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Bacterial and fungal microflora present in the cloacae of domestically kept red-footed tortoises (Geochelone carbonaria)/ Microbiota bacteriana y fungica presentes en la cloaca de tortugas (Geochelone carbonaria) criadas como animales domesticos/Microbiota bacteriana e fungica presentes na cloaca de jabutis-piranga (Geochelone carbonaria) criados em domicilio.

INTRODUCAO

A popularidade de diferentes repteis criados como animais de estimacao vem crescendo e tem causado preocupacao quanto ao seu impacto na saude publica, tendo em vista que estes animais podem representar uma fonte potencial de infeccao para humanos, na medida em que, por exemplo, eliminam no ambiente micro-organismos oportunistas e patogenicos pelas suas fezes (1, 2).

Veterinarios que trabalham com repteis frequentemente sao indagados pelos proprietarios sobre os tipos de doencas que estes animais podem transmitir, bem como sobre as medidas profilaticas que devem ser tomadas para prevenir a ocorrencia e transmissao destas doencas (2). Desta forma, o conhecimento dos micro-organismos que estes animais albergam passa a ser importante para auxiliar na orientacao dos proprietarios quanto aos cuidados com estes animais e implementacao de medidas profilaticas adequadas.

Considerando-se que os repteis participam de forma crescente do mercado de animais criados como pets (1, 3), suas caracteristicas microbiologicas devem ser melhor estudadas e compreendidas, visando evitar que adoecam ou venham a obito devido a ocorrencia de doencas infecciosas e nao atuem como fontes de infeccao para pessoas com as quais convivem. Assim sendo, e considerando a escassa literatura existente acerca do assunto, fica evidente a importancia do conhecimento da microbiota dos repteis, para auxiliar na preservacao da saude humana e animal.

O presente trabalho teve como objetivos verificar a ocorrencia e frequencia das microbiotas bacteriana (bacterias aerobias e anaerobias facultativas) e fungica presentes na cloaca de jabutis-piranga (Geochelone carbonaria) criados em domicilio. Procurou-se tambem pesquisar genes codificadores de fatores de virulencia de linhagens de Escherichia coli e Salmonella spp. isoladas.

MATERIAL E METODOS

Coleta de amostras e exame microbiologico

A coleta das amostras foi realizada em domicilios onde sao criados jabutis-piranga (Geochelone carbonaria) como pets na cidade de Sao Paulo, Brasil. Foram coletados suabes cloacais de 100 animais higidos os quais foram entao acondicionados em meio de Stuart (Oxoid) e encaminhados sob refrigeracao ao laboratorio. Estes suabes foram inicialmente inoculados em caldo BHI (Oxoid) com incubacao a 37[degrees]C por 24 horas. As amostras tambem foram semeadas em agar sangue de carneiro (5%) e agar MacConkey, com incubacao em aerobiose a 37[degrees]C com leituras em 24-48 horas. As amostras cultivadas em caldo BHI foram posteriormente semeadas em agar sangue e MacConkey e incubadas de forma similar.

Visando a pesquisa de Salmonella spp., os suabes tambem foram inoculados em caldo tetrationato e incubados a 37[degrees]C por 24 horas. Paralelamente as amostras foram semeadas em agar xilose-lisina-tergitol 4 (XLT4) (Difco), com incubacao em aerobiose a 37[degrees]C com leituras a 24-96 horas. Apos a incubacao as amostras inoculadas em caldo tetrationato tambem foram semeadas em agar XLT4 e incubadas de forma similar.

Para a pesquisa de fungos filamentosos e leveduras, procedeu-se ao cultivo da amostra em caldo Sabouraud-dextrose e agar Sabouraud-dextrose (Oxoid) com cloranfenicol (100 mg/l) com incubacao a 25[degrees]C por um periodo de 3 dias para o caldo e de 7 dias para o agar que foi submetido a avaliacoes diarias. As amostras cultivadas em caldo foram posteriormente semeadas em agar Sabouraud-dextrose com cloranfenicol e incubadas de forma similar.

As bacterias isoladas foram identificadas de acordo com caracteristicas macro e microscopicas bem como por provas bioquimicas conforme descrito por Murray et al. (4). Os fungos filamentosos e leveduras isolados foram identificados de acordo com caracteristicas macro e microscopicas, bem como por provas fisiologicas, de acordo com Barnett, Payne e Yarrow (5) e Hunter e Hunter (6). Em casos de duvida, foram utilizados os sistema de identificacao RapID[R] (Oxoid).

Pesquisa de genes codificadores de fatores de virulencia em estirpes de Escherichia coli e Salmonella spp. utilizando a reacao em cadeia da polimerase

A pesquisa de fatores de virulencia das estirpes de E.coli isoladas de suabes cloacais foi realizada pela reacao em cadeia da polimerase (PCR). Para a obtencao do material genetico foi utilizado o metodo de extracao por choque termico (7). O sobrenadante foi removido para a realizacao da PCR. A cada extracao realizada foram utilizadas como controles positivos, estirpes de Escherichia coli contendo genes codificadores dos fatores de virulencia em estudo provenientes da colecao de cepas do Laboratorio de Bacteriologia e Micologia da FMVZ-USP.

Foram utilizados os primers comercialmente disponiveis para detectar os genes que codificam para pili associados com pielonefrite (pap), hemolisina (hly), aerobactina (iuc), fator necrotizante citotoxico 1 (cnfl), fimbria S (sfa), adesina afimbrial I (afa), intimina (eae), enterotoxina termo-labil (LT), enterotoxina termo-estavel (STa e STb) e gene de invasao invA. Para a deteccao dos fatores de virulencia comuns a E.coli patogenicas foram utilizados os primers e protocolos de reacao descritos por Schultsz et al. (8) (LT), Olsvik et al. (9) (STa), Blanco et al. (10) (STb), Yamamoto et al. (11) (UPEC), Blanco et al. (12) (eae). Para Salmonella spp. foi utilizado o primer para deteccao do gene invA de acordo com o protocolo descrito por Rahn et al. (13). Para cada reacao foram utilizadas as mesmas estirpes usadas como controles positivos nas reacoes de extracao.

Os produtos de PCR (10 [micron]l) foram separados por eletroforese em gel de agarose 2%, corados com brometo de etidio (10 [micron]g/ml) e fotografados sob luz ultravioleta. O marcador de pares de bases utilizado foi o 100 bp DNA ladder (Invitrogen).

Analise Estatistica

As analises estatisticas foram realizadas utilizando-se o teste de Fischer, empregando-se o "software" Graphpad Instat 1992-98 (14) para realizacao dos mesmos.

RESULTADOS

Isolamento e identificacao de micro-organismos presentes em suabes cloacais de jabutis-piranga.

Foram isoladas bacterias em todas as amostras analisadas ao passo que, fungos foram isolados em 62% delas. A associacao entre dois ou mais generos e/ou especies de microorganismos ocorreu em todas as amostras avaliadas. Foram isoladas bacterias Gram positivas e Gram negativas em, respectivamente, 68 (68%) e 99 (99%) amostras analisadas. Leveduras e fungos filamentosos foram isolados em, respectivamente, 57% e 8% das amostras (Tabela 1).

Foram isolados 18 generos de bacterias, 06 generos de leveduras e 03 generos de fungos filamentosos. Os generos de micro-organismos isolados com maior frequencia foram os seguintes (Tabela 1): Escherichia coli (67%), Klebsiella spp. (54%), Bacillus spp. (42%), Candida spp. (42%), Citrobacter spp. (33%), Staphylococcus spp. (29%), Corynebacterium spp. (15%) e Aeromonas spp. (15%), dentre outros. A frequencia de isolamentos de Escherichia coli foi semelhante a de Klebsiella spp. e maior (P<0,05) do que as frequencias de isolamentos de cada um dos outros generos ou especies de micro-organismos.

Verificou-se que as frequencias de isolamentos de bacterias Gram negativas foram maiores (P<0,05) do que as de Gram positivas e tambem maiores (P<0,05) que de fungos. Por sua vez, as frequencias de isolamentos de bacterias Gram positivas foram semelhantes as de fungos.

Pesquisa de genes codificadores de fatores de virulencia em estirpes de Escherichia coli e Salmonella spp.

Nenhuma das 67 estirpes de E.coli isoladas foi positiva para presenca de genes codificadores dos fatores de virulencia sfa, iuc, pap, cnf; hly, afa, eae, LT, STa e STb. Por sua vez, todos os 07 isolados de Salmonella spp. foram positivos para a presenca do gene inv A.

DISCUSSAO E CONCLUSOES

A quantidade de repteis criados como pets em domicilios apresentou um aumento significativo nos ultimos anos sendo que o risco de desenvolver infeccoes causadas por microorganismos transmitidos por estes animais tambem aumentou em igual proporcao (15). Segundo diferentes autores, repteis criados em domicilios podem apresentar risco potencial de transmissao de diferentes micro-organismos (2, 16).

Ha uma escassez de estudos envolvendo o isolamento de bacterias e fungos de cloaca de repteis, particularmente de jabutis-piranga. No presente estudo, uma grande diversidade de generos de bacterias (n=18) e fungos (n=9) foi isolada, todos tambem comumente encontrados no trato intestinal de humanos e outros animais. Todas as especies bacterianas isoladas ja foram descritas como agentes de infeccoes em repteis havendo poucos relatos em jabutis (15, 16). Existem tambem relatos de isolamentos de alguns destes micro-organismos a partir de microbiota de diferentes repteis, sendo escassas as informacoes em jabutis (17-19).

Repteis criados como pets sao menos suscetiveis as doencas infecciosas quando o proprietario adota medidas adequadas quanto ao manejo dos animais. Entretanto, os microorganismos que compoem a microbiota podem se tornar patogenicos para seus hospedeiros quando os mesmos encontram-se debilitados (20). No presente estudo, Pseudomonas spp. (8%) e Aeromonas spp. (15%) foram os principais patogenos bacterianos isolados que apresentam potencial risco para jabutis (2). Klebsiella spp. (54%), Citrobacter spp. (33%), Staphylococcus spp. (29%), Corynebacterium spp. (15%), Streptococcus spp. (7%), Edwardsiella spp. (5%), Proteus spp. (4%), Enterobacter spp. (3%) podem, sob determinadas circunstancias, ser patogenicos para estes animais (2). Todos os micro-organismos isolados tambem apresentam importancia para a saude humana, podendo estar associados a diferentes sindromes clinicas (4), ressaltando-se assim a importancia da implementacao de medidas preventivas relacionadas ao contato com estes animais.

O micro-organismo mais frequentemente isolado foi Escherichia coli (67% das amostras). Quando consideradas outras especies de repteis, pode-se mencionar o estudo de Meyer-Junior, Dias e Araujo (18) que isolaram Escherichia coli (66%) a partir de 15 suabes de cloaca de tartarugas gigantes sul-americanas (Podocnemis expansa); tambem isolaram E. coli (26%) a partir de 15 suabes de cloaca de mucuas (Kinosternon scorpioides) mantidas em cativeiro. No presente estudo, embora tenha sido elevada a ocorrencia de E. coli, deve-se ressaltar que nenhuma das estirpes apresentou genes codificadores dos fatores de virulencia pesquisados (pap, iuc, cnf1, sfa, afa, hly, eae, LT, STa e STb) os quais estao comumente associados a doencas em humanos. Estes resultados apresentam importancia sob o ponto de vista de saude publica, tendo em vista que, particularmente no que se refere a este microorganismo, pode-se concluir que sao baixos os riscos relacionados ao convivio entre humanos e estes pets que albergam E. coli. Na literatura pesquisada nao foram encontradas referencias acerca de estudos de fatores de virulencia de estirpes de Escherichia coli isoladas de jabutis ou repteis em geral.

Um total de 7% de Salmonella spp. foram isoladas no presente estudo. Saelinger et al. (21) examinaram suabes de cloaca de 94 tartarugas nao tendo isolado Salmonella spp. de nenhuma das amostras. Strohl et al. (22), por sua vez, avaliaram fezes de 52 quelonios, dentre os quais 03 Geochelone carbonaria, tendo verificado presenca de Salmonella spp. em 23% das amostras, sendo que nas amostras oriundas de Geochelone carbonaria este microorganismo nao foi isolado. Existe uma grande variabilidade de resultados quando se trata do isolamento de Salmonella spp. a partir de diferentes especies de repteis (21, 23, 24). Salmonella spp. geralmente nao causam infeccoes em repteis (20), mas constituem causa importante de doencas no ser humano (25). No presente estudo, todos os isolados de Salmonella apresentavam o gene invA, essencial para expressao da virulencia (26). Trata-se de um achado relevante no tocante a saude animal e humana considerando-se as propriedades de virulencia e importancia clinica do gene invA.

Relatos de fungos isolados da cloaca de repteis mantidos como pets sao escassos. As informacoes disponiveis sao limitadas a leveduras em animais doentes ou necropsiados ou aquilo que possa ser extrapolado de animais selvagens (15). No presente estudo, fungos (leveduriformes e/ou filamentosos) foram isolados a partir de 62% das amostras, sendo que em nove (9%) delas havia mais de um genero e/ou especie de fungo. A ocorrencia do mesmo genero e/ou especie de fungo em hospedeiros diferentes, como foi o caso de Candida tropicalis isolada a partir de 22 jabutis, assim como a presenca de diferentes fungos em um mesmo hospedeiro, sugere que os repteis possam atuar como animais carreadores de fungos filamentosos e leveduras em suas cloacas.

Medidas simples sao consideradas orientacoes basicas para a manutencao de repteis como pets. Os proprietarios destes animais devem atentar para as boas praticas de criacao e manejo para assim evitar ou reduzir o estresse que representa a principal condicao predisponente para a ocorrencia de doencas. A maior parte das infeccoes em repteis e causada por patogenos oportunistas que infectam animais imunossuprimidos. Por sua vez, os jabutis criados como pets podem se transformar em fontes de infeccao para humanos e vice-versa. O risco de transmissao de micro-organismos entre animais ou entre o animal e o homem pode ser minimizado quando implementadas as precaucoes necessarias relativas a aspectos de higiene. Deve-se considerar ainda que, a ausencia da aplicacao de medidas de manejo adequadas pode estar relacionada a oportunidade de transmissao de micro-organismos que apresentam genes codificadores de fatores de virulencia.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a colaboracao de Clarice Yukari Minagawa e Marina Caravatto Baras pelos seus valiosos auxilios na realizacao dos exames laboratoriais. Este trabalho foi financiado pela Fundacao de Amparo Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP 07/55784-5) e Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES--Bolsa de Mestrado de Carlos Alexandre Pessoa).

REFERENCIAS

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Recebido em: 27/02/12

Aceito em: 14/11/12

Nilson Roberti Benites [1]

Carlos Pessoa [2]

Luciana Bandini [2]

Andre Saidenberg [3]

Andrea Moreno [4]

Sonia Sakata [5]

Cleise Gomes [3]

Priscilla Melville [6]

[1] Prof. Associado da FMVZ USP, Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva e Saude Animal

[2] Mestrado no Programa de Pos-graduacao em Epidemiologia Experimental Aplicada as Zoonoses, Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva e Saude Animal da FMVZ-USP, Sao Paulo--SP

[3] Doutorando no Programa de Pos-graduacao em Epidemiologia Experimental Aplicada as Zoonoses, Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva e Saude Animal da FMVZ-USP, Sao Paulo--SP

[4] Professora Associada do Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva e Saude Animal da FMVZ-USP, Sao Paulo--SP

[5] Graduanda de Medicina Veterinaria da FMVZ-USP

[6] Medica Veterinaria--Doutorado em Microbiologia pelo ICB-USP--Laboratorio de Bacteriologia e Micologia da FMVZ-USP, Sao Paulo--SP
Tabela 1. Frequencias de isolamentos
dos micro-organismos isolados a partir
dos suabes cloacais de jabutis-piranga
(Geochelone carbonaria).

Micro-organismos

Bacterias                     %

Escherichia coli              67
Klebsiella spp.               54
Bacillus spp.                 42
Citrobacter spp.              33
Staphylococcus spp.           29
Klebsiella oxytoca            27
Citrobacter freundii          20
Aeromonas spp.                15
Corynebacterium spp.          15
Klebsiella pneumoniae         15
Klebsiella ozaenae            12
Staphylococcus haemolyticus   11
Corynebacterium striatum      10
Citrobacter amalonaticus      09
Micrococcus spp.              09
Pseudomonas aeruginosa        08
Acinetobacter spp.            08
Enterococcus spp.             07
Salmonella spp.               07
Staphylococcus                07
  saprophyticus subsp.
  saprophyticus
Streptococcus sp.             07
Aeromonas caviae              06
Aeromonas sobria              06
Serratia marcescens           06
Edwardsiella spp.             05
Enterococcus faecalis         05
Acinetobacter haemolyticus    04
Acinetobacter Iwofii          04
Citrobacter koseri            04
Edwardsiella tarda            04
Proteus spp.                  04
Aeromonas hydrophila          03
Corynebacterium xerosis       03
Enterobacter spp.             03
Staphylococcus cohnii         03
  subsp. Cohnii
Staphylococcus kloosii        03
Alcaligenes faecalis          02
Corynebacterium durum         02
Enterobacter aerogenes        02
Enterococcus faecium          02
Proteus mirabilis             02
Proteus vulgaris              02
Staphylococcus simulans       02
Edwardsiella hoshinae         01
Enterobacter cloacae          01
Staphylococcus capitis        01
  subsp. Capitis
Staphylococcus schleiferi     01
  subsp. Coagulans
Staphylococcus lentus         01

Leveduras

Candida spp.                  42
Candida tropicalis            22
Candida krusei                10
Rhodotorula spp.              09
Trichosporon spp.             09
Candida lusitaniae            07
Candida guilliermondi         03
Torulopsis spp.               02
Aureobasidium sp.             01
Geotrichum candidum           01

Fungos filamentosos

Rhizopus spp.                 04
Mucor spp.                    03
Penicillium sp.               01
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Author:Benites, Nilson Roberti; Pessoa, Carlos; Bandini, Luciana; Saidenberg, Andre; Moreno, Andrea; Sakata
Publication:Veterinaria e Zootecnia
Date:Mar 1, 2013
Words:3247
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