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Association of the bovine growth hormone gene with Holstein cattle reproductive parameters/Asociacion del gen de la hormona de crecimiento bovino con parametros reproductivos en ganado Holstein.

INTRODUCTION

In specialized dairy herds, reproductive efficiency has a direct influence on productivity. Without efficient reproductive performance, milk production is strongly affected and thus the profitability of the herd. Cow fertility is affected by many factors, the age of the animal at puberty has a very strong influence and is transcendental due to the fact that older ages at the start of breeding and first calving reflect low reproductive efficiency (1).

A delay in the age of service or birth of each cow, or even, each cow discarded as a result of infertility affects the economic performance of the herd. When a heifer is delayed in entering the breeding program or a cow delays in returning to heat after delivery, there are expenses for the additional non-lactating period and lengthening of the generational interval (1, 2). In contrast, reduction of the heifers' rearing period and rapid growth, which brings them to the reproductive stage in a shorter amount of time, produces more births and more production during their lifetime. Therefore, it is essential to consider the factors that influence these parameters. The bovine growth hormone (BGH) gene has polymorphisms that influence these characteristics differently (2) and play a key role in the regulation of growth and development; indirectly influencing the reproductive efficiency of cattle (3-7).

BGH effect on growth is observed in several tissues including bone, muscle and adipose tissue. These effects result from both direct action of BGH on nutrient partitioning and on cell multiplication, as in the action mediated by the insulin-like growth factor 1, which stimulates cell proliferation and metabolic processes associated with protein deposition (8). In addition, significant relationships have been reported between BGH concentrations and the postpartum period, and consequently with cow fertility (9, 10).

The main concern behind the analysis of this association is to determine the influence of genetic variants of growth hormone on the scope of an earlier active reproductive stage. The aim of the research was to determine the association of intron 3 polymorphism of the bovine growth hormone (BGH) gene, with ages at first service, first birth, first postpartum service and second birth, in a population of Holstein cows in the state of Antioquia.

MATERIALS AND METHODS

Study areas and population. 408 Holstein cattle were used, belonging to 8 dairy herds located in the high tropics of Antioquia, northern and eastern areas of the state, in the municipalities of San Pedro de los Milagros (height 2475 mamsl; with a temperature of 14[degrees]C, Belmira (height 2550 mamsl, T[degrees] 14[degrees]C) and Santa Elena township of Medellin (height 2500 mamsl, T[degrees] 17[degrees]C).

DNA extraction and determination of genotypic variants. To determine the genotypic variants, coccygeal vein blood was extracted and DNA extraction was performed using the salting out technique (11). Only genomic DNA with suitable purity between 1.8-2.0 was considered for the studies to be performed.

The following oligonucleotides were synthesized, of 20 base pairs (pb) F 5'CCC ACG GGC AAG AAT GAG GC 3', R5' TGA GGA ACT GCA GGG GCC CA 3', which enabled amplification of the 329bp fragment which has the restriction site for endonuclease MspI (12).

This was carried out by PCR amplification for the specific region, using a final volume of 25 [micro]l containing 2.5 [micro]l 10X PCR buffer (1.0-1.5 mM of Mg[Cl.sub.2], 50 mM of KCl, 10 mM of Tris-HCl, pH of 8.3), 0.2 [micro]M of primers; 0.4 mM of each dNTPs, 2 mM of Mg[Cl.sub.2] 1 unit of Taq polymerase and ~30-60 ng of genomi DNA.

PCR was performed in a thermocycler (Biometra[R]). The conditions for amplification of the specific region of the BGH gene were: initial denaturation with heating for five minutes at 94[degrees]C, followed by 39 cycles of denaturation at 94[degrees]C for 1 minute, primer alignment (anneling) at 55[degrees]C for 1 minute, extension at 72[degrees]C for 1 min, and a final extension step of 3 minutes at 72[degrees]C to complete the reaction (12). The annealing temperature used was determined by following the recommendation of the primer supplier and through different trials that yielded more efficient alignment to said temperature (55[degrees]C) (12). As a positive control for all reactions, amplification of samples that were previously evaluated was performed and as negative control reactions in the absence of DNA. Genotypic variants were determined by using RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), using the restriction enzyme MspI. A final volume of 20 [micro]l was used, containing 5 [micro]l of PCR product, 2 [micro]l of buffer Tango 1X, 12.5 [micro]l of ultra-pure water, which was subjected to digestion by 5 units of restriction enzyme MspI for three hours at 37[degrees]C. The resulting product was observed by electrophoresis in agarose gel at 2.5% (w/v) and ethidium bromide staining. The restriction pattern expected for the (negative/negative) genotype was a 329 pb fragment, for the (positive/negative) genotype three fragments (329, 224 and 105 pb) and for the (positive/ positive) genotype two fragments (224 and 105 pb).

Estimation of allele frequencies. The frequency of the different alleles was estimated by determining the proportion of each form of the gene among the total number of copies in the study population. Homozygotes (two copies of the same allele) and heterozygous (one copy of each allele) were identified, and the frequency (F) of each allele was calculated by counting homozygotes and adding half the heterozygotes, with the method described by Hartl (13).

Statistical Analysis. To determine the association of each characteristic with the genotype for the BGH, several generalized linear models were adjusted based on known sources of variation for each of the dependent variables (age at first service, age at first birth, age at first postpartum service and age at second birth). The Tukey analysis was used to determine differences between the means for each of the fixed effect levels included in the models. The statistical packet SAS v9.2 was used for all analyzes (SAS Inst Inc., Cary, NC), (14).

The general model of fixed effects was carried out as follows:

[Y.sub.ijklmnopq] = [mu] + [G.sub.i] + [H.sub.j] + [AN.sub.k] + [MN.sub.l] + [(MN * AN).sub.m] + [(H * AN).sub.n] + [(H * MN).sub.O] + [(H * MN * AN).sub.P] + [(H * G).sub.q] + [e.sub.ijklmnopq]

Where:

[Y.sub.ijklmnopq] = age at first service, age at first birth, age at first postpartum service or age at second birth, of individual X, carrier of genotype i, located in herd j, with year of birth k and month of birth l

[mu] = mean for the characteristic

[G.sub.i] = fixed effect of the gentoype for BGH (i = 1 ... 3)

[H.sub.j] = fixed effect of the herd (j = 1...8)

[AN.sub.k] = fixed effect of the year of birth (k=1 ... 15) [MN.sub.l] = fixed effect of the month of birth (l = 1 ... 12)

[(MN * AN).sub.m] = fixed effect of the interaction between the month of birth and the year of birth (m = 1 ... 86)

[(H * AN).sub.n] = fixed effect of the interaction between the herd and the year of birth (n = 1 ... 46)

[(H * MN).sub.o]= fixed effect of the interaction between the herd and the month of birth (o = 1 ... 68)

[(H * MN * AN).sub.P] = fixed effect of the interaction between the herd, the month of birth and the year of birth (p = 1 ... 41)

[(H * G).sub.q] = fixed effect of the interaction between the herd and the genotype (q = 1.... 13) [e.sub.ijklmnopq] = experimental error.

An analysis of simple linear regression was conducted to determine the effect of allelic substitution on each of the study variables. For this, the genotype was converted to a quantitative scale 0, 1 and 2 for (negative/negative), (positive/ negative) and (positive/positive), respectively.

The linear regression model used was the following:

[Y.sub.i] = [[beta].sub.0]+[[beta].sub.1][X.sub.i]+[e.sub.i]

Where:

[Y.sub.i] = value of the dependent variable (age at first service, age at first birth, age at first postpartum service and age at second birth) depending on the number of + alleles

[[beta].sub.0] = intercept

[[beta].sub.1] = coefficient of linear regression estimated for allele replacement (+)

[X.sub.i] = number of + alleles in individual i. (0, 1, 2)

[e.sub.i] = experimental error.

RESULTS

Determination of genotype and allele frequencies of the gene for the growth hormone (BGH). A 329pb fragment was amplified from the DNA of 408 animals. The analysis of the restriction fragments using the MspI enzyme originated two restriction patterns; 329 pb, corresponding to the (negative) allele and 224 and 105 pb, corresponding to the (positive) allele. Allele frequencies (positive) and (negative) were 0.91 and 0.09, respectively. The genotype frequencies were 0.77, 0.2 and 0.03 for (positive/positive), (positive/negative) and (negative/negative), respectively.

Descriptive analysis. The average age at first service was 589 [+ or -] 91.17 days. For the age at first birth an average of 911 [+ or -] 126.2 days was obtained, for the first postpartum service 1013 [+ or -] 142.57 days, and for the second birth 1314 [+ or -] 138.01 days was obtained. All characteristics showed a relatively low Coefficient of Variation (CV), with the age at first service having the highest value (15.4%) (Table 1). However, these values are too high with respect to the reproductive goals that efficient milk production systems should have (1). Descriptive statistics for all characteristics are summarized in table 1.

Effect of genotype on the age of reproductive events. The genotype had a highly significant effect (p [less than or equal to] 0.01) on age at first service; the model showed a coefficient of determination of 0.88; indicating that the herd, year of birth, month of birth, interaction between the month and year of birth, between the herd and year of birth, herd and month of birth, and interaction between the herd, month and year of birth, explained an 88% variation of the characteristic. The Tukey analysis, which was performed subsequently, showed that heifers with the (negative/negative) genotype took 69 days more for their first service than heifers with the (positive/positive) genotype. Likewise, (positive/negative) individuals were delayed 13 days more than (positive/positive) individuals. Animals with the (negative/negative) genotype had a lower performance because they had their first service at later ages. These results are presented in table 2.

The genotype had a highly significant effect (p [less than or equal to] 0.01) on age at first birth and first postpartum service; the model showed a coefficient of determination of 0.81 and 0.83 respectively, indicating that the effects included in the model explained the 81% variation in age at first birth and 83% variation in age at first postpartum service. The Tukey analysis, subsequently carried out, showed significant differences (p [less than or equal to] 0.05), denoting the (negative/negative) genotype as the least favorable, as it showed the later age for both characteristics. The analysis of means for the (positive/positive) and (positive/negative) genotypes showed no significant differences (p>0.05, Table 2).

The genotype had a highly significant effect (p [less than or equal to] 0.01) on age at second birth; the model showed a coefficient of determination of 0.79, indicating that the effects included in the model explained the 79% variation of this characteristic. The Tukey analysis showed significant differences (p [less than or equal to] 0.05) among the means, denoting the (negative/negative) genotype as the least favorable for age at second birth, with an average of more days. The analysis of means of the (positive/positive) and (negative/positive) genotypes showed no significant differences (p>0.05, Table 2).

Effect of allelic replacement of BGH gene polymorphism on the ages at which some reproductive events occur. For the age at first service, a regression coefficient ([beta]) of -20.3 was found, indicating that for each (positive) allele that the individual bears, the age at first service decreases by 20 days; age at first birth had a regression coefficient ([beta]) of -11.67, ie, for each (positive) allele, the age at first birth decreases by 11 days. For the age at first postpartum service the [beta] coefficient was -8.5, indicating that for each (positive) allele, the age decreases by 8 days, and the [beta] for the age at second birth was -15.83 indicating that for each (positive) allele, the age at second birth decreases by 15 days. Regression coefficients for each of the characteristics are shown in table 3.

The estimated regression coefficients for age at first and second birth were highly significant (p<0.01). The regression coefficient for age at first birth was significant (p<0.05). For age at first postpartum service, the regression coefficient was not statistically significant (p>0.05).

DISCUSSION

Genotypic and allelic frequencies obtained in this study agree with those reported by Gorbani et al (15), who, in a population of 183 Holsteins, found frequencies of 0.787, 0.191 and 0.022 for (positive/positive), (positive/negative) and (negative/negative) genotypes, respectively, and 0.883 and 0.117 for (positive) and (negative) alleles respectively.

Mullen et al (16) found an association between three of six polymorphisms located in the first exon (5' region) of the GH gene. These newly found SNP were associated with pregnancy rate and first service; however, no association with the age at which the event occurs were performed. Reports generated by Katalin et al (17) mentioned that polymorphism recognized by the AluI enzyme in the exon 5 region position 127, and designated L and V alleles, is not associated with the age at first birth in Holstein cows.

The age at first breeding in heifers is an important parameter of reproductive efficiency; reducing the rearing period and rapid entry to the breeding program generates a higher economic return; a later age, the result obtained in this research, reflects low reproductive efficiency in the herd (1, 2).

The age at first birth is another important factor in the productive life of the animal. Advanced ages at which this event occurs impact lesser milk production and increased feed intake, resulting, therefore, in a higher initial cost of breeding (18). Establishing the age around which heifers are giving birth evaluates the growth rate from birth to the time they contribute milk or calves to the system and return the rearing investment. The age at first birth in this study was also high and therefore should be the subject of work by both farmers and researchers.

The (negative/negative) genotype was less favorable, as it delays the age at first service, as well as the age at first birth, postpartum service and second birth. Although the low frequency of the (negative/negative) genotype may indicate some limitation when performing association analysis, the intron 3 polymorphism of the BGH showed significant results for all characteristics.

The greatest effect of genotype polymorphism of the BGH was on age at first service. For each (positive) allele, the first service occurred 20 days before. This effect decreased age at first birth by 11 days and for age at second birth by 15 days. The decrease in each of these parameters is important for the herd's breeding performance, resulting in a longer productive life (19, 20). Thus, association of BHG polymorphism can be used to help select animals that tend to enter reproductive stages earlier, decreasing economic losses generated in the breeding of animals to maturity (21).

The finding that the positive/positive genotype influences the age at first service, reducing the rearing period, may indicate a lower age at second birth and increased productive life of these carrier animals. Early entry to breeding programs generates greater economic performance and lower feed intake which results in lower breeding costs. This information, in productive and reproductive terms, is an important contribution to breeding programs (1).

In conclusion this is a pioneering study on the association of intron 3 polymorphisms of the BGH with reproductive characteristics of dairy cows. The results suggest that the intron 3 polymorphism of the BGH is associated with age at first service, first birth, first postpartum service and second birth by facilitating the selection of individuals with favorable genotypes for use in breeding programs.

We found that the positive/positive genotype is optimal for reducing age at first service, first birth, first postpartum service and second birth; the genotype's greatest effect being on age at first service.

Due to the low frequency of the negative/ negative genotype; increasing the sample size is recommended for future studies and to achieve greater reliability in the results.

INTRODUCCION

En los hatos lecheros especializados, la eficiencia reproductiva tiene una influencia directa sobre la productividad. Sin un desempeno reproductivo eficiente, la produccion de leche es afectada fuertemente y por tanto, la rentabilidad economica del hato. La fertilidad de la vaca se encuentra afectada por muchos factores, la edad a la pubertad del animal tiene una influencia muy fuerte y es trascendental debido a que las edades elevadas al inicio de la reproduccion y al primer parto se reflejan en una baja eficiencia reproductiva (1).

El retraso en la edad de servicio o parto de cada vaca, o aun, cada vaca descartada por infertilidad, afecta el rendimiento economico del hato. Cuando una novilla se demora en entrar al programa reproductivo o una vaca se demora en retornar al celo despues del parto, se generan gastos por el periodo adicional no lactante y el alargamiento del intervalo generacional (1, 2). En contraste, la reduccion del periodo de levante de las novillas y un crecimiento rapido, que las acerque en menor tiempo a la etapa reproductiva, produce como resultado mas partos y mas produccion durante su vida. Por tanto es esencial considerar los factores que influyen sobre el conjunto de estos parametros. El gen de la hormona del crecimiento bovino (BGH) presenta polimorfismos que influyen de manera diferente estas caracteristicas (2) y juegan un papel clave en la regulacion del crecimiento y el desarrollo; influyendo de forma indirecta la eficiencia reproductiva del bovino (3-7).

Los efectos de la BGH sobre el crecimiento se observan en varios tejidos, incluyendo huesos, musculos y tejido adiposo. Estos efectos resultan tanto de la accion directa de la BGH en la particion de nutrientes y en la multiplicacion celular, como en la accion mediada por el factor de crecimiento insulinoide tipo 1, que estimula la proliferacion celular y los procesos metabolicos, asociados a la deposicion de proteinas (8). Ademas, se han reportado relaciones significativas entre las concentraciones de BGH, con el periodo postparto y consecuentemente con la fertilidad de la vaca (9, 10).

El interes principal del analisis de esta asociacion, viene dado por la determinacion de la influencia de las variantes geneticas de la hormona del crecimiento sobre el alcance de un estado reproductivo activo mas temprano. El objetivo de la investigacion fue determinar la asociacion del polimorfismo del intron 3 del gen de la hormona de crecimiento bovino (BGH), con las edades al primer servicio, primer parto, primer servicio posparto y segundo parto en una poblacion de vacas Holstein del departamento de Antioquia.

MATERIALES Y METODOS

Areas y poblacion en estudio. Se utilizaron 408 bovinos de la raza Holstein pertenecientes a 8 hatos lecheros ubicados en el tropico alto Antioqueno, zonas norte y oriental del departamento, en los municipios de San Pedro de los Milagros (altura 2475 msnm; con una temperatura (T[degrees]) de 14[degrees]C), Belmira (altura 2550 msnm; T[degrees] 14[degrees]C) y Medellin corregimiento Santa Elena (altura 2500 msnm; T[degrees] 17[degrees]C).

Extraccion de ADN y determinacion de las variantes genotipicas. Para la determinacion de las variantes genotipicas, se extrajo sangre de la vena coccigea y se realizo la extraccion del ADN, mediante la tecnica de salting out (11). Solo el ADN genomico con una pureza adecuada entre 1.8-2.0 se considero para los estudios a realizar.

Se sintetizaron los siguientes oligonucleotidos, de 20 pares de bases (pb) F 5' CCC ACG GGC AAG AAT GAG GC 3', R 5' TGA GGA ACT GCA GGG GCC CA 3', que permitieron amplificar el fragmento de 329 pb que presenta el sitio de restriccion para la endonucleasa MspI (12).

Se llevo a cabo una amplificacion mediante PCR para la region especifica, usando un volumen final de 25 [micro]l que contenia 2.5 [micro]l tampon PCR 10X (1.0-1.5 mM de Mg[Cl.sub.2], 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH de 8.3), 0.2 [micro]M de cebadores; 0.4 mM de cada dNTPs, 2 mM de Mg[Cl.sub.2], 1 unidad de Taq polimerasa y ~30-60 ng de ADN genomico.

La PCR se realizo en un termociclador (Biometra[R]). Las condiciones para la amplificacion de la region especifica del gen BGH fueron: la desnaturalizacion con calentamiento inicial durante cinco minutos a 94[degrees]C, seguido por 39 ciclos de desnaturalizacion a 94[degrees]C por 1 minuto, alineamiento de cebadores (anneling) a 55[degrees]C por 1 minuto, extension a 72[degrees]C por 1 min y un paso de extension final de 3 minutos a 72[degrees]C para terminar la reaccion (12). La temperatura de alineamiento utilizada se determino siguiendo la recomendacion de los distribuidores de los cebadores y mediante diferentes ensayos que arrojaron mayor eficiencia de alineamiento a la temperatura citada (55[degrees]C), (12). Como control positivo de todas las reacciones se realizo la amplificacion de muestras que fueron previamente evaluadas, y como control negativo reacciones en ausencia de ADN. Las variantes genotipicas fueron determinadas mediante la utilizacion de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), usando la enzima de restriccion MspI. Se uso un volumen final de 20 [micro]l que contenia 5 gl del producto de PCR, 2 [micro]l de tampon Tango 1X, 12.5 [micro]l de agua ultra pura, los cuales fueron sometidos a digestion por 5 unidades de enzima de restriccion MspI durante tres horas a 37[degrees]C. El producto resultante se observo por electroforesis en gel de agarosa al 2.5% (p/v) y tincion con bromuro de etidio. El patron de restriccion esperado para el genotipo (negativo/negativo) fue un fragmento de 329 pb, para el genotipo (positivo/negativo) tres fragmentos (329, 224 y 105 pb) y para el genotipo (positivo/positivo) dos fragmentos (224 pb y 105 pb).

Estimacion de las frecuencias alelicas. La frecuencia de los diferentes alelos se estimo determinando la proporcion de cada forma del gen entre el numero de copias totales de la poblacion en estudio. Se identificaron los homocigotos (dos copias del mismo alelo) y los heterocigotos (una copia de cada alelo), y se calculo la frecuencia (f) de cada alelo contando los homocigotos y anadiendo la mitad de los heterocigotos, con el metodo descrito por Hartl (13).

Analisis estadistico. Para determinar la asociacion de cada una de las caracteristicas con el genotipo para BGH, se llevo a cabo el ajuste de varios modelos lineales generalizados, basados en las fuentes de variacion conocidas para cada una de las variables dependientes (edad al primer servicio, edad al primer parto, edad al primer servicio postparto y edad al segundo parto). El analisis de medias de Tukey fue utilizado para determinar las diferencias entre las medias para cada uno de los niveles de los efectos fijos incluidos en los modelos. Se utilizo el paquete estadistico SAS v9.2., para todos los analisis (SAS Inst. Inc., Cary, NC), (14).

El modelo general de efectos fijos llevado a cabo fue el siguiente:

[Y.sub.ijklmnopq] = [mu] + [G.sub.i] + [H.sub.j] + [AN.sub.k] + [MN.sub.l] + [(MN * AN).sub.m] + [(H * AN).sub.n] + [(H * MN).sub.O] + [(H * MN * AN).sub.P] + [(H * G).sub.q] + [e.sub.ijklmnopq]

Donde:

[Y.sub.ijklmnopq] = edad al primer servicio, edad al primer parto, edad al primer servicio postparto o edad al segundo parto, del individuo X, portador del genotipo i, ubicado en el hato j, con ano de nacimiento k y mes de nacimiento l

[micro] = media para la caracteristica

[G.sub.i] = efecto fijo del Genotipo para BGH (i = 1...3)

[H.sub.j] = efecto fijo del hato (j = 1...8) [AN.sub.k] = efecto fijo del Ano de Nacimiento (k = 1...15)

[MN.sub.l] = efecto fijo del mes de Nacimiento (l = 1...12)

[(MN * AN).sub.m] = efecto fijo de la interaccion entre el mes de nacimiento y el ano de nacimiento(m = 1 ... 86)

[(H * AN).sub.n] = efecto fijo de la interaccion entre el hato y el ano de nacimiento (n = 1 ... 46)

[(H * MN).sub.o] = efecto fijo de la interaccion entre el hato y el mes de nacimiento (o = 1 ... 68)

[(H * MN * AN).sub.P] = efecto fijo de la interaccion entre el hato, el mes de nacimiento y el ano de nacimiento (p = 1 ... 41)

[(H * G).sub.q] = efecto fijo de la interaccion entre el hato y el genotipo (q = 1.... 13)

[e.sub.ijklmnopq] = error experimental.

Se realizo un analisis de regresion lineal simple, para determinar el efecto de sustitucion alelica con cada una de las variables en estudio. Para este fin, el genotipo se convirtio a una escala cuantitativa 0, 1 y 2 para (negativo/ negativo), (positivo/negativo) y (positivo/ positivo), respectivamente.

El modelo de regresion lineal utilizado fue el siguiente:

[Y.sub.i] = [[beta].sub.0]+[[beta].sub.1][X.sub.i]+[e.sub.i]

Donde:

[Y.sub.i] = valor de la variable dependiente (edad al primer servicio, edad al primer parto, edad al primer servicio postparto y edad al segundo parto) en funcion del numero de alelos +

[[beta].sub.0] = intercepto

[[beta].sub.1] = coeficiente de regresion lineal estimado para el alelo de sustitucion (+)

[X.sub.i] = numero de alelos + en el individuo i. (0, 1, 2)

[e.sub.i] = error experimental.

RESULTADOS

Determinacion de las frecuencias alelicas y genotipicas del gen de la hormona de crecimiento (BGH). Se amplifico un fragmento de 329 pb a partir del ADN de 408 animales. El analisis de los fragmentos de restriccion usando la enzima MspI, origino 2 patrones de restriccion; 329 pb, correspondiente al alelo (negativo) y 224 y 105 pb, correspondiente al alelo (positivo). Las frecuencias alelicas de (positivo) y (negativo) fueron de 0.91 y 0.09, respectivamente. Las frecuencias genotipicas fueron 0.77, 0.2 y 0.03 para (positivo/positivo), (positivo/negativo) y (negativo/negativo), respectivamente.

Analisis descriptivo. El promedio para la edad al primer servicio fue de 589 [+ or -] 91.17 dias. Para la edad al primer parto se obtuvo un promedio de 911 [+ or -] 126.2 dias, para el primer servicio postparto de 1013 [+ or -] 142.57 dias y para el segundo parto de 1314 [+ or -] 138.01 dias. Todas las caracteristicas mostraron unos Coeficientes de Variacion (CV) relativamente bajos, siendo la edad al primer servicio la que presento el valor mas elevado (15.4%) (Tabla 1). Sin embargo, estos valores son demasiado elevados con respecto a las metas reproductivas que deberian de tener los sistemas de produccion lechera eficientes (1). En la tabla 1 se resume la estadistica descriptiva para todas las caracteristicas.

Efecto del genotipo sobre las edades de los eventos reproductivos. El genotipo tuvo un efecto altamente significativo (p<0.01) sobre la edad al primer servicio; el modelo presento un coeficiente de determinacion de 0.88; indicando que el hato, el ano de nacimiento, mes de nacimiento, la interaccion entre el mes y ano de nacimiento, entre el hato y ano de nacimiento, hato y mes de nacimiento y la interaccion entre el hato el mes y el ano de nacimiento, explicaron en un 88% la variacion de la caracteristica. El analisis de medias de Tukey, que se realizo posteriormente, mostro como las novillas con genotipo (negativo/negativo) tardaron 69 dias mas para su primer servicio que las novillas con genotipo (positivo/positivo). De la misma forma, los individuos (positivo/negativo) se demoraron 13 dias mas que las (positivo/positivo). Los animales con genotipo (negativo/negativo) presentaron un menor rendimiento, ya que tuvieron su primer servicio a edades mas tardias Estos resultados son presentados en la tabla 2.

El genotipo tuvo un efecto altamente significativo (p<0.01) sobre la edad al primer parto y al primer servicio postparto; el modelo presento un coeficiente de determinacion de 0.81 y 0.83 respectivamente, indicando que los efectos incluidos en el modelo explicaron en el 81% la variacion en la edad al primer parto y en el 83% la variacion en la edad al primer servicio postparto. El analisis de medias de Tukey, llevado a cabo posteriormente, mostro diferencias significativas (p<0.05), denotando al genotipo (negativo/negativo) como el menos favorable, pues mostraba la edad mas tardia para ambas caracteristicas. El analisis de medias de los genotipos (positivo/positivo) y (positivo/ negativo) no mostro diferencias significativas (p>0.05, Tabla 2).

El genotipo tuvo un efecto altamente significativo (p<0.01) sobre la edad al segundo parto; el modelo mostro un coeficiente de determinacion de 0.79, indicando que los efectos incluidos en el modelo explicaron en el 79% la variacion de esta caracteristica. El analisis de medias de Tukey mostro diferencias significativas (p<0.05) entre las medias, denotando al genotipo (negativo/ negativo) como el menos favorable para la edad al segundo parto, con un promedio de dias mayor. El analisis de medias de los genotipos (positivo/ positivo) y (negativo/positivo) no mostraron diferencias significativas (p>0.05, Tabla 2).

Efecto de sustitucion alelica del polimorfismo del gen BGH sobre las edades a las cuales se presentan algunos eventos reproductivos. Para la edad al primer servicio se encontro un coeficiente de regresion ([beta]) de -20.3, indicando que por cada alelo (positivo) que porte el individuo, la edad al primer servicio disminuye en 20 dias; la edad al primer parto tuvo un coeficiente de regresion ([beta]) de -11.67, es decir, por cada alelo (positivo) la edad al primer parto disminuye en 11 dias. Para la edad al primer servicio postparto el coeficiente [beta] fue de -8.5, indicando que por cada alelo (positivo) la edad disminuye en 8 dias, y el [beta] para la edad al segundo parto fue de -15.83 indicando que por cada alelo (positivo) la edad al segundo parto disminuye en 15 dias. Los coeficientes de regresion para cada una de las caracteristicas son mostrados en la tabla 3.

Los coeficientes de regresion estimados para la edad al primer servicio y segundo parto, fueron altamente significativos (p<0.01). El coeficiente de regresion para la edad al primer parto fue significativo (p<0.05) y para la edad al primer servicio postparto no fue estadisticamente significativo (p>0.05).

DISCUSION

Las frecuencias genotipicas y alelicas obtenidas en el presente trabajo coinciden con las reportadas por Gorbani et al (15), quienes en una poblacion de 183 animales de raza Holstein, encontraron frecuencias de 0.787, 0.191 y 0.022 para los genotipos (positivo/positivo), (positivo/negativo) y (negativo/negativo) respectivamente, y 0.883 y 0.117 para los alelos (positivo) y (negativo) respectivamente.

Mullen et al (16), encontraron asociacion entre tres de seis polimorfismos, situados en el primer exon (region 5 ') del gen GH. Estos nuevos SNP encontrados, se asociaron con la tasa de prenez al primer servicio; sin embargo, no se realizaron asociaciones con la edad a la cual ocurre dicho evento. Reportes generados por Katalin et al (17) mencionan que el polimorfismo reconocido por la enzima AluI de la region del exon 5 posicion 127, y con alelos designados L y V, no estan asociados con la edad al primer parto en vacas Holstein.

La edad al primer servicio en las novillas es un importante parametro de eficiencia reproductiva; la reduccion del periodo de levante y una entrada rapida al programa de reproduccion genera mayor rendimiento economico; una edad tardia, resultado obtenido en esta investigacion, refleja una baja eficiencia reproductiva en el hato (1, 2).

La edad al primer parto es otro factor importante en la vida productiva del animal. Edades avanzadas en las que ocurre este evento repercuten en una menor produccion lactea y en un mayor consumo de alimento, derivando, por tanto, en un mayor costo inicial de crianza (18). Establecer la edad alrededor de la cual las novillas estan pariendo evalua la velocidad de crecimiento desde el nacimiento hasta el momento en que pueden aportar leche o terneros al sistema para retornar la inversion de su levante. La edad al primer parto en este estudio fue tambien alta y por ende, deberia ser materia de trabajo por parte de los productores e investigadores.

El genotipo (negativo/negativo) fue el menos favorable, pues retrasa la edad al primer servicio, asi como tambien la edad al primer parto, al servicio postparto y al segundo parto. Aunque la baja frecuencia del genotipo (negativo/ negativo), puede significar una cierta limitacion al realizar analisis de asociacion, el polimorfismo del intron 3 de la BGH mostro resultados significativos para todas las caracteristicas.

El mayor efecto del genotipo del polimorfismo de la BGH se presento sobre la edad al primer servicio. Por cada alelo (positivo), el primer servicio se presento 20 dias antes. Este efecto disminuyo en la edad al primer parto en 11 dias y para la edad al segundo parto en 15 dias. La disminucion en cada uno de estos parametros es importante en el desempeno reproductivo del hato, dando como resultado una vida util productiva mas prolongada (19, 20). Es asi como la asociacion del polimorfismo de la BHG puede utilizarse como ayuda para seleccionar animales que tiendan a entrar a etapas reproductivas tempranas disminuyendo perdidas economicas que se generan en la cria de los animales hasta la madurez (21).

El hallazgo de que el genotipo positivo/positivo tiene influencia sobre la edad al primer servicio repercute en la reduccion del periodo de levante, lo que podria indicar menor edad al segundo parto y una mayor vida productiva de estos animales portadores. La entrada temprana a los programas de reproduccion genera mayor rendimiento economico y menor consumo de alimento que se deriva en un menor costo de crianza, por lo que esta informacion, en terminos productivos y reproductivos, es un aporte importante para los programas de seleccion (1).

En conclusion este es un estudio pionero en la asociacion de los polimorfismos del intron 3 del gen BGH con caracteristicas reproductivas en vacas lecheras. Los resultados sugieren que el polimorfismo del intron 3 de la BGH esta asociado con las edades al primer servicio, primer parto, primer servicio posparto y segundo parto facilitando la seleccion de individuos con genotipos favorables para su utilizacion en programas de mejoramiento genetico.

Se encontro que el genotipo positivo/positivo es el optimo para la disminucion de la edad al primer servicio, primer parto, primer servicio postparto y segundo parto; teniendo el genotipo mayor efecto en la edad al primer servicio.

Debido a la baja frecuencia del genotipo negativo/ negativo; se recomienda aumentar el tamano de la muestra para futuros estudios y conseguir mayor confiabilidad en los resultados.

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Juliana Arango G, * M.Sc, Julian Echeverri Z, Ph.D, Albeiro Lopez H, Ph.D.

Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Produccion Animal, Grupo BIOGEM, Sede Medellin, AA 1779, Colombia. * Correspondencia: jarangog@unal.edu.co.

Received: November 2013; Accepted: March 2014.
Table 1. Mean, standard deviation (SD) and coefficient of
variation (CV) for the age at first service, age at first birth,
age at first postpartum service and age at second birth in
Holstein cows in the state of Antioquia.

Characteristic                            N    Mean    SD     CV%

Age at first service (days)              433   589    91.1    15.4
Age at first birth (days)                448   911    126.2   13.8
Age at first postpartum service (days)   391   1013   142.5   14.0
Age at second birth (days)               453   1314   138.0   10.5

Table 2. Tukey analysis for age at first service, first birth,
first postpartum service and second birth in Holstein cows in the
state of Antioquia.

Genotype       Age at      Age at    Age at first     Age at
               first       first      postpartum      second
              service      birth       service        birth
               (days)      (days)       (days)        (days)

(positive/   577.4 (a)   905.0 (a)    998.2 (a)     1304.6 (a)
positive)

(positive/   590.3 (b)   905.3 (a)    1000.1 (a)    1305.8 (a)
negative)

(negative/   646.3 (c)   967.3 (b)    1040.4 (b)    1375.3 (b)
negative)

Different letters in the same column indicate significant
differences.

Table 3. Regression Analysis for characteristics: age at first
service, first birth, first postpartum service and second birth.

   Characteristic      Intercept (I)     Beta      Standard
                                       ([beta])   Error [beta]

Age at first service      617.21        -20.3         3.09
(days) (p<0.01)

Age at first birth        927.37        -11.67        4.4
(days) (p<0.01)

Age at first              1015.05        -8.5         4.9
postpartum service
(days) (p<0.05)

Age at second birth       1335.04       -15.83        5.2
(days) (p>0.05)
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Title Annotation:ORIGINAL
Author:Arango, Juliana G.; Echeverri, Julian Z.; Lopez, Albeiro H.
Publication:Revista MVZ (Medicina Veterinaria y Zootecnia)
Date:Sep 1, 2014
Words:6857
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