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Aspectos imunoistoquimicos da hepatite infecciosa canina.

A hepatite infecciosa canina (HIC) e uma doenca viral de caes e de outras especies das familias Canidae e Ursidae, causada por adenovirus canino 1 (CAV-l), pertencente a familia Adenoviridae (GREENE, 2006). CAV-1 tem afinidade por celulas endoteliais e celulas hepaticas, esta presente em tecidos e em fluidos corporais e e excretado pela urina (HODGMAN & LARIN, 1953). A HIC frequentemente tem curso clinico superagudo ou agudo e afeta principalmente caes jovens nao-vacinados. Apos localizacao oronasal, CAV1 replica inicialmente nas tonsilas, passa aos linfonodos regionais e atinge o sangue pelo ducto toracico. A viremia dura de quatro a oito dias, mas o virus e liberado na urina por periodos mais longos. Os sinais clinicos incluem anorexia, apatia, vomito, dor abdominal e diarreia com ou sem sangue (GREENE, 2006). Em alguns casos ha sinais neurologicos como incoordenacao, convulsoes, vocalizacao e letargia (CAUDELL et al., 2005). A ictericia e incomum ou rara na HIC aguda (INKELMANN et al., 2007), mas pode ser encontrada em alguns caes que sobrevivem a fase fulminante da doenca (GREENE, 2006). As lesoes macroscopicas incluem petequias e equimoses disseminadas, liquido serossanguinolento na cavidade abdominal com fibrina, figado aumentado, com aspecto moteado e recoberto por pelicula de fibrina. As tonsilas estao aumentadas e avermelhadas, e os linfonodos edematosos e hemorragicos. Frequentemente ha edema da parede da vesicula biliar e hemorragias podem ser observadas no encefalo ao nivel do talamo, do mesencefalo, do tronco encefalico e do cerebelo (INKELMANN et al., 2007). As alteracoes histologicas incluem necrose hepatica centrolobular a panlobular, associadas a inclusoes intranucleares basofilicas caracteristicas, que aparecem inicialmente em celulas de Kupffer e apos em hepatocitos viaveis ou degenerados adjacentes a areas de necrose (GREENE, 2006).

Rotineiramente o diagnostico de HIC e feito pela associacao entre sinais clinicos, lesoes macro e microscopicas, porem, outros metodos sao utilizados para confirmar a presenca do CAV-1 nos tecidos, como, por exemplo, a imunoistoquimica (IHQ), a tecnica reacao em cadeia da polimerase (PCR) e o isolamento viral (CHOUINARD et al., 1998; CAUDELL et al., 2005). O metodo imunoistoquimico utiliza anticorpos especificos para deteccao da quantidade, da distribuicao tecidual e da localizacao celular dos epitopos imunogenicos em seccoes histologicas (HAINES & WEST, 2005).

O objetivo deste estudo foi detectar o antigeno de CAV-1 em tecidos de caes acometidos por HIC, procurando associar esses achados ao curso clinico da doenca. Em estudo retrospectivo anterior (INKELMANN et al., 2007), a doenca foi diagnosticada em 62 caes necropsiados em nosso laboratorio. Em apenas 27 desses casos havia tecidos armazenados em blocos de parafina. Esses 27 casos compuseram os animais deste estudo.

A marcacao IHQ foi realizada em seccoes histologicas de 3[micron]m. Para bloqueio da peroxidase endogena, as laminas foram incubadas com peroxido de hidrogenio a 3% em metanol. Na recuperacao antigenica, foi utilizada a enzima Proteinase K (Dako--cod. S3020)a por cinco minutos. O anticorpo monoclonal para CAV-1 (VRMD, cod. 2E10-H2) (b) a uma diluicao de 1:100 foi incubado por uma hora, a 37[grados]C em camara umida. O anticorpo secundario biotinilado e o complexo estreptavidina-peroxidase (LSAB--DakoCytomation, cod. K0690)(a) foram incubados consecutivamente por 30 minutos a temperatura ambiente. Tetracloreto de 3-3' diaminobenzidina (DAB, Sigma, cod. D-5637)(c) foi usado como cromogeno. A contracoloracao foi realizada pela hematoxilina de Harris e a montagem entre lamina e laminula, com meio sintetico. Quanto ao numero de celulas positivas, a imunomarcacao, nos orgaos examinados, foi classificada como leve, quando algumas poucas celulas foram marcadas; como moderada, quando uma quantidade media (entre 30 e 60%) das celulas foi marcada e acentuada, quando grande quantidade de celulas foi marcada (Tabela 1). A imunomarcacao ocorria em intensidades variaveis no nucleo e no citoplasma de celulas endoteliais, hepatocitos e celulas de Kupffer. A marcacao podia preencher todo o nucleo ou ocorrer ao redor de inclusoes com centros nao-marcados (Figura 1A). No citoplasma a marcacao tinha aspecto finamente granular em hepatocitos e difuso em celulas endoteliais e de Kupffer (Figura 1B); no entanto, algumas inclusoes virais nao foram marcadas. Esse ultimo achado foi observado no figado de caes com HIC em outros estudos imunoistoquimicos (RAKICH et al., 1986, CHOUINARD et al., 1998). Isso se deve ao fato de a inclusao ser formada nao so por particulas virais, mas tambem por proteinas que dao origem a uma matriz amorfa presente em quantidades variaveis e que e antigenicamente distinta do virus (GIVAN & JEZEQUEL, 1969; RAKICH et al., 1986). Nos casos que apresentaram necrose hepatica acentuada, a marcacao ocorreu em hepatocitos e em celulas de Kupffer viaveis e tambem nas areas de necrose (Figura 1C). No rim (Figura 1D), celulas endoteliais dos tufos glomerulares apresentando marcacao acentuada. Marcacao em numerosas celulas reticuloendoteliais foi observada em linfonodos, no baco (Figura 1E) e na medula ossea. O antigeno foi detectado no endotelio de vasos do encefalo (Figura 1F), principalmente em filhotes de ate um ano de idade, nao-vacinados, e que morreram de forma hiperaguda ou aguda. A marcacao imunoistoquimica em celulas endoteliais de varios orgaos confirma a predilecao de CAV-1 por celulas endoteliais e explica as lesoes hemorragicas encontradas na doenca espontanea (INKELMANN et al., 2007). Neste estudo, os casos com curso clinico superagudo ou agudo apresentaram maior intensidade de imunomarcacao (moderada ou acentuada). Achado semelhante foi relatado em outro estudo imunoistoquimico no encefalo de filhotes de caes com HIC (CAUDELL et al., 2005). Ja os casos estudados que apresentaram imunomarcacao leve tiveram curso clinico mais longo.

A imunoistoquimica e eficaz na demonstracao da distribuicao do antigeno viral em tecidos de caes com HIC. A imunomarcacao do CAV-1 nos diversos tecidos demonstra a disseminacao do virus pelo organismo, principalmente afetando as celulas endoteliais. A correlacao entre a intensidade de imunomarcacao e o tempo de evolucao clinica demonstrou grande quantidade de antigeno viral nos casos hiperagudos e agudos.

[FIGURA 1 OMITIR]

FONTES DE AQUISICAO

(a) DakoCytomation, Carpinteria, California, Estados Unidos.

(b) VRMD, Inc., Pullman, Estados Unidos.

(c) Sigma, Saint Louis, Missouri, Estados Unidos.

Recebido para publicacao 27.12-07 Aprovado em 02.07.08

REFERENCIAS

CAUDELL, D. et al. Diagnosis of infectious canine hepatitis virus (CAV-1) infection in puppies with encephalopathy.

Journal Veterinary Diagnostic Investigation, v.17, p.58-61, 2005.

CHOUINARD, L. et al. Use of polymerase chain reaction and immunohistochemistry for detection of canine adenovirus type 1 in formalin-fixed, paraffin-embedded liver of dogs with chronic hepatitis or cirrhosis. Journal Veterinary Diagnostic Investigation, v.10, p.320-325, 1998.

GIVAN, K.F.; JEZEQUEL, A. Infectious canine hepatitis: a virologic and ultrastructural study. Laboratory Investigation, v.20, p.36-45, 1969.

GREENE, C.E. Infectious canine hepatitis and canine acidophil cell hepatitis. In: --. Infectious disease of the dog and cat. 3.ed. Philadelphia: Saunders-Elsevier, 2006. Cap.8, p.41-47.

HAINES D.M.; WEST K.H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.108, p.151-156, 2005.

HODGMAN, S.F.J.; LARIN, N.M. Diagnosis of canine virus hepatitis (Rubarth's disease). Veterinary Record, v.65, p.447-450, 1953.

INKELMANN M.A. et. al. Hepatite infecciosa canina: 62 casos. Pesquisa Veterinaria Brasileira, v.27, p.325-332, 2007.

RAKICH, P.M. et al. Immunohistochemical detection of canine adenovirus in paraffin sections of liver. Veterinary Pathology, v.23, p.478-484, 1986.

Maria Andreia Inkelmann (I) Bruno Leite dos Anjos (I) Glaucia Denise Kommers (II) Rafael Almeida Fighera (II) Claudio Severo Lombardo de Barros (II)*

(I) Programa de Pos-graduacao em Medicina Veterinaria, area de concentracao em Patologia Veterinaria, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil.

(II) Laboratorio de Patologia Veterinaria, Departamento de Patologia, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil. E-mail: claudioslbarros@uol.com.br. *Autor para correspondencia.
Tabela 1--Intensidade de marcacao imunoistoquimica para antigeno de
adenovirus canino-1 (CAV-1) por orgao/sistema em 27 caes com
hepatite infecciosa canina.

                                   Orgaos

Caes             Ba (f)   Be (g)   SNC (h)   Co (i)   Est (j)   Fig (l)

1 (19d (b))(a)   nr (r)     nr        nr       nr        nr      + (s)
2 (7d)             +        nr        +      ++ (t)      nr       ++
3 (3d)             nr       nr        +        nr        nr       ++
4 (10d) +          nr       nr        nr       +          +       ++
5 (ND (c))         nr       nr        +        nr        nr       nr
6 (3d)             nr       nr        nr       nr        nr       +
7 (4d)             nr       ++        +        nr        nr       ++
8 (10d)            nr       nr        +        nr        ++       +
9 (ND)             -        nr        -        nr        nr       +
10 (MS (d))        -        nr        +        ++        +        -
11 (ND)            nr       nr        nr       +         nr       ++
12 (2d)            nr       nr        nr       nr        nr       -
13 (3d)            nr       nr        ++       nr        ++       ++
14 (18h (e))       nr       nr        ++       nr        nr       ++
15 (ND)            nr       nr        nr       nr        nr       +
16 (4d)            nr       nr        +        nr        nr       +
17 (2d)            +        nr       +++       ++        ++       ++
18 (3d)            nr       nr        nr       ++        ++       nr
19 (MS)            nr       nr        ++      +++        nr      +++
20 (6h)            +        ++        ++       ++        ++       ++
21 (6h)            +        nr        nr       ++        +        nr
22 (MS)            nr       +         ++       nr        nr       +
23 (ND)           +++       nr        nr       +         nr       ++
24 (12h)           nr       ++        ++       nr        nr       ++
25 (12h)           ++       nr        ++       ++        nr       ++
26 (12h)           nr       nr        ++       nr        nr       ++
27 (5d)           nr        nr        ++      +++        nr      +++

                                      Orgaos

Caes             ID (m)    Linf (n)   MO (o)    Pul (p)    Rim

1 (19d (b))(a)     nr        nr         nr        nr       - (v)
2 (7d)             nr        +          nr        nr        +
3 (3d)           +++ (u)     +          nr        nr        +
4 (10d) +          +         nr         +         +         +
5 (ND (c))         nr        nr         nr        +         nr
6 (3d)             nr        nr         nr        nr        -
7 (4d)             ++        nr         nr        ++        +
8 (10d)            ++        ++         nr        ++        +
9 (ND)             nr        nr         nr        +         +
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11 (ND)            nr        nr         nr        +         +
12 (2d)            +         nr         nr        +
13 (3d)            nr        nr         nr        ++        ++
14 (18h (e))       ++        nr         nr        +         +
15 (ND)            nr        nr         nr        nr        nr
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19 (MS)            nr        nr         +         nr        nr
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                 Orgaos

Caes             To (q)

1 (19d (b))(a)     nr
2 (7d)             nr
3 (3d)             ++
4 (10d) +
5 (ND (c))         nr
6 (3d)             nr
7 (4d)             nr
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9 (ND)             nr
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11 (ND)            nr
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25 (12h)           nr
26 (12h)           nr
27 (5d)            nr

(a) Evolucao clinica, (b) dias, (c) nao-determinado, (d) morte subita,
(e) horas, (f) baco, (g) bexiga, (h) sistema nervoso central,
(i) coracao, (j) estomago, (l) figado, (m) intestino delgado, (n)
linfonodo, (o) medula ossea, (p) pulmao, (q) tonsila, (r)
nao-realizado, (s) leve, (t) moderado, (u) acentuado, (v) negativo.
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Author:Inkelmann, Maria Andreia; Leite dos Anjos, Bruno; Kommers, Glaucia Denise; Almeida Fighera, Rafael;
Publication:Ciencia Rural
Date:Dec 1, 2008
Words:1926
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