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Aumento del numero de amplicones obtenidos por IPCR en el ADN de personas seropositivas para HTLV-I afectadas con PET/HAM.

El virus linfotropico humano tipo I (HTLV-I) es un retrovirus incluido dentro del grupo HTLV, STLV, BLV de la subfamilia Oncovirinae. Se asocia, sobre todo, con la leucemia de celulas T del adulto (ATL, por las siglas en ingles) (1-5) y la paraparesia espastica tropical/mielopatia asociada con la infeccion por HTLV-I (PET/HAM) (6-21), aunque cada dia son mas fuertes las asociaciones con otras entidades clinicas como uveitis, artropatias, dermatitis infecciosa y la polimiositis (16). El HTLV-I es endemico en diversas regiones geograficas que incluyen Sur y Norteamerica, el sudeste de Japon, la region del Caribe y Africa. Como en muchas otras regiones, el virus se restringe geograficamente. En Colombia, el municipio suroccidental de Tumaco, sobre el Oceano Pacifico, es una zona endemica para el HTLV-I, pues se ha caracterizado por una elevada relacion en el aumento anual de la PET/HAM (17).

Se han visto secuencias no especificas con determinados resultados clinicos de la enfermedad; mientras tanto, en estudios moleculares, se demostro que en algunas partes del genoma del HTLV-I ciertos cambios en la secuencia nucleotidica se correlacionan con el origen geografico de los pacientes (22). Los factores responsables del progreso de infeccion a enfermedad todavia no se entienden por completo, aunque la activacion de las celulas linfoides en el huesped puede aumentar la expresion de genes virales y su replicacion. La produccion de bandas monorreactivas IgG e IgA por parte de los linfocitos B contra una proteina hibrida recombinante gag-env, aumenta de modo significativo en pacientes con PET/HAM en contraste con los portadores asintomaticos y los individuos seronegativos para el virus (23).

El HTLV-I se integra en el genoma de los pacientes con ATL y de los afectados por PET/HAM y segun la linea de evidencias que se acepta tradicionalmente, se cree que el proceso de integracion en el genoma del huesped humano ocurre al azar. Mas recientemente se ha consolidado una segunda linea de evidencias menos conocida, fundamentada en las observaciones hechas con base en el fraccionamiento en la composicion del genoma humano; segun las mismas, existe una preferencialidad de sitios de integracion en los isocoros ricos en GC (24,25); asimismo, mediante clonacion y secuenciacion de la region genomica flanqueante al provirus HTLV-I se observa que esta es rica en AT, lo que sugiere sitios de integracion preferencial dentro del genoma de individuos infectados (5,33).

En el desarrollo de la ATL se requiere la integracion previa del virus (26), que se efectua de un modo monoclonal (27) y se ha sugerido que este patron clonal de integracion es un indicador biologico particular del estado leucemico. Estos hechos proporcionan evidencias directas de la participacion del virus en el desarrollo de la ATL. Por otra parte, algunas evidencias polemicas informan la existencia de una correlacion entre los patrones de integracion y el curso clinico de la ATL (28,29).

En pacientes con PET/HAM los sitios de integracion del HTLV-I varian (30,31), se localizan en distintas regiones cromosomicas y se ha informado que su modo de integracion es policlonal aunque tambien de forma aleatoria (26,29,33,43,45), tanto en portadores asintomaticos como en individuos con PET/HAM, en contraste con lo que sucede en la ATL.

Mediante tecnicas basadas en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en ingles) se ha demostrado la expansion clonal de las celulas infectadas por HTLV-I de pacientes con PET/HAM en diversos estadios de la enfermedad (34,35). En este trabajo se analizo mediante la tecnica de PCR inversa la modalidad de integracion del HTLV-I en celulas infectadas in vivo, lo mismo que la variacion de los sitios de integracion del HTLV-I en pacientes con PET/HAM.

MATERIALES Y METODOS

La muestra. Se incluyeron 16 individuos seropositivos por ELISA, Western Blot y PCR para HTLV-I. De ellos, 11 tenian paraparesia espastica tropical, 3 eran portadores asintomaticos y 2 estaban afectados con enfermedades distintas. Ademas, los pacientes PET/HAM seropositivos para HTLV-I provenian de diversos sitios de la zona pacifica en Colombia.

Extraccion del ADN de linfocitos de pacientes seropositivos para HTLV-I. Los mononucleares perifericos se aislaron de las muestras sanguineas mediante separacion en gradientes de Ficoll-Hipaque (Histopaque[R]), se lavaron dos veces en amortiguador fosfato salino (PBS) (36) y el precipitado se liso inmediatamente por tratamiento con SDS/proteinasa K a 56[degrees]C. El ADN se extrajo por precipitacion en etanol y fenol, y el precipitado se resuspendio en 10 mmol/l de Tris-HCL pH 8.0, 1 mmol/l de EDTA36. La concentracion y el grado de pureza se midieron por fluorimetria. Se tomaron las precauciones necesarias para evitar la contaminacion en el area donde se hizo la extraccion del ADN.

Amplificacion del ADN genomico flanqueante al provirus HTLV-I por PCR inversa. Para llevar a cabo la amplificacion enzimatica mediante la tecnica de PCR inversa (IPCR) se utilizo la modificacion del protocolo desarrollado por Take-moto et al. (37), y puesto en marcha en 1998 en el Laboratorio de Biologia Molecular y Patogenesis de la Universidad del Valle (38). El proceso comprende una etapa de digestion con la enzima de restriccion Alu I, una autoligacion y posterior digestion de los anillos formados por Sst II (36). Finalmente, los autoligados no digeridos por Sst II se amplificaron por PCR (Figura 1).

[FIGURA 1 OMITIR]

Como cebadores de la PCR se emplearon el HTVL-009, 5'-AAGCCGGCAGTCAGTCGTGA-3' (8946-8927 nt) y el HTLV-010, 5'-AAGTACCGGCAACTCTGCTG-3' (8958-8977). Previamente a la realizacion de los ciclos de reacciones de PCR se sometieron las mezclas a una temperatura de 93[degrees]C durante 30 minutos para relajar el ADN circular y permitir su amplificacion. La reaccion de alineacion se hizo a 42[degrees]C durante 30 segundos y la de extension a 72[degrees]C por 30 segundos. Se efectuaron 40 ciclos de amplificacion en un termociclador Cetus Perkin Elmer. Los productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% con bromuro de etidio y para aumentar la resolucion en geles de poliacrilamida por tincion con plata (36). Se hizo un analisis para determinar el numero de amplicones por recuento segun el numero de bandas por muestra (un amplicon significo expansion monoclonal; mas de un amplicon, oligoclonal).

RESULTADOS

De las 16 muestras de PBMC de pacientes seropositivos infectados por el HTLV-I todos mostraron amplificacion de segmentos de ADN por IPCR. Sin embargo, el numero de amplicones registrado fue variable tanto en tamano como en la distribucion de ellos (Figura 2).

[FIGURA 2 OMITIR]

Un analisis detallado del tamano y la frecuencia de cada amplicon en los pacientes con PET/HAM mostro que existia una distribucion diferencial en la que algunos amplicones estaban mas representados que otros (Cuadro 1).

El amplicon de 230 pb mostro una frecuencia de 81.3% (13/16), el de 300 pb esta representado en 100% (16/16) y el de 860 pb se determino en su frecuencia de 81.3% (13/16). Para los amplicones de 300 y 860 pb que presentan 81.3% no todos los individuos tenian simultaneamente el mismo patron de bandas. El resto de amplicones mostro en general una baja frecuencia y coamplificacion variable.

Uno de los aspectos mas importantes del estudio era analizar la distribucion de amplicones IPCR de manera exclusiva en enfermos con PET/HAM. Para tal efecto, se incluyeron 11 pacientes PET/HAM, en quienes se obtuvo un numero promedio de amplicones de 7.2 [+ or -] 2, en contraste con el de los asintomaticos que fue 4 [+ or -] 2.2 y el promedio de 4 [+ or -] 1 en los de otras enfermedades.

Un analisis detallado de la distribucion de amplicones en el total de los 11 individuos PET/HAM revelo la presencia de un patron preferencial de distribucion de amplicones. La coamplificacion simultanea de los fragmentos de IPCR de 230, 300, 760, 860 y 2100 pb se observo en mas de 63% de ellos; 90% de los individuos coamplificaron los fragmentos de IPCR de 300 y 860 pb (Figura 3).

[FIGURA 3 OMITIR]

DISCUSION

Inicialmente varios autores (48,49) utilizaron la hibridacion con la tecnica Southern para determinar el tipo de integracion del provirus HTLV-I; sin embargo, esta metodologia ademas de ser dispendiosa y consumir tiempo tiene limitaciones de sensibilidad; por esta razon se desarrollo la IPCR con la gran ventaja de aumentar la sensibilidad en la determinacion del numero de provirus integrados. La IPCR es una herramienta que a partir de los estudios de Yoshida et al. (2) en 1984 se ha utilizado como criterio diagnostico para ATL desde 1994 (43,44). Los resultados de la presente investigacion sugieren que tambien se puede utilizar en PET/HAM.

Uno de los principales interrogantes en la biologia de los retrovirus es su modalidad de integracion al genoma de las celulas huespedes. El HTLV-I es un retrovirus que principalmente integra su ADN proviral en celulas linfocitarias de tipo T. Sin embargo, existen estudios de integracion proviral en otros tejidos como macrofagos, mucosa oral (39-41) y componentes del sistema nervioso central (42). En este trabajo se obtuvieron resultados solamente con respecto a la modalidad de integracion proviral en PBMC. Es importante destacar que las diferencias encontradas en oligoclonalidad reflejan el proceso de integracion en uno de los potenciales blancos celulares de la infeccion del virus in vivo. No se han efectuado hasta hoy estudios que determinen el patron de clonalidad de provirus en el ADN de otros tipos celulares.

En este estudio se caracterizo la proliferacion clonal de celulas infectadas por HTLV-I en todos los pacientes con PET/HAM, y se demostro que la modalidad de integracion del HTLV-I en el genoma de individuos con PET/HAM es oligoclonal. Los resultados mediante IPCR confirman los obtenidos por Greenberg et al. (32), Yoshida et al. (2,3), Wattel et al. (34) mediante Western Blot y los de Cavrois et al. (35) entre otros autores (38) que utilizaron IPCR. En todos ellos se ha definido una modalidad de integracion oligoclonal del provirus HTLV-I en el genoma de pacientes PET/HAM.

Con respecto al numero de amplicones obtenidos en este estudio se observo una tendencia en las personas con PET/HAM a poseer un mayor numero de amplicones (7.2 [+ or -] 2.2) en comparacion con las afectadas por otras enfermedades (4 [+ or -] 1) y con los portadores asintomaticos (4 [+ or -] 2). En parte, estas observaciones concuerdan con las evidencias ya informadas sobre las diferencias existentes en los patrones de clonalidad en la integracion del HTLV-I entre individuos afectados con ATL donde se presenta de modo monoclonal y los que sufren PET/HAM, en quienes se ha informado un modo de integracion oligoclonal (2,3,27-29).

Otra de las caracteristicas de la IPCR es que permite relacionar la intensidad de cada amplicon con su frecuencia para el genoma de cada individuo. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que el retrovirus HTLV-I en los individuos del estudio, se integro en sitios especificos debido a la constancia en el patron observado de bandas de integracion. En este sentido son especialmente interesantes las bandas de 300 y 860 bp que se observaron en todos los pacientes con PET/HAM. Las observaciones de este articulo contrastan con el hecho generalmente aceptado de que el sitio de integracion del HTLV-I es aleatorio (2,3,32). Sin embargo, para confirmar es importante explorar las bandas a nivel de sus secuencias a fin de poder asegurar la existencia de sitios de integracion preferencial del HTLV-I en personas con PET/HAM.

Las diferencias observadas en la intensidad de los ADN de IPCR en los individuos que presentaron integraciones multiples, implicarian que si bien hay simultaneamente una expansion de varios clones portadores del provirus, algunos de ellos estarian mas representados. Este hecho sugiere de nuevo la existencia de una preferencialidad en sitios de integracion. Los presentes resultados aportan evidencias a las observaciones hechas por el grupo de Bernardi (31) sobre la existencia de una preferencialidad parcial en el sitio de integracion hacia los isocoros ricos en GC y se complementan con las observaciones de Chow et al. (5) y de Wattel et al. (34) quienes de acuerdo con sus estudios de clonacion y secuenciacion del ADN adyacente a los LTR de HTLV-I de celulas de pacientes con ATL mostraron que la region genomica flanqueante al provirus es por lo general rica en pares AT. En su conjunto los resultados sugirieron la existencia de sitios de integracion preferencial del provirus HTLV-I en el genoma hospedero.

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Jesus Cabrera, M.Sc. [1], Felipe Garcia, Ph.D. [2]

[1.] Docente, Universidad del Tolima, Facultad de Ciencias, Ibague. Investigador Asociado, Laboratorio de Biologia Molecular y Patogenesis, Universidad del Valle, Cali.

[2.] Profesor Titular, Departamento de Ciencias Fisiologicas, Facultad de Salud. Director, Laboratorio de Biologia Molecular y Patogenesis, Universidad del Valle, Cali.
Cuadro 1
Distribucion de los individuos estudiados de acuerdo
con su estado clinico

Estado clinico             No de pacientes

PET/HAM                          11
ATL                               1
Portadores asintomaticos          3
Otras enfermedades                1

Cuadro 2

Numero total de amplicones obtenidos mediante IPCR en individuos
seropositivos para HTLV-I (n-16)

Amplicon   No pares de      Frecuencia
              bases      de individuos (%)

   1           185             12.5
   2           230             81.3
   3           260             25.0
   4           300            100.0
   5           370             37.5
   6           430              6.3
   7           490             31.3
   8           520             18.8
   9           580             86.3
   10          615             43.8
   11          680             18.8
   12          730             50.0
   13          860             81.3
   14          900              2.5
   15         1050              6.3
   16         1100             37.5
   17         1230              6.3
   18         2100             50.0
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Author:Cabrera, Jesus; Garcia, Felipe
Publication:Colombia Medica
Article Type:Clinical report
Date:Oct 1, 2000
Words:3645
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