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Asociacion entre la perdida del cromosoma x en mujeres de edad avanzada y el polimorfismo de la apolipoproteina A-IV:360 GLN/HIS.

ASSOCIATION OF CHROMOSOME X LOSS IN ELDERLY WOMEN WITH APOLIPOPROTEIN A-IV:360 POLYMORPHISM

RESUMEN: La perdida del cromosoma X en mujeres, asociada a la edad avanzada, es un fenomeno ya reconocido hace decadas. Los factores geneticos que llevan a esta perdida o a la no-disyuncion cromosomica, son poco conocidos. Polimorfismos de apolipoproteinas fueron asociados a la ocurrencia de sindromes cromosomicos como las trisomias del 18 y 21 y fue sugerida su participacion en la segregacion cromosomica. Polimorfismos de la apolipoproteina AIV:360 fueron asociados a molestias cardiovasculares en la poblacion brasilena. Veinticuatro mujeres entre 72 a 87 anos, fueron seleccionadas para estudiar la presencia o ausencia del alelo 2 (HIS) y analizar la perdida del cromosoma X. El analisis citogenetico fue realizado en nucleos interfasicos de cultivos de linfocitos por tecnica de hibridacion in situ con sonda fluorescente centromerica del cromosoma X. El analisis genotipico fue realizado a partir de ADN extraido de la sangre, amplificado por PCR y digerido por la enzima de restriccion Fnu4HI. Se observo una proporcion significantemente mayor de celulas con la perdida del cromosoma X, en mujeres con alelo 2 (HIS). Estos resultados indican la participacion del gen de la ApoA-IV en la no-disyuncion cromosomica. Los mecanismos de su actuacion pueden estar relacionados a danos oxidativos producto de alteraciones en la microcirculacion e induccion de muerte celular. La comprension de este mecanismo todavia necesita de mayor investigacion.

PALABRAS CLAVE: 1. Polimorfismo de la APOA-IV: 360 GLN/HIS; 2. Perdida del cromosoma X; 3. Citogenetica.

SUMMARY: Chromosome X loss associated with advancing age in women is well stablished in cytogenetics. However, genetic factors involved in this chromosome loss or no disjunction are poorly understood. Apolipoproteins have been associated with chromosome syndromes, such as Trisomy 21 and 18 and their participation in chromosome segregation have been suggested. Apolipoprotein AIV:360 polymorphism has been associated with cardiovascular diseases, in our population. Twenty four old women, aged 72 to 87 years old selected according to the presence or absence of allele 2 (HIS) were investigated in relation to chromosome X loss. Cytogenetic analysis was performed in interphase lymphocyte nuclei by means of FISH (Fluorescence In Situ Hibridization) using X centromeric DNA probe. DNA was isolated from blood cells amplified by PCR and digested with Fnu4HI. A higher significant proportion of cells with X chromosome loss was observed in elderly women with allele 2 (HIS). These results indicate the participation of apolipoprotein AIV:360 polymorphism in chromosome segregation. The involved mechanisms could be related to oxidative damage related to microcirculation abnormalities and cell death. The biological role of apolipoprotein A-IV on chromosome segregation needs to be further investigated.

KEY WORDS: 1.A.IV.360 polymorphism; 2. Chromosome X lose; 3. Citogenetics.

INTRODUCCION

La perdida cromosomica relacionada a la vejez esta bien establecida en citogenetica hace varias decadas y fue inicialmente descrita por Jacobs et al. (1961). Se confirmo, posteriormente, que en mujeres de edad ocurria perdida preferencial del cromosoma X (Jacobs et al., 1963; Ford & Russel, 1985). Diversos trabajos confirman esta perdida asociada a la edad avanzada, incluyendose el de Kormann-Bortolotto et al. (1993), realizado en nuestro laboratorio.

La introduccion de tecnicas de hibridacion in situ con sondas de ADN fluorescentes (HSH) de cromosomas X y de Y en cinco mujeres y cinco hombres revelo la exclusion significativamente elevada de estos cromosomas, en micronucleos de individuos con mas de 70 anos (Guttenbach et al., 1994). Estas observaciones fueron confirmadas en nucleos interfasicos de 38 mujeres por Hando et al. (1994), en 12 mujeres por Catalan et al. (2000) y en 90 mujeres y 138 hombres con edades entre 1 semana y 93 anos, por Guttenbach et al. (1995).

El analisis citogenetico de nucleos interfasicos de mujeres y hombres, por FISH, mostro que en mujeres centenarias la perdida del cromosoma X ocurria en 22% de las celulas, en tanto que en las jovenes, en 1,7%. En los hombres centenarios la perdida del cromosoma Y ocurria en 10% de las celulas y en los jovenes en 1,6% (Bukvic et al., 2001).

Los factores geneticos que llevan a alteraciones en la segregacion cromosomica, sorprendentemente son poco conocidos. La perdida del cromosoma X puede ser el resultado de diversos mecanismos celulares, como alteraciones en el centromero, en los microtubulos del huso, en la produccion de tubulina y en la microcirculacion que puede llevar a danos oxidativos en la celula (Guttenbach et al., 1994, 1995; Geller & Potter, 1999).

Genes de apolipoproteinas fueron destacados como factores geneticos responsables de alteraciones en la segregacion cromosomica, en virtud de que determinados polimorfismos se presentan significantemente mas prevalentes en progenitores de individuos com sindromes cromosomicos.

En un estudio de madres de 188 individuos con sindrome de Down, se observo en madres jovenes de individuos con el sindrome que presentaron errores de la meiosis II, la frecuencia del alelo E4 de la apolipoproteina E fue 30% mayor que el encontrado en madres mas viejas (p=0.03), sugiriendo que el alelo E4 es un factor de riesgo para la no-disyuncion en la meiosis II en madres jovenes. Los autores sugieren que los portadores de este alelo presentan un elevado nivel de colesterol y, consecuentemente, alteraciones cardiovasculares y aterosclerosis, que por medio de la microvascularizacion local podria llevar a una deficiencia de oxigeno en el foliculo. La ApoE es producida en varios organos, inclusive en el ovario y la no-disyuncion podria ser tambien explicada por la union de sus isoformas con las proteinas asociadas al microtubulo. El papel biologico de la ApoE en la segregacion cromosomica todavia precisa ser aclarado (Avramopoulos et al., 1996).

El estudio de Ezquerra et al. (1998) observo aun mayor frecuencia del alelo E4, en madres de individuos con Sindrome de Down resultantes de errores en la meiosis I en lugar de la meiosis II.

El estudio de alelos de la ApoE en 56 individuos con trisomias 13, 18 y 21 mostro una mayor frecuencia del alelo E4 solamente en los individuos con trisomias 13 y 18. Los autores sugieren que el papel de la ApoE en la induccion de aneuploidias, pueda ser por alteraciones en la microcirculacion, actividad alelo-especifica relacionada a la apoptosis o dano oxidativo (Nagy et al. 2000).

En individuos con el mal de Alzheimer se observo aumento significativo de celulas trisomicas 21, en individuos con mutaciones en los genes de las pre-senilinas 1 y 2, responsables de la enfermedad, porque permiten el excesivo deposito da proteina beta-amiloide en el cerebro de los afectados, con consecuente muerte neuronal (Geller & Potter). Los autores sugieren tambien la participacion de estos genes en la alteracion del proceso de division celular, que tiene como consecuencia la apoptosis de las celulas neuronales de los afectados. Otras explicaciones como la localizacion de las pre-senilinas en el nucleo y en la membrana celular y su relacion con la proteina p53, fueron sugeridas. La participacion de estos genes en la nodisyuncion cromosomica fue confirmada en madres de individuos con sindrome de Down que presentaron errores en la meiosis II (Petersen et al., 2000). Estos autores apuntan hacia la localizacion nuclear de las pre-senilinas, en centromeros y cinetocoros, estructuras que participan de la regulacion y division celulares como responsables de la no-disyuncion.

El gen de la apopoliproteina AIV (APO-IV) participa del metabolismo de los lipidos y puede ser la clave para el entendimiento de la susceptibilidad o la resistencia a aterogenesis y longevidad. A pesar del hecho que la funcion precisa de la apoAIV no es bien conocida, esta proteina participa de la absorcion de alimentos ricos en grasas. (Ordovas et al., 1989; Weinberg et al., 1990), del transporte de triacilglicerol (Otha et al., 1985), del transporte reverso de colesterol y de la modulacion de la actividad de muchas enzimas (Duverger etal., 1996).

Esta proteina es sintetizada primariamente en los enterocitos del intestino delgado durante la absorcion de grasas y es secretado hacia la linfa. En el plasma, la mayor parte de la apoA-IV es encontrada como proteina libre y solamente una pequena porcion se une a los quilomicrones y a las lipoproteinas de alta densidad (HDL) (Weinberg & Spector, 1985).

La secuencia del ADN mostro que la substitucion del nucleotido G por T, convirtio glutamina en histidina en la posicion 360 de la proteina madura, siendo considerados respectivamente alelol (GLN) y alelo 2 (HIS) (Lohse et al., 1990).

Fue sugerido que la ApoAIV podria ejercer un efecto protector contra la aterosclerosis por la inhibicion de la peroxidacion de lipidos del LDL (Qin et al., 1998).

Con relacion a la APOA-IV:360, no existen todavia relatos de investigacion de la asociacion entre estos polimorfismos, segregacion cromosomica y sindromes cromosomicos. El presente trabajo investiga la asociacion de los polimorfismos de este gen, en 24 mujeres del Estudio Longitudinal del Envejecimiento Brasileno. Fueron seleccionadas 12 mujeres con ausencia del alelo 2 (HIS) y 12 mujeres con presencia del alelo 2 (HIS).

MATERIAL Y METODO

Seleccion de individuos. El Estudio Longitudinal del Envejecimiento (Ramos et al., 1998) comenzo en 1991 e involucro a 1667 personas de mas de 60 anos que vivian en la comunidad de Sao Paulo, Brasil. Estos voluntarios fueron clinicamente evaluados cada dos anos. Ellos fueron comunicados sobre el protocolo de este estudio y otorgaron informaciones sobre sus condiciones medicas previas. Fueron realizados examenes fisicos y clinicos y fueron recolectadas muestras de sangre para procedimientos de laboratorio. El Comite de Etica en Investigacion de la UNIFESP aprobo este estudio y todos sus participantes aprueban este trabajo conforme la Declaracion de Helsinki.

La evaluacion clinica de las 24 mujeres de edad avanzada mostro, igualmente en los dos grupos, individuos sanos y sin alteraciones significativas.

Fueron seleccionadas 12 mujeres con genotipos APOA-IV:360:GLN/GLN o 1-1 (edad media de 78,4+5,11) y 12 con genotipos 360:HIS/HIS y 360:GLN/HIS o 2-2 y 12, respectivamente (edad media de 79,3+4,39). La baja frecuencia del alelo 2 (HIS) dificulto la obtencion de individuos con alelo 2 para esta muestra.

Cultivo de linfocitos: Los cultivos de linfocitos fueron realizados de acuerdo con la tecnica descrita por Moorhead et al. (1960), con modificaciones, en medio de cultivo RPMI, con 10% de suero bovino fetal y fitohemaglutinina.

FISH (hibridacion por fluorescencia in situ): La metodologia empleada para FISH fue realizada segun el protocolo descrito por Pinkel et al. (1986). El analisis del numero de senales fluorescentes del cromosoma X, fue realizado con la sonda centromerica LPE 0XG (Aquarius[TM] Probes--Cytocell) en nucleos interfasicos. La Fig. 1 muestra dos nucleos y una metafase con estos marcadores. Los grupos de mujeres con alelo 1 y alelo 2, fueron comparados en relacion al numero de celulas con 1 y con 3 o mas senales fluorescentes para evaluar la perdida y ganancia del cromosoma X, por el metodo del Chi-cuadrado.

[FIGURA 1 OMITIR]

Genotipage: El polimorfismo apoA-IV:360Gln/His fue analizado de acuerdo con los procedimientos descritos por Tenkanen (1989) y Hixson & Vernier (1991), con modificaciones. En resumen, una secuencia de 127bp conteniendo el local polimorfico fue amplificado por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando los primers HT3 (5'-CACCTGCTCCTGCTACTGCTCC-3') e HT5 (5'-CCTGAGGGACAAGGTCAACTC--3'). Cada reaccion contenia 500ng de ADN y buffer para PCR, MgCl, dNTPs y Taq ADN Polimerasa. La mezcla para la reaccion fue calentada, por 5 minutos, a 95[grados]C. Posteriormente, el ADN fue amplificado por 30 ciclos (62[grados]C por 30 segundos) extendido (72[grados]C por 1 minuto) y desnaturalizado (94[grados] por 40 s).

Despues de la amplificacion, el producto de la PCR fue digerido con la enzima de restriccion Fnu4HI, durante 3 h, a 37[grados]C. Los productos polimorficos de extension de los fragmentos de restriccion fueron analizados sobre un gel de acrilamida a 12.5%. Despues de la electroforesis, los geles fueron sometidos a coloracion con plata para la visualizacion de los fragmentos.

RESULTADOS

El grupo de mujeres con el alelo 2 mostro una proporcion significantemente mayor de celulas con perdida de senal del cromosoma X que el grupo con el alelo 1. Se analizaron por el metodo del Chi Quadrado (P>0.05) (Tabla I). Usando este mismo metodo (P>0.05), no fue observada diferencia significativa entre los dos grupos en cuanto al numero de celulas con tres o mas senales fluorescentes.

DISCUSION

Los resultados obtenidos muestran una proporcion mayor de celulas con perdida del cromosoma X, en las mujeres viejas portadoras del alelo 2, que las portadoras del alelo 1.

Variaciones en los patrones lipidicos y de las lipoproteinas, estan altamente relacionadas con enfermedades asociadas a la edad avanzada. Las anormalidades en el metabolismo de los acidos grasos estan relacionadas con la etiologia de muchas enfermedades asociadas a la vejez, como patologias cardiovasculares, diabetes y demencia.

Una investigacion del Estudio Brasileno Longitudinal del Envejecimiento, realizada en 383 personas de edad, en nuestro laboratorio, mostro la asociacion significativa del alelo 2 de la apolipoproteina A-IV con enfermedad cerebro vascular y ataque isquemico transitorio, (Ejchel et al., 2004).

Los polimorfismos de la apolipoproteina ApoA-IV, parecen determinar diferentes estructuras y funciones de la proteina, (Rader et al., 1993), asi la investigacion del impacto de cada isoforma en la explicacion de cada fenomeno o en la etiologia de cada enfermedad, puede ser extremamente relevante.

La asociacion de la apolipoproteina E y su variante E4, en madres de individuos con sindrome de Down, como en 56 conceptos con trisomias mostro su participacion en la segregacion cromosomica.

En la literatura no existen trabajos que den cuenta de variantes de la ApoA-IV en la no-disyuncion. Los mecanismos propuestos por los autores que observaron asociacion con Apo E y con las pre-senilinas, son mecanismos generales, resultantes de alteraciones en el metabolismo de los lipidos, como las alteraciones microvasculares con dano oxidativo subsiguiente, que tambien pueden explicar nuestros resultados en cuanto a la asociacion del alelo 2 de la ApoA-IV y la perdida del cromosoma X en mujeres viejas. La posibilidad de que estas isoformas de la ApoA-IV se relacionen con proteinas incluidas en procesos de division celular y segregacion cromosomica, puede tambien ser considerada.

El proceso de envejecimiento que lleva a la no-disyuncion o perdida del cromosoma X, en mujeres de edad avanzada ciertamente depende de la accion de multiples factores geneticos, cuyas funciones biologicas normales no estan todavia comprendidas. El conocimiento de estos genes, sus funciones y sus mecanismos de accion, podra prevenir danos celulares, alteraciones en la division celular, muerte celular, proporcionando mejor comprension forneciendo la prevencion, diagnostico, pronostico y terapia en las enfermedades asociadas a la vejez.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Direccion para correspondencia

Prof. Dra. Marilia de Arruda Cardoso Smith

Disciplina de Genetica, Departamento de Morfologia

Universidad Federal de Sao Paulo,

Escola Paulista de Medicina

Rua Botucatu, 740 CEP 04023-900 Sao Paulo, SP BRASIL

e-mail: macsmith.morf@epm.br

Recibido : 20-02-2004

Aceptado : 02-04-2004

*,** Tatiana Flank Ejchel; ** Lara Quirino Araujo; ** Luiz Roberto Ramos; ** Maisa Seabra Cendoroglo; * Rommel Rodriguez Burbano & * Marilia de Arruda Cardoso Smith

* Disciplina de Genetica, Departamento de Morfologia, Universidade Federal de Sao Paulo/Escola Paulista de Medicina; Sao Paulo, SE Brasil.

** Disciplina de Geriatria, Departamento de Clinica Medica, Universidade Federal de Sao Paulo/Escola Paulista de Medicina; Sao Paulo, SE Brasil. Financiado por la Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) y Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq).
Tabla 1. Numero de celulas con una senal fluorescente con sonda
centromerica del cromosoma X y total de celulas con relacion a
la presencia y ausencia del alelo 2.

                                     Ausencia del alelo 2

Alelo 1 (genotipos)      Edad (anos)       Senal 1    Total de celulas

        1-1                  85              28             342
        1-1                  87              33             375
        1-1                  86              30             276
        1-1                  80              26             239
        1-1                  75              32             289
        1-1                  77              30             263
        1-1                  77              48             400
        1-1                  73              28             229
        1-1                  72              23             183
        1-1                  75              28             217
        1-1                  79              35             241
        1-1                  75              51             350

Total                       392             3404

Promedio y DS         78,4 [+ o -] 5,11     11,5%

                                   Presencia del alelo 2

Alelo 2 (genotipos)      Edad (anos)       Senal 1    Total de celulas

        1-2                  74              25             341
        1-2                  82              18             237
        1-2                  86              23             277
        2-2                  77              32             314
        1-2                  77              29             252
        1-2                  79              27             207
        1-2                  75              65             457
        1-2                  87              42             276
        1-2                  76              55             345
        1-2                  77              62             355
        1-2                  84              54             308
        1-2                  77              39             222

       Total                                 471            3591

Promedio y DS         79,3 [+ o -] 4,39     13,1%
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Author:Flank Ejchel, Tatiana; Quirino Araujo, Lara; Ramos, Luiz Roberto; Seabra Cendoroglo, Maisa; Rodrigue
Publication:International Journal of Morphology
Date:Jun 1, 2004
Words:3920
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