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Assessment of Modulatory and Cytotoxic Activity of the Essential Oil in Hyptis Martiusii Benth Leaves/Avaliacao da atividade moduladora e citotoxica do oleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth/Evaluacion de la actividad moduladora y citotoxica del aceite esencial de las hojas de Hyptis martiusii Benth.

Introducao

A resistencia de bacterias contra farmacos e considerada um problema de saude publica mundial. Isso levou a necessidade de estudos se voltarem para essa area e que com isso surgissem propostas de iniciativas de controle. Bacterias que tem se destacado por se tornarem resistentes sao Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. A especie Staphylococcus aureus e uma bacteria do grupo dos cocos gram-positivos, tem forma esferica e, geralmente sao encontradas na pele e nas fossas nasais de pessoas desprovidas de qualquer doenca. Contudo, ela pode causar desde infeccoes simples, como espinhas e furunculos, ate infeccoes mais graves, como pneumonia, meningite, endocardite, dentre outras. A Escherichia coli pertence ao grupo das gram-negativas e uma das principais bacterias responsaveis por doencas infecciosas, pois produz enterotoxinas e onde ate se sabe tem participacao efetiva em diarreias (1-6).

Ja a bacteria Pseudomonas aeruginosa e um microorganismo patogenico nosocomical, pertencente a familia das gram-negativas, causadora de infeccoes que podem se desenvolver em todo o corpo humano, sendo mais patogenica em pacientes que apresentam um quadro imunologico comprometido. A principal caracteristica dessa bacteria, comum as outras especies, e a capacidade de persistir em longos periodos em ambientes adversos e de desenvolver uma resistencia a agentes antimicrobianos (7).

Existe um grande interesse na descoberta de compostos biologicamente ativos isolados de plantas no tratamento de doencas causadas por microrganismos. Isso se da a grande preocupacao existente no combate aos microrganismos, principalmente bacterias que tem a capacidade de mudar seu material genetico e tornar-se resistente a todos os antibioticos que ja foram descobertos e hoje sao eficazes (8, 9).

Com isso, os pesquisadores buscam atraves de pesquisas em laboratorio novos farmacos que tenham papel antibacteriano. Essas pesquisas se voltam para as plantas medicinais, pois elas apresentam varios compostos, dentre eles os oleos essenciais. Esses sao compostos volateis formados por varios constituintes quimicos, na sua maioria terpenos e fenilpropenos. Os oleos essenciais trazem caracteristicas fundamentais para os generos e/ou para as especies das plantas. Alem disso, exercem funcoes indispensaveis a sobrevivencia vegetal. Particularmente, a atividade antimicrobiana de oleos essenciais de vegetais tem formado a base de muitas aplicacoes, incluindo a utilizacao em produtos farmaceuticos, dentre outros (10-12).

Hyptis martiusii Benth. conhecida popularmente como "Cidreira do campo" e uma das especies atualmente utilizadas para a extracao de oleo essencial para pesquisas em laboratorio. Pertencente a familia Lamiaceae o genero Hyptis e formada por cerca de 400 especies. Varias pesquisas relatam que outras especies do genero Hyptis possuem varias atividades biologicas, dentre elas atividades citotoxicas e inseticidas. Alem disso, tambem sao relatadas atividades anti-septica, antifungica, antiinflamatoria, antibacteriana, dentre outras (13-15).

Com isso, o presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade moduladora do oleo essencial das folhas frescas de Hyptis martiusii Benth em associacao com diferentes antibioticos frente as bacterias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, como tambem avaliar a atividade citotoxica da especie.

Materiais e metodos

Material botanico: o material vegetal foi coletado no mes de marco de 2014, no Sitio Barreiro Grande no municipio de Crato-CE, Brasil, nas coordenadas 7[degrees]21'50"S de latitude e 39028'39"W de longitude, altitude: 930m acima do nivel do mar, em area de Cerrado da Chapada do Araripe. Foi preparada uma exsicata contendo o material botanico onde em seguida foi identificado e depositado no Herbario Caririense Dardano de Andrade Lima (hcdal) da Universidade Regional do Cariri (URCA), sob numero de registro 10.185.

Obtencao do Oleo essencial: o oleo essencial de Hyptis martiusii Benth (OEHM) foi extraido no Laboratorio de Pesquisa de Produtos Naturais (lppn), da Universidade Regional do Cariri (urca) entre os meses de marco a abril de 2014. A extracao do oleo foi realizada utilizando-se 250 g das folhas frescas que foram colocadas em um balao de vidro de 5 L, juntamente com 1,5 L de agua e mantidas em ebulicao durante um periodo de duas horas. Apos o periodo de ebulicao o oleo essencial fora extraido do vegetal e condensou-se formando uma mistura heterogenea com a agua. A mistura constituida de agua e oleo foi coletada em aparelho tipo Clevenger modificado sendo em seguida separada, seca com sulfato de sodio anidro (Na2SO4) e filtrada. O rendimento final foi de 0,72%.

Material bacteriano: foram usadas as cepas bacterianas de Staphylococcus aureus (SA-ATCC25923 e SA358), Escherichia coli (ATCC-CE10536 e CE27) e Pseudomonas aeruginosa (PA-ATCC15442 e PA03). Todas as estirpes foram mantidas em condicoes ideais de armazenamento, foram deixadas em agar infusao de coracao inclina (hia, Difco Laboratories Ltda). Antes do experimento, as celulas foram cultivadas por 24 horas em 37[degrees]C em infusao de cerebro coracao (BHI, Difco Laboratories Ltda).

Farmacos: As solucoes de drogas antibacterianas foram preparadas de acordo com as indicacoes do fabricante (Sigma Aldrich, EUA). Para os testes prepararam-se solucoes de 5000 [micro]L/mL com os antibacterianos. Os antibioticos adotados foram: amicacina, gentamicina, ciprofloxacino e imipenem.

Atividade Antimicrobiana: a concentracao inibitoria minima (CIM) foi calculado por caldo como meio de ensaio usando uma inoculacao de 100 microlitros de cada estirpe bacteriana, suspendido em caldo bhi em uma concentracao de [10.sup.5] UFC/mL em 96 placas de microdiluicao bem como diluicoes seriais. Para cada poco, foi adicionado 100 microlitros da solucao teste com concentracoes finais variando entre 512-8 g/mL. Antibioticos padroes foram usados como um controle (amicacina, gentamicina, imipinem e ciprofloxacino), cuja concentracao final variou entre 2500 e 2,4 g/mL. As placas foram incubadas a 35[degrees] C 24h antes para leituras calorimetricas realizadas com resazurina. CIM's foram registradas como as menores concentracoes para inibicao do crescimento (16).

Modulacao: o oleo foi testado em uma concentracao sub-inibitoria (cim/8 [micro]g) com 100 microlitros de uma solucao contendo bhi a 10%, solucao de teste e suspensao bacteriana. 100 microlitros de solucao antibiotica foram adicionados (na proporcao de 1:1) ate o penultimo. As concentracoes dos antibioticos variaram entre 2.500 e 2,44 ug/mL. As placas foram incubadas a 37[degrees] C por 24 h, apos o qual, colorimetricas leituras foram feitas utilizando resazurina. Testes foram realizados em triplicata.

O sinergismo foi caracterizado por uma diminuicao da cim dos antibioticos enquanto o antagonismo foi definido como o aumento da cim, conforme o metodo proposto por Coutinho e colaboradores (17).

Teste de citotoxicidade: os ensaios citotoxicidade foram realizados in vitro utilizando a cultura de linhagem de celulas do tecido conectivo de camundongo (NCTC) clone 929 (fibroblastos de mamiferos atcc ccl-1), cultivada em Minimal Essential Medium (Sigma). O meio de cultura foi suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) inativada por calor (10%), penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL). As culturas foram mantidas a 37[degrees] C em atmosfera umida com 5% de CO2. A viabilidade destas linhagens foi avaliada atraves do uso da resazurina como metodo colorimetrico (18).

Fibroblastos NCTC929 foram plaqueados em placas de microdiluicao de 96 cavidades a uma concentracao final de 3 x 104 celulas/cavidade. As celulas foram cultivadas a 37[degrees] C em atmosfera com 5% de CO2. Apos isso, o meio de cultura foi removido e os compostos foram adicionados a 200 [micro]L, sendo realizado um novo cultivo por 24 h. Apos esta incubacao, 20 [micro]L de uma solucao de resazurina 2 mM foi adicionada em cada cavidade. As placas foram incubadas por 3h e a reducao da resazurina foi determinada atraves de dupla absorbancia nos comprimentos de onda de 490 e 595 nm. O valor do controle (branco) foi subtraido. Cada concentracao foi testada em triplicata (18).

Fibroblastos NCTC929 foram plaqueados em placas de microdiluicao de 96 cavidades a uma concentracao final de 3 x [10.sup.4] celulas/cavidade. As celulas foram cultivadas a 37[degrees] C em atmosfera com 5% de C[O.sub.2]. Apos isso, o meio de cultura foi removido e os compostos foram adicionados a 200 [micro]L, sendo realizado um novo cultivo por 24 h. Apos esta incubacao, 20 ^L de uma solucao de resazurina 2 mM foi adicionada em cada cavidade. As placas foram incubadas por 3h e a reducao da resazurina foi determinada atraves de dupla absorbancia nos comprimentos de onda de 490 e 595 nm. O valor do controle (branco) foi subtraido. Cada concentracao foi testada em triplicata (17).

Analise estatistica: A significancia estatistica foi avaliada pelo teste Anova de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni post hoc (onde p < 0,001 foi considerado significativo). A [LC.sub.50] (Concentracao Letal Media) foi determinada atraves do calculo realizado pelo software Probitos Tsk version 1.5.

Resultados

Os resultados referentes a atividade antibacteriana do Oleo Essencial de Hyptis martiusii Benth.--OEHM--sao mostrados na figura 1 e na tabela 1. O OEHM exibiu uma cim de > 1024 [micro]g/mL contra estirpes de bacterias multirresistentes e padrao (um valor cim de < 256 ^g/mL foi considerado clinicamente relevante).

Ao investigar a atividade moduladora, observou-se que quando se associou o OEHM com o antibiotico amicacina houve um efeito antagonico contra as tres bacterias utilizadas no teste, Staphylococcus aureus (SA358), Escherichia coli (EC27) e Pseudomonas aeruginosa (PA03), em 50%, 75% e 50%, respectivamente. Da mesma forma o efeito antagonico foi observado em associacao com o antibiotico Gentamicina, onde ocorreu uma reducao no numero de morte das bacterias EC27 em 50%. Por outro lado, nao foi observado significancia dessa associacao frente a SA358, como tambem a PA03. Quando o OEHM foi combinado com imipenem, diferentemente dos resultados anteriores, apresentou sinergismo frente as cepas de EC27 e PA03 diminuindo em 60% e 50%, respectivamente, a cim. Entretanto, frente a cepa de SA358 a associacao do OEHM com o imipenem mostrou efeito antagonico aumentando em 80% a cim. O OEHM tambem foi associado com o antibiotico ciprofloxacino, onde nao mostrou significancia em relacao ao controle.

Na analise citotoxica, a [LC.sub.50] apresentou um valor de 263,12 [micro]g/ml. Com isso, sugere que doses iguais ou superiores a esta, apresentam um potencial efeito citotoxico frente aos fibroblastos de mamiferos ATCC CCL-1.

Discussao

Extratos e oleos de plantas da familia Lamiaceae sao descritos na literatura por possuir atividade antimicrobiana, com destaque para os generos Mentha e o Origanum com propriedades frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (19-21).

Varios estudos com especies do genero Hyptis sao conhecidos demonstrando a capacidade inibitoria sobre o crescimento bacteriano. As especies Hyptis pectinata (L.) Poit, Hyptis ovalifolia Benth, Hyptis passerina Mart. ex Benth. e Hyptis brevipes Poit. sao alguns exemplos (22-26).

Segundo Falcao e Menezes (27) essa atividade antibacteriana e atribuida a variada constituicao quimica do genero Hyptis. A atividade antimicrobiana da especie H. passerina e justificada pela presenca de [beta]-epi-acorenol, espatulenol, [beta]-cariofileno; oxido de cariofileno. A atividade da Hyptis platanifolia e justificada pela presenca de [alpha]-farneseno e [alpha]-bisaboleno, no oleo essencial extraido de suas folhas. H. suaveolens Poit. apresentam como constituintes principais os terpenos, dentre eles sabineno, a-terpinoleno, 1,8cineol, [beta]-cariofileno, substancias estas com atividade antibacteriana. Por fim a atividade da H. fruticosa Salzm. ex Benth. e justificada atraves dos contituintes marjoritarios biciclogermacreno, 1,8-cineol, [alpha]-pineno e [beta]-cariofileno (25-30).

O genero Hyptis e composto basicamente de monoterpenos e sesquiterpenos, corroborando com resultados de Araujo e colaboradores que identificou no oleo essencial de Hyptis martiusii (OEHM) terpenos, dentre outros constituintes, bem como Oliveira e colaboradores que expressou em seu estudo a presenca de 1,8 cineol e o [delta]-3-careno, componentes majoritarios com atividade contra bacterias resistentes. Onde Coutinho e colaboradores e Araujo e colaboradores afirmam que a principal atividade evidenciada na especie Hyptis martiusii e a antimicrobiana e que essa caracteristica se deve a existencia de diterpenos (31-32).

Toscan afirmou em seu estudo que os oleos essenciais que apresentam terpenos, atuam na celula microbiana, provocando alteracoes na membrana celular, levando a perda de varios componentes celulares, ocasionando, assim, a morte da celula. Alem disso, esse estudo atribuiu essa desestruturacao da membrana as caracteristicas lipofilicas dos terpenos, logo as potencializacoes observadas no trabalho possivelmente estejam relacionadas as interacoes quimicas dos constituintes do oleo com os antibioticos. Da mesma forma, as atividades antagonicas observadas se devem a essas provaveis interacoes. No entanto, novos estudos devem ser realizados para elucidar quais interacoes e, assim, possivelmente, explicar o sinergismo e antagonismo sobre os farmacos (33).

A atividade citotoxica de algumas especies do genero Hyptis ja foi identificada em alguns estudos, dentre essas especies as principais que apresentaram atividade citotoxica foram a H. carpitata, H.martiussi Benth, H. mutabilis, H. pectinata, H. spicigera (34-35).

Alem disso, varios compostos ja foram identificados nessas especies, entre eles lignanas citotoxicas (36).

Com isso, a atividade citotoxica observada no OEHM, atraves da [LC.sub.50] se deve, possivelmente, a relacao desta especie com outras do mesmo genero, ja que existem estudos que mostram a existencia desta atividade citotoxica no genero Hyptis. Alem disso, pode-se associar essa atividade a existencia de triterpenos com atividade citotoxica na especie H. martiussi Benth, bem como outros compostos.

As folhas de Hyptis martiusii mostraram ser uma via alternativa na busca de compostos que potencializam a acao de alguns antibioticos. O estudo revelou que a especie H. martiusii apresenta baixa atividade sinergica associada a antibioticos contra os tres tipos de bacterias analisadas e apresenta atividade citotoxica.

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Francisco Rodolpho Sobreira Dantas Nobrega de Figueiredo, MSc [1]; Ana Jaqueline Bitu Primo, Acad. [1]; Alefe Brito Monteiro, MSc [1]; Saulo Relison Tintino, BSc [1]; Gyllyandeson de Araujo Delmondes, BSc [1]; Valterlucio dos Santos Sales, MSc [1]; Cristina Kelly de Souza Rodrigues, MSc [1]; Cicero Francisco Bezerra Felipe, PhD [2]; Henrique Douglas Melo Coutinho, PhD [1]; Marta Regina Kerntopf, PhD * [1]

Recibido: 8 de octubre del 2016 / Aprobado: 1 de septiembre del 2017

Doi: http://dx.doi.org/10.12804/revistas.urosario.edu.co/revsalud/a.6489

[1] Departamento de Quimica Biologica, Universidade Regional do Cariri (URCA).

[2] Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal da Paraiba--(UFPB).

* Autora responsable de la correspondencia: martareginakerntopfm@outlook.com

Caption: Figura 1. Atividade moduladora da associacao do Oleo Essencial de Hyptis martiusii--OEHM--com os antibioticos (amicacina, gentamicina, imipenem, ciprofloxacino)
Tabela 1. Porcentagem das medias geometricas da associacao do
OEHM com os antibioticos (amicacina, gentamicina
imipenem, ciprofloxacino)

                        E. coli EC27    P. aeruginosa PA03

OEHM + Amicacina            75 **              50 **
OEHM + Gentaminina          50 **               ns
OEHM + Imipenem             60 *               50 *
OEHM + Ciprofloxacino        ns                 Ns

                        S. aureas SA358

OEHM + Amicacina             50 **
OEHM + Gentaminina            ns
OEHM + Imipenem              80 **
OEHM + Ciprofloxacino         Ns

(*) Sinergismo; (**) Antagonismo; (ns) Sem significancia.
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Title Annotation:ARTICULOS DE INVESTIGACION CLINICA O EXPERIMENTAL
Author:de Figueiredo, Francisco Rodolpho Sobreira Dantas Nobrega; Primo, Ana Jaqueline Bitu; Monteiro, Alef
Publication:Revista Ciencias de la Salud
Date:Jan 1, 2018
Words:3428
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