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Antibodies anti-infectious bursal disease virus and viral genome detection in broilers and chickens backyard at Bahia's poultry production area/Anticorpos contra o virus da doenca infecciosa bursal e deteccao do genoma viral em criacoes de frango de corte e galinhas de quintal no polo avicola da Bahia.

INTRODUCAO

A Doenca Infecciosa Bursal (IBD) E uma doenca viral aguda, contagiosa, que afeta aves jovens com 3 a 6 semanas de idade (ASHRAF et al., 2007), causando grandes prejuizos para a industria avicola (ABDEL-ALIM et al., 2003). O virus da Doenca Infecciosa Bursal (IBDV) multiplica-se nos tecidos linfoides, com predilecao pela bursa de Fabricius, provocando destruicao das cElulas linfoides com consequente imunossupressao e aumento da suscetibilidade a outras doencas infecciosas (ELANKUMARAN et al., 2002; BANDA et al., 2003; AL-NATOUR et al., 2004; MORAES et al., 2005).

O IBDV pertence a familia Birnaviridae e genero Avibirnavirus (segundo ICTV 2011) e seu genoma consiste em dois segmentos de RNA de fita dupla (BANDA et al., 2003; ASHRAF et al., 2007). O virus E constituido de dois sorotipos distintos, denominados sorotipo 1 e sorotipo 2. O sorotipo 1 E patogenico para aves e sua virulencia E variavel, e o sorotipo 2 E apatogenico para aves, mas infecta galinhas e perus (BANDA et al., 2003). As mutacoes genEticas no genoma do IBDV resultaram em variantes antigenicas e patogenicas que continuam a causar a doenca em frangos de corte (JACKWOOD & SOMMER-WAGNER, 2005). A IBD esta presente em todas as areas produtoras de frango e tem causado perdas economicas para a avicultura industrial em todo o mundo. As perdas estao relacionadas com o aumento da mortalidade e da imunossupressao nas aves acometidas, resultando em queda da performance (KNEIPP, 2000).

A caracterizacao das cepas de campo do IBDV tem sido fundamental no desenvolvimento de medidas preventivas e campanhas epidemiolOgicas, tendo como objetivo controlar a propagacao do virus. Nos ultimos anos, o uso de tEcnicas moleculares como a RT-PCR (reacao em cadeia da polimerase) tem sido util na deteccao e genotipagem das diferentes cepas de IBDV presentes no campo (NOUEN et al., 2006).

A populacao constituida de aves que sao criadas para o consumo prOprio, conhecidas como galinhas de fundo de quintal, nao E beneficiada com o programa de biosseguridade, aplicado nas criacoes comerciais. O conhecimento da ocorrencia e distribuicao da Doenca Infecciosa Bursal em frangos de corte e em galinhas de quintal pode ter grande utilidade para indicar a necessidade de implantacao de medidas de prevencao e controle especificas. Uma vez que galinhas de quintal nao sao vacinadas e sao criadas prOximas as granjas de frango de corte, este trabalho tem por objetivo determinar a frequencia de anticorpos e detectar o virus em ambas as criacoes.

MATERIAL E METODOS

Sorologia

Foram coletadas 1078 amostras de soro, sendo 758 amostras de frangos de corte e 320 amostras de galinhas de quintal, provenientes de 13 municipios localizados no polo avicola da Bahia, no periodo de marco de 2009 a dezembro de 2010. O numero de amostras coletadas em cada municipio variou de acordo com o tamanho dos lotes de frango e das criacoes de galinhas.

As amostras foram agrupadas em duas regioes importantes do polo avicola da Bahia, que concentram granjas comerciais de corte e criacoes de subsistencia de galinhas. Em criacoes de galinhas de quintal, a regiao de Feira de Santana abrange amostras dos municipios de Conceicao da Feira, Feira de Santana e Sao Goncalo dos Campos, a regiao de Alagoinhas abrange amostras de Alagoinhas, Irara e Pedrao. Em criacoes de frango de corte, na regiao de Feira de Santana, estao contemplados os municipios de Cruz das Almas, Sao Goncalo dos Campos, Sapeacu, Feira de Santana, Conceicao da Feira, Cachoeira e Santo Antonio de Jesus e a regiao de Alagoinhas abrange os municipios de Alagoinhas, Entre Rios, Coracao de Maria e Olindina.

Em frango de corte, as amostras de sangue e a bursa foram coletadas em animais com idade de abate, selecionados aleatoriamente. As aves foram imunizadas com a vacina Cevac[R] Transmune IBD aos 18 dias de vida por injecao inovo. Para a coleta de amostras de galinhas de quintal, foram selecionadas aves jovens, previamente anilhadas para possibilitar posterior identificacao e coleta das bursas. As aves nao eram vacinadas. Tanto nas criacoes comercais quanto em criacoes alternativas, as aves nao apresentavam sintomatologia clinica da enfermidade.

Os ensaios sorolOgicos foram realizados no LaboratOrio de Sanidade Avicola da Bahia (LASAB)--UFBA. Os soros foram testados atravEs da tEcnica de ELISA Indireto utilizando o kit comercial FlockChek* IBD (LaboratOrio IDEXX[c]) e os procedimentos do teste foram conduzidos de acordo com instrucoes do fabricante. Os resultados do teste foram calculados e interpretados utilizando o programa xChe[R], em que as densidades Oticas (D.O.) de cada uma das amostras sao correlacionadas com os controles positivos e negativos da placa em que foram testadas, gerando um indice denominado razao S/P (sample/positive). A razao S/P determina o ponto de corte, ou seja, o valor de densidade Otica no teste que determina os soros positivos e negativos.

As analises estatisticas foram feitas atravEs do programa SPSS 13.0. Os dados foram analisados por meio do teste t de Student, considerando o intervalo de confianca de 95%.

Biologia molecular

Para deteccao do virus, foram coletadas 09 pools de bursas de Fabricius, sendo 06 pools de frango de corte e 03 pools de galinhas de quintal. Cada pool continha 10 bursas de aves selecionadas aleatoriamente em frango de corte. As aves criadas no sistema alternativo foram anilhadas no momento da coleta de sangue e somente as que tiveram titulos de anticorpos elevados na sorologia foram adquiridas para a realizacao da tEcnica de biologia molecular. Todas as bursas foram armazenadas a temperatura de -20[degrees]C no LASAB atE serem encaminhados para o JF LaboratOrio, onde foram processadas utilizando a tEcnica PCR/RFLP.

Inicialmente, as bursas foram maceradas em PBS (pH 7,4), com gral e pistilo e estocadas em glicerol. A extracao do RNA foi executada com o emprego de fenol-clorofOrmio, seguindo a metodologia de SAMBROOK et al. (1989). O RNA foi eluido em 35[micro]l. Para a PCR foram utilizados os primers5-GGC CCA GAG TCT ACA CCA TAA CTG-3'; 5-CCC GGA TTA TGT CTT TGAAGC C-3' (KIBENGE et al., 1990), especificos para a regiao variavel do VP2, amplificando 248pb (IKUTA et al., 2001).

A amplificacao foi realizada de acordo com MAJO et al. (2002), com as seguintes condicoes: desnaturacao a 94[degrees]C por 3', seguida de 40 ciclos de 40" a 94[degrees]C, 90" a 55[degrees]C e 60" a 72[degrees]C, a extensao final foi realizada a 72[degrees]C por 5'. Posteriormente, o produto do PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 2% e corado com brometo de etidio.

Para realizacao da RFLP, o produto da PCR foi digerido com as enzimas de restricao DraI, SacI, StyI, TaqI, BstNI e SspI (New England Biolabs Inc., Beverly, MA), de acordo com as instrucoes do fabricante. Os fragmentos digeridos foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5% e visualizados apOs coloracao pela silverstaining. Cepas variantes A, Bursine 2, variante E foram usadas como controle na tEcnica de RFLP (MAJO et al., 2002).

RESULTADOS E DISCUSSAO

O monitoramento sorolOgico de plantEis avicolas tem por objetivo analisar os niveis de imunidade materna, determinar imunocompetencia, avaliar e reajustar programas de vacinacao, diagnosticar surtos de doenca e avaliar a biosseguranca na granja (TESSARI et al., 2003). O ELISA E o teste sorolOgico rotineiramente utilizado para detectar anticorpos contra o IBDV, devido ao fato de permitir o processamento de grande numero de amostras simultaneamente (ASHRAF et al., 2006).

Os resultados obtidos na analise sorolOgica das 758 amostras de frango de corte, coletadas de aves em idade de abate estao demonstrados na tabela 1 e nas figuras 1 e 2. Do total das amostras de frangos de corte analisadas, 90,1% foram sorologicamente positivas. Nas regioes de Feira de Santana e Alagoinhas, os coeficientes de variacao (CV) foram de 54% e 70,8%, respectivamente.

O coeficiente de variacao E uma medida relativa de dispersao bastante utilizada para verificar a uniformidade da resposta humoral e avaliar a eficiencia de programas de vacinacao na avicultura. RISTOW (2004) classifica os programas de vacinacao de acordo com o CV em excelente (CV<30%), bom (CV entre 3050%), razoavel (CV entre 51-80%) e ruim (CV>80%). Podemos observar que, dentre as amostras de frangos de corte, nos 5 municipios estudados, nenhum teve CV excelente, 20% bom e 60% razoavel e 20% ruim. Coeficientes de variacao classificados como bons (3050%) demonstram que a imunizacao do lote foi bem sucedida por gerar titulos uniformes (OPENGART, 2003). Os dados obtidos neste trabalho demonstram que nao existe uniformidade nos titulos de anticorpos dos lotes comerciais e, portanto, que o programa de vacinacao nao conseguiu atingir a protecao esperada nos lotes avaliados.

Verificou-se tambEm grande disparidade na mEdia de titulos nos municipios analisados (Figura 1), com amostras apresentando titulos inferiores a 2500, valor considerado como limite para lotes vacinados, sugerindo que parte das aves nao estava protegida, podendo ter ocorrido falha na imunizacao. AlEm disso, varias amostras apresentaram titulos superiores a 8.000, sinalizando que deve estar havendo exposicao ao virus no campo (BOLIS et al., 2003). Como todos os lotes foram submetidos ao mesmo programa de vacinacao, a coleta foi feita em aves da mesma idade, essa disparidade nos titulos nao era esperada, uma vez que a mEdia de titulos de animais vacinados E de 7.000.

[FIGURE 1 OMITTED]

Nas criacoes de subsistencia, os dados obtidos tambEm sinalizaram que ha necessidade de maior atencao por parte das agencias de vigilancia epidemiolOgica, ja que a circulacao do virus em criacoes de fundo de quintal pode proporcionar o surgimento de cepas de maior patogenicidade. Os resultados da analise das amostras de soro de 320 aves criadas em sistema alternativo de criacao estao representados na tabela 2 e na figura 2. As aves nao eram vacinadas e nao apresentavam sintomatologia clinica. As duas regioes estudadas apresentaram animais com resultados positivos, com indices acima de 50%. Do total de 320 amostras, 79,7% foram positivas no ELISA. Observase que nas duas regioes foram obtidos elevados CV, que sugerem nao haver resposta imunolOgica uniforme nas aves frente a possiveis desafios, uma vez que essas aves nao sao vacinadas.

[FIGURE 2 OMITTED]

Estudo de prevalencia de anticorpos contra o IBDV realizado por SANTOS et al. (2008) em galinhas de quintal de 22 municipios no Rio Grande do Sul revelou positividade em 80,2% das amostras, demonstrando que o virus esta presente neste tipo de criacao. Altas taxas de amostras soropositivas tambEm foram encontradas em criacoes de subsistencia avaliadas por VOLK (2005), na Eslovenia e, por HERNANDEZ-DIVERS (2006), no Equador, que obtiveram em seus estudos 78% e 100% de positividade, respectivamente. A frequencia alta de amostras positivas contra o IBDV identificadas em criacoes de galinhas de quintal indica que o virus circula nessa populacao (TAN et al., 2004). A circulacao do virus no ambiente em criacoes alternativas pode ser considerada um risco a industria avicola, uma vez que os animais que estao localizados prOximos as granjas de empresas nao apresentam sintomatologia clinica e considerando a capacidade de disseminacao do virus (SANTOS et al., 2008).

A tEcnica de PCR/RFLP foi utilizada para identificacao e genotipagem do IBDV. Os resultados deste trabalho em frango de corte indicaram a presenca de padroes de restricao compativeis com cepas variantes brasileiras do grupo molecular G15 em 01 pool, e de cepas vacinais do grupo molecular G3 em 02 pools de frangos de corte vacinados. Em 03 pools enviados ao laboratOrio, nao houve amplificacao especifica de acido nucleico do IBDV da regiao do gene VP2. Ja na analise em criacoes de subsistencia, houve amplificacao especifica de acido nucleico do IBDV da regiao do gene VP2 na amostra da regiao de Alagoinhas. O grupo molecular G3 E classificado como um grupo de cepas vacinais e o grupo molecular G15 E classificado como grupo de variantes brasileiro com padroes nao vacinais e esta disseminado em todo o pais. Esses resultados demonstram a presenca do genoma viral em criacoes de frangos de corte e em criacoes de galinhas de quintal, localizadas no polo avicola da Bahia.

AlEm da proximidade entre as criacoes comerciais e de subsistencia, a presenca de vetores e reservatOrios do IBDV pode favorecer a disseminacao da doenca. Estudos anteriores tem sugerido que caes, aves selvagens, roedores e insetos podem ser importantes vetores do IBDV (HOWIE & THORSEN, 1981; MCALLISTERet al., 1995; OGAWA et al., 1998;PAGES-MANTE et al., 2004; PARK et al., 2010). A viabilidade do IBDV apOs passar pelo sistema digestivo de alguns animais foi demonstrada, sendo estes animais considerados portadores e/ou propagadores do IBDV (PAGES-MANTE et al., 2004; PARK et al., 2010).

Apesar do conhecimento do risco decorrente do surgimento de amostras virulentas e da possibilidade de transmissao para aves silvestres, que podem servir como reservatOrio do virus, a relevancia da enfermidade em criacao de galinhas de quintal nao esta bem definida (JEON et al., 2008).

CONCLUSAO

Neste estudo verificou-se a susceptibilidade das criacoes comerciais de frangos de corte a IBD, demonstradas nos testes sorolOgicos e na deteccao molecular, bem como foi identificado o risco da presenca do IBDV em criacoes de subsistencia. Este E o primeiro relato de deteccao genotipagem do IBDV em criacoes de subsistencia na Bahia. Os resultados obtidos reforcam a necessidade de monitoramento constante em ambos os tipos de criacao, visando a evitar as perdas relacionadas a essa importante enfermidade.

REFERENCIAS

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Priscila Sousa da Silva (I) * Tatiane Santana Sales (I) Izabella Ramos da Luz (II) Paulo CEsar Costa Maia (II) Lia Muniz BarrettoFernandes (III) Caroline de Oliveira Mendes (II)

(I) Programa de POs-graduacao em Ciencia Animal nos TrOpicos (PPG), Universidade Federal da Bahia (UFBA), 41720-010, Salvador, BA, Brasil. E-mail: estrelamaior@gmail.com. *Autor para correspondencia.

(II) LaboratOrio de Sanidade Avicola da Bahia (LASAB), UFBA, Salvador, BA, Brasil.

(III) Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva, UFBA, Salvador, BA, Brasil.

Recebido para publicacao 10.05.11 Aprovado em 26.02.12 Devolvido pelo autor 30.04.12 CR-5312
Tabela 1--Distribuicao dos titulos de anticorpos, coeficiente de
variacao, desvio-padrao e frequencia de anticorpos em frangos de
corte nas duas regioes estudadas.

                                Regiao de Feira de Santana

                                              Desvio-   Coeficiente de
                     Amostras     Min-Max     padrao     Variacao (%)

Conceicao da Feira     246        1-9.415     2032,1         61,7
Feira de Santana       136        1-6.399     1341,6         46,7
Sao Goncalo dos        160        1-8.498     1577,6         83,6
  Campos
Subtotal               542        1-9.415     1765,7         54,0

                                  Regiao de Alagoinhas

Alagoinhas             108      536-12.908    2727,5         60,7
Entre Rios             108        7-7.092     1886,0         71,8
Subtotal               216       7-12.908     2519,5         70,8
Total                  758       1-12.908     2011,9         60,0

Tabela 2--Distribuicao dos titulos de anticorpos, coeficiente de
variacao, desvio-padrao e frequencia de anticorpos em galinhas de
quintal nas duas regioes estudadas.

                      Regiao de Feira de Santana

                                          Desvio-
                   Amostras    Min-Max    padrao

Feira de Santana      30      407-7.024   1453,9
Sao Goncalo          139      48-9.370    1973,9
  dos Campos
Subtotal             169      48-9.370    1896,2

                        Regiao de Alagoinhas

Alagoinhas            40      93-4.845    1316,9
Irara                111       1-9.727    1937,2
Subtotal             151       1-9.727    1810,0
Total                320       1-9.727    1906,6

                    Regiao de Feira de Santana

                   Coeficiente      No aves
                        de         positivas
                   Variacao (%)       (%)

Feira de Santana       68,4        30 (100%)
Sao Goncalo            76,5       117 (84,2%)
  dos Campos
Subtotal               75,9        147 (87%)

                       Regiao de Alagoinhas

Alagoinhas            114,2         26 (65%)
Irara                 109,8        82 (73,9%)
Subtotal              112,9       108 (71,5%)
Total                  91,8       255 (79,7%)
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Author:da Silva, Priscila Sousa; Sales, Tatiane Santana; da Luz, Izabella Ramos; Maia, Paulo Cesar Costa; B
Publication:Ciencia Rural
Date:Jun 1, 2012
Words:3667
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