivamente. Al respecto, segun Van Lier y Regueiro, (2008), la osmolaridad del liquido ruminal oscila entre 260 y 340 mOsm, pudiendo llegar a 400 mOsm con el consumo de concentrado. Por lo que este factor no afectaria significativamente a los bacilos estudiados a nivel de este organo.

d) Tolerancia a pH. Se observo que ninguna de las bacterias estudiadas crecio a pH 4 despues de 24 ho ras de incubacion; el bacilo BTN6 a diferencia de los bacilos BTN2, BTN7 y BTN8, presento un incremento en la magnitud de su densidad poblacional pasando de [10.sup.7] a [10.sup.8] UFC/ml en medios con pH 5 y 7 (tabla 5). Marrero, et al., (2010), reporto crecimientos de bacterias celuloliticas de 1.7 x [10.sup.8] UFC/ml y 7.87 x [10.sup.8] UFC/ ml a pH 6.6 a nivel del rumen, siendo muy similar a los resultados obtenidos en esta prueba para cada una de los bacilos estudiados. De igual forma, Hernandez y Cobos, (2001) reportaron crecimientos de bacterias celuloliticas extraidas del colon distal de conejos de 4 x [10.sup.2] UFC/ml a pH 6.3 y del apendice cecal de 9 x [10.sup.7] a pH 7.3, inferiores en la mayoria de los casos a los obtenidos en este ensayo.

El analisis de varianza para esta prueba revelo que no existen diferencias significativas entre los crecimientos obtenidos de los bacilos seleccionados en los diferentes grados de pH, debido a que el P-valor (0.380) fue mayor que el alfa del 0.05.

Con respecto a esta prueba, segun Calsamiglia y Ferret, (2002), el pH normal optimo en el rumen oscila entre 6.2 y 7.0, por lo que se puede decir que las bacterias estudiadas pueden crecer en cantidades adecuadas a nivel del rumen sin afectarse significativamente por variaciones entre pH 5 y pH 7. Van Lier y Regueiro, (2008), refiere que el pH ruminal puede variar entre 5.8 y 7.0, pero puede disminuir aun mas luego de la ingesta de concentrados debido a la rapida fermentacion producida que genera un medio acido; tambien, plantean que las bacterias celuloliticas del rumen se inhiben a pH menor de 6.0. No obstante, las bacterias celuloliticas empleadas en este estudio crecieron a pH 5 en cantidades adecuadas ([10.sup.8] UFC/ml), lo que indica que pueden adaptarse facilmente al pH ruminal.

e) Prueba de antagonismo. En este ensayo se observo que las colonias de bacterias de las termitas no inhibieron significativamente el crecimiento de las bacterias ruminales utilizadas, ya que, en el caso de las bacterias BTN2 y BTN7, presentaron halos alrededor de los discos de papel filtro que no superaron los 2 mm de ancho, mientras que las bacterias BTN6 y BTN8 no formaron halos de inhibicion. En presencia de bacterias E. coli aisladas del liquido ruminal se pudo observar que las bacterias BTN2 y BTN8 formaron halos de 2 mm de ancho alrededor de los discos de papel filtro, en comparacion con las bacterias BTN6 y BTN7 que formaron halos de inhibicion de E. coli de 3 mm cada una, siendo diferencias poco relevantes. Gaitan y Perez, (2007), reportaron tamanos de halos de inhibicion muy superiores (5mm y 7.5 mm) a los de este ensayo, formados por interaccion entre bacterias celuloliticas aisladas de compost generados en cultivos de crisantemo. Zamudio y Zavaleta, (2003) reportaron halos de inhibicion de E.coli y Listeria monocytogenes entre 2 y 8 mm de diametro, superiores a los hallados en este ensayo. Mientras tanto, Barrera y Charry, (2008), obtuvieron cepas aisladas de compostaje de residuos de lechuga que no presentaron efectos antagonicos.

Este aspecto se considera uno de los mas importantes, debido a que se requiere que las bacterias aisladas del abdomen de Nasutitermes nigriceps al incorporarse al rumen no afecten el desarrollo de la microbiota normal que realiza funciones importantes en el metabolismo de los alimentos que consumen los bovinos. Sin embargo, el control de las poblaciones de coliformes en el animal es deseable ya que estas pueden causar enfermedades a nivel intestinal. Por lo tanto, las bacterias en estudio cumplen con este requisito pudiendo ser incorporadas al rumen sin afectar negativamente su ecosistema.

--Prueba de degradacion in vitro de sustratos vegetales lignocelulosicos. En este ensayo se observo que durante las primeras 48 horas las bacterias BTN2, BTN6 y BTN8 produjeron burbujas de gas en los medios, siendo mas evidente este fenomeno a las 24 horas y cesando por completo a las 72 horas; la bacteria BTN7 no produjo burbujeo durante el tiempo de observacion del experimento. En relacion con lo anterior, se han reportado bacterias productoras de gas metano e hidrogeno (Ibarra, 2006) aisladas del intestino de termitas, por lo que es posible que las burbujas obser vadas correspondan a algunos de estos gases, que se producen principalmente durante la fermentacion de la glucosa (Van Lier y Regueiro, 2008).

En cuanto a la produccion de azucares reductores, se observo que las bacterias BTN6 y BTN8 presentaron una tendencia similar, notandose un incremento en la concentracion de estos azucares en las primeras 48 horas, siendo mas eficiente la bacteria BTN8, con un descenso posterior en dichas concentraciones a las 72 horas de incubacion. Entre tanto, las bacterias BTN2 y BTN7 presentaron un comportamiento similar con aumento progresivo en los valores de la concentracion de azucares reductores durante las 72 horas de incubacion, destacandose la bacteria BTN7 que obtuvo la mayor concentracion de estos azucares en este periodo de tiempo (tabla 6). La eficiencia las bacterias para producir azucares reductores a partir del pasto se debe principalmente al ataque de enzimas microbianas especificas sobre la celulosa y la hemicelulosa que conforman la fibra vegetal (Lynd et al., 2002). Por lo que se puede decir que las bacterias BTN7 y BTN8 presentaron la mayor actividad celulolitica en el ensayo.

Para el proposito de la presente investigacion la bacteria BTN8 presento los mejores resultados en esta prueba, ya que se requiere que la bacteria al momento de incorporarse al rumen degrade la mayor cantidad fibra en el menor tiempo posible, liberando azucares reductores que posteriormente sean convertidos en acidos grasos volatiles (AGV) fundamentales para el rumiante. Si bien la bacteria BTN7 obtuvo el mejor resultado a las 72 horas de incubacion, no se observo que utilizara estos carbohidratos, ya que la concentracion de los mismos se mantuvo en aumento.

No obstante, a pesar de las variaciones observadas con respecto a la produccion de azucares reductores por parte de los bacilos seleccionados, el analisis de varianza revelo que no existen diferencias significativas en este aspecto, ya que se obtuvo un P-valor de 0.956 mayor que el alfa de 0.05.

En cuanto a la digestibilidad del pasto se observo que las bacterias BTN6 y BTN8 presentaron un comportamiento similar, incrementando el porcentaje de digestibilidad del pasto entre las 24 y 48 horas, siendo la bacteria BTN8 la mas eficiente (36.10%). Asimismo se observo que estas bacterias disminuyeron su actividad degradadora a las 72 horas de incubacion. En contraste, las bacterias BTN2 y BTN7 tuvieron una tendencia parecida incrementando progresivamente el porcentaje de digestibilidad del pasto durante las 72 horas de incubacion, destacandose la bacteria BTN7 que presento el mayor porcentaje de digestibilidad durante este periodo de tiempo (39.73%).

Los datos obtenidos en este experimento son superiores a los reportados por Grilli et al., (2011) quienes obtuvieron porcentajes de digestibilidad de celulosa en alfalfa (Medicago sativa) de 19,10% [+ o -] 4,721% con una cepa de Fibrobacter succionogenes, pero inferiores a los reportados por Clavero y Razz, (2009), donde la digestibilidad in vitro de Pennisetum sp. alcanzo el 52.1% y 62.45% utilizando bacterias ruminales. Igualmente fueron inferiores a los reportados por Heredia y Paladines, (2007), en los cuales el porcentaje de digestibilidad in situ de este pasto fue de 76.7% en promedio. Asimismo, fueron inferiores a los reportados por Soto, (2007) morera (Morus alba) de 64.4% y en madero negro (Gliricidia sepium) de 54%, en condiciones in vitro utilizando liquido ruminal. De igual forma, estuvieron dentro de los rangos obtenidos por Kato et al., (1998), quienes encontraron que bacterias aisladas del intestino de termitas Nasutitermes takasagoensis fueron capaces de degradar, en condiciones in vitro, compuestos lignocelulosicos presentes en el medio de cultivo con porcentajes variables de 28%, 60% y 95%. Cabe resaltar, que en las pruebas de digestibilidad de fibra donde se emplea liquido ruminal la degradacion del material vegetal es mas compleja y es producida no solo por bacterias, sino, tambien, por protozoarios y hongos que habitan en el rumen.

El analisis de varianza para esta prueba revelo que no existen diferencias significativas entre las bacterias con respecto a los porcentajes de digestibilidad del pasto Maralfalfa (Pennisetum sp.) empleado en el ensayo, ya que el P-valor (0.862) fue mayor que el alfa de 0.05.

Despues de analizar las pruebas realizadas a las diferentes bacterias aisladas del intestino de termitas Nasutitermes nigriceps, se puede observar que la bacteria BTN7, presento los mejores resultados, seguida de la bacteria BTN8. Las pruebas bioquimicas API 20E permitieron identificar que estas bacterias pertenecen al genero Enterobacter aerogenes. Este tipo de bacteria ya habia sido reportado por Ramin et al., (2008) en el intestino de termitas Coptotermes curvignathus demostrando que eran microorganismos anaerobios facultativos Gram (-), mientras que Kuhnigk et al., (1994) aislo bacterias Enterobacter aerogenes con capacidad para degradar monomeros de lignina de termitas Mastotermes darwiniensis y Nasutitermes nigriceps. Asimismo, Dechamps, citado por Ramin, et al., (2008) revelo que bacterias el genero Enterobacter tienen capacidad para asimilar compuestos fenolicos.

Los resultados sugieren que las bacterias BTN7 y BTN8 tienen capacidad para crecer adecuadamente en condiciones relativamente dificiles de temperatura, salinidad, pH y presencia de sales biliares, con buen porcentaje de digestibilidad de fibra vegetal y ausencia de antagonismo frente a microorganismos ruminales, lo cual indica que la accion de las bacterias celuloliticas que habitan en el intestino de las termitas (Nasutitermes nigriceps) puede ser una de las causas que favorece la ganancia de peso de los bovinos alimentados con termiteros en la region Sucrena. Siendo, por lo tanto, candidatas para utilizarse como probioticos en la alimentacion de rumiantes.

Teniendo en cuenta la poca informacion que existe con respecto al efecto positivo producido por el consumo de termitas arboreas sobre la ganancia en peso de bovinos sucrenos y, con el animo de contribuir en el conocimiento en este aspecto, se llevo a cabo el presente trabajo; sin embargo, es necesario continuar con el desarrollo de mas investigaciones al respecto.

Conclusiones

Los resultados de la presente investigacion permiten concluir lo siguiente:

--Las termitas Nasutitermes nigriceps recolectadas en la Cienaga de la Caimanera en el municipio de Covenas, contienen en el interior de su intestino bacilos celuloliticos Gram (-) identificados como Enterobacter aerogenes.

--Los bacilos Enterobacter aerogenes son capaces de sobrevivir en condiciones ambientales relativamente dificiles manteniendo concentraciones adecuadas, sin inhibir el crecimiento de bacterias ruminales, pero afectando significativamente el crecimiento de bacterias E. coli.

--Este tipo de bacterias presentan una actividad celulolitica que les permite degradar la fibra vegetal del pasto a nivel in vitro en porcentajes significativos.

--Las capacidades de supervivencia y digestion de la fibra vegetal que poseen los bacilos Enterobacter aerogenes, sugiere que pueden adaptarse a las condiciones ambientales del rumen y favorecer la digestibilidad del pasto a nivel de este organo, pudiendo repercutir en la nutricion de bovinos alimentados con termiteros.

Recibido: octubre 10 de 2012

Aprobado: junio 15 de 2013

Agradecimientos

Los autores expresan sus agradecimientos a la Universidad de Cordoba y a la Universidad de Sucre, por su colaboracion.

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Cecilia Lara Mantilla, Quimica; MSc; Ph. D. Linea de Investigacion en Biotecnologia. Directora e investigador GRUBIODEQ. Investigadora principal proyecto. Directora Tesis Maestria. Universidad de Cordoba. lara_mantilla_cecilia@hotmail.com; clara@correo.unicordoba.edu.co

Roberto Carlos Acosta Pineda, Biologo. Magister en Biotecnologia. Investigador GRUBIODEQ. Universidad de Cordoba.
Tabla 1. Caracteristicas de las bacterias aisladas
de termitas Nasutitermes nigriceps.

Codigo de         Morfologia      Tincion    Diametro del
las bacterias                     de Gram      halo de
                                              hidrolisis
                                                 (mm)

BTN1            Bacilos rectos   Negativos       2.1
* BTN2          Bacilos rectos   Negativos       7.0
BTN3            Bacilos rectos   Negativos       3.8
BTN4            Bacilos rectos   Negativos       4.1
BTN5            Bacilos curvos   Negativos       6.5
* BTN6          Bacilos rectos   Negativos       10.0
* BTN7          Bacilos rectos   Negativos       14.0
* BTN8          Bacilos rectos   Negativos       12.0
BTN9            Bacilos rectos   Negativos       4.0

* Bacterias seleccionadas para las pruebas probioticas y
degradacion de pasto.

Tabla 2. Concentracion de los bacilos seleccionados
incubados a 30[grados] y 42[grados] C por 24 horas.

Codigo de      Temperatura         UFC/ml.            UFC/ml.
los bacilos   de incubacion        Tiempo              Tiempo
                [grados]C          0 horas            24 horas

BTN2           30[grados]     1,15 x [10.sup.8]   2,53 x [10.sup.8]
               42[grados]     1,24 x [10.sup.8]   2,15 x [10.sup.8]
BTN6           30[grados]     3,20 x [10.sup.7]   2,06 x [10.sup.8]
               42[grados]     4,00 x [10.sup.7]         0,00
BTN7           30[grados]     1,35 x [10.sup.8]   2,88 x [10.sup.8]
               42[grados]     1,12 x [10.sup.8]   2,42 x [10.sup.8]

Tabla 3. Concentracion de los bacilos seleccionados en
diferentes concentraciones de sales biliares despues de 24
horas de incubacion.

Codigo de     % Sales         UFC/ml.            UFC/ml.
los bacilos   biliares        Tiempo              Tiempo
                              0 horas            24 horas

BTN2           0.00%     6,50 x [10.sup.7]   2,63 x [10.sup.8]
               0.05%     5,90 x [10.sup.7]   1,35 x [10.sup.8]
               0.15%     1,18 x [10.sup.8]   1,82 x [10.sup.8]
               0.30%     7,90 x [10.sup.7]   1,18 x [10.sup.8]
BTN6           0.00%     8,40 x [10.sup.7]   1,72 x [10.sup.8]
               0.05%     4,60 x [10.sup.7]   8,80 x [10.sup.7]
               0.15%     3,80 x [10.sup.7]   7,30 x [10.sup.7]
               0.30%     1,02 x [10.sup.8]   1,33 x [10.sup.8]
BTN7           0.00%     1,25 x [10.sup.8]   2,54 x [10.sup.8]
               0.05%     5,40 x [10.sup.7]   1,22 x [10.sup.8]
               0.15%     8,70 x [10.sup.7]   1,09 x [10.sup.8]
               0.30%     7,10 x [10.sup.7]   9,60 x [10.sup.7]
BTN8           0.00%     1,14 x [10.sup.8]   2,67 x [10.sup.8]
               0.05%     4,80 x [10.sup.7]   1,35 x [10.sup.8]
               0.15%     6,20 x [10.sup.7]   1,05 x [10.sup.8]
               0.30%     9,20 x [10.sup.7]   1,33 x [10.sup.8]

Tabla 4. Concentracion de los bacilos seleccionados en
diferentes concentraciones de NaCl despues de 24 horas de
incubacion.

Codigo de     % NaCl %    UFC/ml. Tiempo      UFC/ml. Tiempo
los bacilos                   0 horas            24 horas

BTN2            0.00     8,40 x [10.sup.7]   2,69 x [10.sup.8]
                2,00     7,50 x [10.sup.7]   2,58 x [10.sup.8]
                5,00     1,34 x [10.sup.8]   1,90 x [10.sup.8]
                10,0     7,80 x [10.sup.7]   3,00 x [10.sup.6]
BTN6            0.00     6,30 x [10.sup.7]   1,86 x [10.sup.8]
                2,00     1,52 x [10.sup.8]   2,37 x [10.sup.8]
                5,00     1,18 x [10.sup.8]   8,00 x [10.sup.6]
                10,0     9,60 x [10.sup.7]   7,00 x [10.sup.6]
BTN7            0.00     1,01 x [10.sup.8]   2,84 x [10.sup.8]
                2,00     1,66 x [10.sup.8]   2,97 x [10.sup.8]
                5,00     1,21 x [10.sup.8]   2,37 x [10.sup.8]
                10,0     1,43 x [10.sup.8]   2,30 x [10.sup.7]
BTN8            0.00     1,24 x [10.sup.8]   2,91 x [10.sup.8]
                2,00     1,32 x [10.sup.8]   2,88 x [10.sup.8]
                5,00     1,47 x [10.sup.8]   1,51 x [10.sup.8]
                10,0     1,73 x [10.sup.8]   4,10 x [10.sup.7]

Tabla 5. Concentracion de los bacilos seleccionados en
diferentes grados de pH despues de 24 horas de incubacion.

Codigo de     Grados    UFC/ml. Tiempo      UFC/ml. Tiempo
los bacilos   de pH         0 horas            24 horas

BTN2            4      1,15 x [10.sup.8]          0.0
                5      1,74 x [10.sup.8]   2,01 x [10.sup.8]
                7      1,24 x [10.sup.8]   2,29 x [10.sup.8]
BTN6            4      3,20 x [10.sup.7]          0.0
                5      2,87 x [10.sup.7]   1,08 x [10.sup.8]
                7      4,00 x [10.sup.7]   2,02 x [10.sup.8]
BTN7            4      1,35 x [10.sup.7]          0.0
                5      1,04 x [10.sup.8]   2,13 x [10.sup.8]
                7      1,12 x [10.sup.8]   2,95 x [10.sup.8]
BTN8            4      1,76 x [10.sup.8]          0.0
                5      1,53 x [10.sup.8]   2,27 x [10.sup.8]
                7      1,88 x [10.sup.8]   2,92 x [10.sup.8]

Tabla 6. Produccion de gas y azucares reductores por
parte de los bacilos seleccionados en la prueba de
digestibilidad de la fibra vegetal.

Codigo de                 Produccion de gas
los bacilos

              0 horas   24 horas   48 horas   72 horas

BTN2             -         +          +          -
BTN6             -         +          +          -
BTN7             -         -          -          -
BTN8             -         +          +          -

Codigo de     Concentracion de azucares reductores g/L
los bacilos

                         24 horas   48 horas   72 horas

BTN2          0,063870   0,230396   0,576096   0,622470
BTN6          0,004848   0,371627   0,732083   0,681492
BTN7          0,156619   0,350548   0,552909   0,877530
BTN8          0,059654   0,466484   0,797428   0,550801
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Author:Lara Mantilla, Cecilia; Acosta Pineda, Roberto Carlos
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2013
Words:6818
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