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Antibacterial activity of essential basil oil against serogroups of enteropathogenic Escherichia coli isolated from lettuce/ Atividade antibacteriana do oleo essencial do manjericao frente a sorogrupos de Escherichia coli enteropatogenica isolados de alfaces.

INTRODUCAO

O uso de plantas medicinais para o tratamento de doencas esta associado a medicina popular de diferentes partes do mundo. Entre os principais produtos de origem vegetal com atividade antimicrobiana estao os extratos e os oleos essenciais (SARTORATTO et al., 2004). Entre as plantas medicinais comumente usadas na medicina popular esta o manjericao (Ocimum basilicum Linn.), o qual pertence a familia Lamiaceae, possuindo especies originarias de regioes tropicais e subtropicais da Asia, da Africa e da America Central e do Sul (LABRA et al., 2004).

A composicao dos oleos essenciais extraidos das folhas e dos apices com inflorescencia do manjericao varia de acordo com a especie e a localizacao geografica, sendo classificados em quatro quimiotipos, de acordo com os componentes majoritarios do oleo: quimiotipo linalol-metil chavicol (Europeu), metil chavicol (Reuniao), metil cinamato (Tropical) e quimiotipo eugenol (Java). Em funcao de suas propriedades terapeuticas, o manjericao e amplamente utilizado na medicina popular como antiespasmodico, antitermico, auxiliando tambem na digestao e no combate de infeccoes bacterianas e parasitarias intestinais (TELCI et al., 2006).

A atividade antimicrobiana do oleo essencial do manjericao tem sido relatada como sendo predominantemente associada aos seus constituintes majoritarios, o metil chavicol e o linalol. O oleo essencial dessa planta tem sido utilizado nas industrias de alimentos como flavorizante para produtos de confeitaria, bebidas nao alcoolicas, sorvetes e como condimentos e na industria de cosmeticos (BOZIN et al., 2006).

O habito alimentar da populacao tem mudado consideravelmente, e o aumento no consumo de hortalicas in natura caracteriza essa mudanca. Nesse contexto, a alface (Lactuca sativa) esta entre as hortalicas folhosas mais consumidas no Brasil, sendo um dos componentes mais presentes nas saladas dos brasileiros. Seu cultivo e praticado de forma organica, livre de pesticidas ou agrotoxicos; hidroponica, em que as hortalicas ficam protegidas contra diversos fatores adversos do meio ambiente, como chuvas, geadas e ventos fortes, favorecendo a produtividade do produto; e convencional, com utilizacao de defensivos agricolas (SANTANA et al., 2006).

Segundo FERNANDES et al. (2002), as hortalicas, por serem consumidas in natura, tem sido consideradas como uma das principais veiculadores de microrganismos patogenicos de interesse em Saude Publica. Esses autores relatam ainda que as principais fontes de contaminacao de hortalicas sao a agua de irrigacao, que pode apresentar uma grande quantidade de contaminantes, como ovos de helmintos, cistos de protozoarios e coliformes de origem fecal, e o esterco animal, utilizado como adubo organico. Entre as principais especies de bacterias contaminantes de hortalicas esta a Escherichia coli, por apresentar linhagens patogenicas produtoras de toxinas, tais como: hemolisinas, enterotoxinas termolabeis (LT) e termoestaveis (ST) e Shiga-toxina e estar frequentemente associada a surtos de toxinfeccoes alimentares. E. coli enteropatogenicas (EPEC), apesar de nao produzirem Shiga ou verotoxinas, estao entre as linhagens de E. coli diarreiogenicas (KAPER et al., 2004).

Considerando-se a relevancia e atualidade do problema no Brasil e a crescente participacao das hortalicas na transmissao de E. coli enteropatogenicas, esta pesquisa teve por objetivo avaliar a atividade antibacteriana do oleo essencial do manjericao (Ocimum basilicum L.) frente a sorogrupos de E. coli enteropatogenica (EPEC) isolados de alfaces (Lactuca sativa) organicas e hidroponicas comercializadas em feiras livres e supermercados da cidade de Sao Luis, Maranhao (MA).

MATERIAL E METODOS

Coletas das amostras

Foram coletadas 100 amostras de alfaces (variedade crespa) cultivadas em sistemas organico e hidroponico e comercializadas em feiras livres e supermercados, respectivamente, localizados na cidade de Sao Luis/MA, no periodo de maio a julho de 2009. A escolha dessa hortalica se justifica pelo fato de estar entre as mais consumidas pela populacao maranhense. A opcao pelos sistemas de cultivo baseou-se no fato de fornecerem alimentos mais saudaveis, ou seja, livres de agrotoxicos e/ou pesticidas. Apos coletadas, as amostras foram acondicionadas em caixas isotermicas e transportadas ao Laboratorio de Microbiologia de Alimentos e Agua da Universidade Federal do Maranhao para a realizacao das analises pertinentes.

Isolamento e identificacao das cepas de Escherichia coli

Para o isolamento e a identificacao da E. coli, utilizou-se a tecnica descrita por KORNACKI & JOHNSON (2001). Para tanto, foram pesados assepticamente 25g de cada amostra, que foram incubados em 225mL de Caldo Infusao Cerebro Coracao (Caldo BHI) a 37[degrees]C, por tres horas. Apos o periodo de incubacao, foram acrescentados ao inoculo 250mL de Caldo Escherichia coli (Caldo E.C.), com posterior incubacao a 37[degrees]C, por 24 horas. O plaqueamento seletivo foi realizado nos Agares Eosina Azul de Metileno (EMB) e MacConkey Sorbitol. Apos a incubacao, as colonias tipicas de E. coli foram submetidas a identificacao bioquimica utilizando-se o Sistema API-20E (bioMerieux).

Identificacao sorologica das cepas de Escherichia coli

Para a identificacao sorologica de E. coli enteropatogenicas (EPEC), foram utilizados soros polivalentes e monovalentes (Probac do Brasil[R]) contendo anticorpos para a identificacao de antigenos somaticos O, a saber: soro polivalente A contendo anticorpos, para a identificacao dos sorogrupos monovalentes: O26, O55, O111 e O119; polivalente B, para identificar os monovalentes: 114, O125, O142 e O158; e polivalente C, para os monovalentes: O86, O126, O127 e O128, segundo metodologia descrita por MENG et al. (2001). Para a realizacao dos testes sorologicos, 1mL de agua esteril foi adicionado as culturas de 24 horas para a obtencao de uma suspensao. Em seguida, foram retiradas aliquotas de 0,1mL das respectivas suspensoes e adicionadas a superficie de uma lamina de vidro limpa e seca. Primeiramente, as cepas de E. coli foram testadas para os soros polivalentes A, B e C para E. coli EPEC classica e em seguida para os soros monovalentes, de acordo com a classificacao obtida nos soros polivalentes. A prova sorologica positiva consistiu da aglutinacao do soro apos a sua adicao na suspensao da cultura bacteriana em estudo.

Extracao do oleo essencial

Para a extracao do oleo essencial do manjericao, foram utilizadas as folhas da planta. A extracao foi realizada pelo processo de hidrodestilacao usando-se o extrator de Clevenger, segundo metodologia descrita por MATOS (1997).

Analise cromatografica

Para a identificacao dos constituintes do oleo essencial do manjericao, utilizou-se a tecnica de Cromatografia a Gas acoplada a Espectrometria de Massas (CG/MS) nas seguintes condicoes: Equipamento: CG\EM, modelo QP--5000, fabricado pela Shimadzu; Metodo: OE_1.met; Amostras: inicialmente pesou-se 1,0mg de cada amostra e dissolveu-se em 1000[micro]L de diclorometano (pureza 99,9%); Volume injetado: 0,3[micro]L; Coluna: Capilar, 30mx0,25mmx0,25gm. HP-5MS, 5% difenil, 95% dimetil polisiloxano (Equivalente DB-%MS ou CP-Sil 8CB LB\MS); Gas de arraste: He (99,9995%); fluxo: 1,0mL [min.sup.-1]; Injetor: 280[degrees]C, modo Split (1:10); Forno: 40[degrees]C (5,0min) [right arrow] 240[degrees]C (4[degrees]C min-1); 240[degrees]C ^[right arrow] 300[degrees]C (8[degrees]C [min.sup.-1], 7,5min); [t.sub.T]=60,0min; Detector: EM; EI (70 eV); Espectrometro de massas tipo quadrupolo linear. Modo de varredura (0,5s [sacn.sup.-1]); Faixa de massas: 40-500 daltons; Linha transferencia: 280[degrees]C; e Filamento: desligado 0,0 a 4,0min. Para a identificacao dos compostos detectados nas amostras, utilizaram-se as bases de dados de espectros de massas NIST105, NIST21 e WILEY139.

Antibiograma

Para a avaliacao da atividade antibacteriana do oleo essencial do manjericao, utilizou-se o Metodo de Difusao em Disco (MDD), segundo metodologia recomendada pelo NCCLS (2000). Para esse teste, as amostras de E. coli EPEC, isoladas das alfaces, foram cultivados em Caldo BHI (37[degrees]C/24 horas) e, apos o periodo de incubacao, foram realizadas diluicoes sucessivas para a obtencao da turbidez de 0,5 na escala de MacFarland ([10.sup.8]UFC [mL.sup.-1]). De cada cultura, retirou se uma aliquota de 0,1mL e inoculou-se na superficie do Agar Mueller-Hinton, sendo utilizado um suabe para espalhar o inoculo. Em seguida, os discos (6mm) impregnados com 75g[micro]L do oleo essencial foram colocados no centro da placa com o auxilio de uma pinca. As placas foram incubadas a 37[degrees]C, por 24 horas. A leitura dos halos de inibicao foi feita com o auxilio de uma regua milimetrada.

Como parametro para a atividade antibacteriana do oleo essencial do manjericao, foram utilizados os padroes de sensibilidade adotados por MOREIRA et al. (2005), os quais classificaram a atividade de diferentes oleos essenciais de acordo com o tamanho do halo de inibicao, a saber: nao sensivel: (-) para diametros [less than or equal to] 8mm; sensivel: (+) para diametros de 9-14mm; muito sensivel: (++) para 15-19mm; extremamente sensivel: (+++) para os halos com diametros >20mm.

Analise estatistica

Para a avaliacao do efeito inibitorio do oleo essencial do manjericao frente aos sorogrupos de E. coli EPEC, os dados experimentais foram submetidos ao teste parametrico para a diferenca entre duas medias populacionais (amostras pequenas e independentes) e com um nivel de significancia de 5%, sendo utilizado o software STATISTICA 7.0. Esse teste foi realizado supondo-se que as variancias populacionais [[sigma].sub.1.sup.2] e [[sigma].sub.2.sup.2] sao desconhecidas e estimadas por meio de pequenas amostras (n [less than or equal to] 30); com [n.sub.1] + [n.sub.2]-2 graus de liberdade. Nesse caso, o criterio de decisao para testar a hipotese nula [[micro].sub.1] - [[micro].sub.2] = [d.sub.0] foi baseado no teste t-Student, considerandose que as populacoes sao aproximadamente normais.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Os dados referentes a frequencia e ao percentual de isolamento de E. coli enteropatogenicas (EPEC) das amostras de alfaces cultivadas pelos sistemas organico e hidroponico estao expressos na tabela 1. De acordo com os resultados, independentemente do sistema de cultivo (organico ou hidroponico), foram identificados, por meio dos testes sorologicos para E. coli enteropatogenica classica EPEC, em ambas as amostras de alface, os sorogrupos: O55, O111, O114, O125, O127 e O142.

No Brasil, estima-se que as diarreias sejam as responsaveis por mais de 200.000 obitos anuais de criancas, nos quais a EPEC se encontra entre as principais causas. A infeccao por EPEC e transmitida principalmente pelo consumo de agua ou alimentos contaminados, sendo o problema agravado quando ha imunodreprimidos (TRABULSI et al., 2002).

Diversos surtos de toxinfeccoes alimentares tem sido associados com hortalicas contaminadas. Pesquisadores tem recuperado varias bacterias patogenicas para humanos desses produtos, tais como Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e E. coli O157:H7 cultivadas em ambos os sistemas de producao --organico e hidroponico. Entre as principais fontes de contaminacao das hortalicas por linhagens de E. coli enteropatogenicas estao o esterco, utilizado com adubo organico, e a agua de irrigacao contaminada, utilizada no sistema de producao organico, bem como a manipulacao, os nutrientes e a agua contendo material fecal na producao hidroponica (McMAHON & WILSON, 2001). SAFARIKOVA & SAFARIK (2001), ao avaliarem a contaminacao de amostras de hortalicas, incluindo a alface, constataram a contaminacao destas por sorogrupos de E. coli O26, O111 e O157.

A analise por CG/EM do oleo essencial do manjericao estudado nesta pesquisa identificou seis componentes como sendo os principais constituintes do oleo com um percentual de abundancia significativo, a saber: o metil chavicol ou estragol [1-metoxi-4-(2-propenil)-benzeno] (62,39%), linalol (25,88%), afarneseno (6,14%), 1,8 cineol (eucaliptol) (3,48%), aterpineol [4-metil-1-(1-metiletil)-3-ciclohexen-1-ol] (1,43%) e a-cadinol (0,67%).

Nesta pesquisa, sorogrupos de E. coli EPEC isolados das amostras de alfaces foram testados frente a acao antibacteriana do oleo essencial do manjericao, em que as caracteristicas numericas obtidas a partir do antibiograma realizado com o oleo essencial estao apresentadas nas tabelas 2 e 3. De acordo com os resultados, os sorogrupos de E. coli EPEC testados demonstraram sensibilidade (+) frente a acao do oleo essencial do manjericao, com medias de halos de inibicao variando entre 11,2mm e 11,6mm e de 11,0mm a 12,0mm para os isolados das alfaces organicas e hidroponicas, respectivamente. Apos a analise estatistica aplicada a esses resultados com a finalidade de comparar as medias dos halos de inibicao, nao foram constatadas diferencas significativas (P>0,05) entre as cepas de E. coli EPEC sensiveis ao oleo de manjericao.

O efeito inibitorio apresentado pelo oleo do manjericao observado nesta pesquisa foi atribuido a presenca do metil chavicol e linalol, os constituintes majoritarios do oleo. Esse resultado e semelhante aos achados de WAN et al. (1998), quando avaliaram a acao antibacteriana do oleo essencial dessa especie frente a uma variedade de bacterias gram positivas e gram negativas, incluindo a E. coli. Os resultados aqui apresentados concordam ainda com os achados por DUARTE et al. (2007), os quais, estudando o efeito de oleos essenciais de plantas medicinais usadas no Brasil, incluindo o manjericao, frente a E. coli enteropatogenicas (EPEC) e E. coli enterotoxigenicas (ETEC), classificaram a atividade antibacteriana do oleo essencial do manjericao como sendo de atividade moderada.

HUSSAIN et al. (2008) relataram a acao do oleo essencial de manjericao frente a Escherichia coli, a qual demonstrou sensibilidade ao apresentar um halo de inibicao de 11,4mm. BOZIN et al. (2006), caracterizando a composicao dos constituintes volateis dos oleos essenciais de algumas especies da familia Lamiaceae, bem como a sua atividade antimicrobiana, verificaram um halo de inibicao de 11mm de diametro para o manjericao frente a E. coli multirresistentes a antibioticos comerciais. Os autores atribuiram o efeito inibitorio a presenca dos constituintes majoritarios do oleo, o metil chavicol e o linalol.

SOKOVIC & VAN GRIENSVEN (2006) comentaram que o manjericao tipo metil chavicol apresentou significante atividade contra o crescimento de diferentes microrganismos, incluindo a E. coli, resultados que corroboram os achados nesta pesquisa. Os referidos autores relataram ainda que a atividade antimicrobiana do oleo essencial de manjericao pode ser atribuida ao linalol e a outros compostos oxigenados.

CONCLUSAO

O teste in vitro do oleo essencial do manjericao testado frente a diferentes sorogrupos de E. coli EPEC classica mostrou atividade antibacteriana significante, sugerindo que este pode ser utilizado como uma alternativa no combate as toxinfeccoes causadas por E. coli. Porem, o potencial uso desse oleo como fitoterapico no tratamento de doencas infecciosas necessita de avaliacao in vivo e de novas pesquisas excluindo possiveis efeitos colaterais para a fisiologia digestiva e microbiota normal de individuos infectados.

REFERENCIAS

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Andre Gustavo Lima de Almeida Martins (I) * Adenilde Ribeiro Nascimento (I) Joao Elias Mouchrek Filho (I) Nestor Everton Mendes Filho (I) Antonio Gouveia Souza (II) Natanael Eudes Aragao (III) Diogo Sergio Vieira da Silva (I)

(I) Departamento de Tecnologia Quimica, Universidade Federal Maranhao (UFMA), Campus Universitario do Bacanga, Av. dos Portugueses, S/N, 65085-580, Sao Luis, MA, Brasil. E-mail: andremartins1975@yahoo.com.br. *Autor para correspondencia.

(II) Laboratorio de Combustiveis-LACOM, Universidade Federal da Paraiba (UFPB), Joao Pessoa, PB, Brasil.

(III) Quimico Industrial, UFMA, Sao Luis, MA, Brasil.
Tabela 1--Frequencia e percentual de isolamento de Escherichia coli
enteropatogenicas isoladas das amostras de alfaces cultivadas pelos
sistemas de cultivo organico e hidroponico comercializadas em feiras
livres e supermercados da cidade de Sao Luis/MA.

                              Sorogrupos de
                           Escherichia coli EPEC

Amostra   Cultivo       O55      O111     O114
                        n(%)     n(%)     n(%)
Alface    Organico      29       1        2
                        (59,2)   (2,0)    (4,1)
          Hidroponico   6        3        2
                        (37,5)   (18,8)   (12,5)

                              Sorogrupos de
                           Escherichia coli EPEC

Amostra   Cultivo       O125     O127    O142
                        n(%)     n(%)    n(%)
Alface    Organico      9        1       7
                        (18,3)   (2,0)   (14,3)
          Hidroponico   2        1       2
                        (12,5)   (6,2)   (12,5)

Nota: n: Numero de E. coli positivas para os sorogrupos de
EPEC classica; (%): percentual de isolamento.

Tabela 2--Caracteristicas numericas da atividade antibacteriana do
oleo essencial do manjericao frente as cepas de Escherichia coli
EPEC classica isoladas de alfaces cultivadas pelo sistema de cultivo
organico, segundo sorogrupos e tamanho do halo de inibicao (mm).

                          Alface organica
Sorogrupos
              Tamanho     Media aritmetica    Intervalo de
             da amostra       (Halo/mm)       confianca 95%

055              29            11,2 a         11,08 a 11,41
0111             5             11,4 a         10,72 a 11,09
0114             10            11,6 a         11,23 a 11,97
0125             9             11,2 a         10,88 a 11,56
0127             5             11,4 a         10,72 a 12,08
0142             7             11,4 a         10,93 a 11,92

                 Alface organica
Sorogrupos
             Desvio    Coeficiente de
             padrao     variacao (%)

055          0,4355         3,87
0111         0,5477         4,80
0114         0,5163         4,45
0125         0,4410         3,93
0127         0,5477         4,80
0142         0,5345         4,68

Nota: Medias seguidas com mesma letra minuscula, na mesma linha, nao
diferem significativamente entre si a 95% de probabilidade pelo
teste t de Student (P<0,05); (-) Nao ha variacao entre as variaveis.

Tabela 3--Caracteristicas numericas da atividade antibacteriana do
oleo essencial do manjericao frente as cepas de Escherichia coli
EPEC classica isoladas de alfaces cultivadas pelo sistema de cultivo
hidroponico, segundo sorogrupos e tamanho do halo de inibicao (mm).

                         Alface hidroponica

Sorogrupos                   Media
             Tamanho da    aritmetica    Intervalo de
               amostra      (Halo/mm)    confianca 95%

055              30          11,7 a      11,49 a 11,85
0111             15          11,0 a      --
0114             10          11,5 a      11,12 a 11,88
0125             10          11,9 a      11,67 a 12,13
0127              5          11,0 a      --
0142             10          12,0 a      --

                 Alface hidroponica
Sorogrupos
             Desvio    Coeficiente de
             padrao     variacao (%)

055           0,4795        4,11
0111          0,00          0,00
0114          0,5271        4,58
0125          0,3162        2,66
0127          0,00          0,00
0142          0,00          0,00
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Author:Martins, Andre Gustavo Lima de Almeida; Nascimento, Adenilde Ribeiro; Filho, Joao Elias Mouchrek; Fi
Publication:Ciencia Rural
Date:Aug 1, 2010
Words:3900
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