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Analisis morfometrico y ultraestructural del efecto del laser infrarrojo 10 J/[cm.sup.2] sobre fibroblastos de conejo.

Ultrastructural and Morphometrical Analysis of the Laser Irradiation 10 J/[cm.sup.2] Effect in Rabbit Fibroblasts

INTRODUCCION

En los ultimos 20 anos se ha demostrado que la aplicacion de emisiones infrarrojas generadas por el diodo laser Arsenurio de Galio (AsGa) modelo (CEC IR 10), Argentina, provoca un sostenido alivio en lesiones articulares de una amplia gama de animales debido a su probada accion analgesica [8, 14], antiinflamatoria y cicatrizante [15, 21], induciendo a nivel celular una acentuada sintesis de ATP mitocondrial [13, 17], modulacion de canales de calcio [1, 24], incremento en la sintesis de ADN [20, 22], activacion de la mitosis [16, 23] y sintesis de colageno [5, 21].

En este contexto, sin embargo, el resultado de los efectos subcelulares de estas estimulaciones son poco descriptivas y considerando que en la medida que las celulas son estimuladas, sus componentes sufren modificaciones cualitativas, cuantitativas y topograficas, por ello seria posible suponer que mediante un analisis cuantitativo de microfotografias electronicas pudiese evidenciarse como el eventual desarrollo de sus componentes podria traducirse en determinar una funcion celular especifica producto de esta estimulacion por radiacion infrarroja en este modelo biologico [11].

Por tanto, esta investigacion tuvo como objetivo observar el efecto ejercido por estimulaciones infrarrojas emitidas por el diodo laser Ga-As equivalentes a una longitud de onda de 904 nm sobre fibroblastos y describir las respuestas celulares a nivel ultraestructural, determinando un patron de comparacion entre celulas normales y estimuladas en sus aspectos morfologicos y morfometricos, resultado de tal induccion.

MATERIALES Y METODOS

Microscopia electronica de transmision

A partir de la articulacion temporo-mandibular de conejos (Lepus timidus) normales-controles e irradiados diariamente con laser infrarrojo por espacio de 15 dias, fueron obtenidas muestras para el estudio de fibroblastos. A ellas se le adiciono solucion de glutaraldehido 2%, en tampon fosfato 0,15 M, pH 7,2 y se mantuvieron a temperatura ambiente por 2 horas. Posteriormente, fueron sometidas a un lavado en solucion de 6 g de NaCl y 73 g de sacarosa, disueltos en 1 L de agua destilada (Water Purification Barnstead, Mod Diamond, EUA).

La post-fijacion se realizo con tetroxido de osmio 1%, disuelto en la solucion de lavado antes descrita durante una hora a 40[grados]C (Polysciences, EUA) y acetato de uranilo 0,5%, por 18 horas. Luego de lavado, el material fue deshidratado en concentraciones crecientes de acetona (30 a 100%) e incluido en Araldita 6005. Se obtuvieron cortes ultrafinos (Ultramicrotomo MT1, Sorval, Dupont Instrument, EUA) los cuales fueron tratados con acetato de uranilo 2%, durante 40 minutos y citrato de plomo 0,5%, por 10 minutos [4, 6]. Las muestras fueron estudiadas y fotografiadas en un microscopio electronico Phillips EM 300, EUA.

Metodo estereologico

A partir de los bloques para microscopia electronica, fueron obtenidos cortes ultrafinos, desde los cuales se microfotografiaron fibroblastos normales e irradiados con un aumento de 11.500 X. Para la evaluacion de las fracciones volumetricas de los componentes celulares, fue sobrepuesto un reticulo de puntos sobre las microfotografias electronicas y se procedio al conteo diferencial de los puntos que incidian sobre los perfiles de los componentes, calculandose la fraccion volumetrica que ellos ocupan, mediante la siguiente ecuacion [28]:

[F.sub.v] = P [conjuncion]/Pt

donde:

Fv = Fraccion volumetrica del componente celular

P[conjuncion] = Puntos incidentes sobre el componente en estudio

Pt = Puntos totales incidentes en la celula estudiada

Para el calculo del area celular fue utilizado el software Sigma Scan Pro 5.0. [12]. Los resultados cuantitativos fueron analizados mediante el software estadistico SPSS15.0 aplicandose la prueba estadistica de Wilcoxon para muestras no parametricas [27].

RESULTADOS Y DISCUSION

Analisis morfometrico

En las microfotografias electronicas obtenidas de los fibroblastos normales (FIG. 1) e irradiados con dosis de 10 J/[cm.sup.2] (FIG. 2) se realizaron los analisis morfometricos, sometiendose los resultados a la prueba estadistica de Wilcoxon para las diferentes variables, resultando estadisticamente significativa para un P = 0,05 y determinandose entonces que el efecto de esta estimulacion con laser infrarrojo puede representarse a nivel celular considerando los siguientes hechos:

1. Las fracciones volumetricas ocupadas por el citoplasma y por el reticulo endoplasmatico rugoso (RER), manifestado en grandes cisternas dilatadas, disminuyen en la medida que se aplica la estimulacion.

2. Por el contrario, esta dosis de irradiacion determina un notable aumento en las fracciones volumetricas perteneciente al nucleo de los fibroblastos irradiados. Los datos referentes a estos componentes celulares se describen en la FIG. 3.

3. Se observa que la relacion nucleo-citoplasmatica cuantificada en fibroblastos normales equivale a 0,4 mientras que en los irradiados con 10 J/[cm.sup.2] se eleva a 1,4.

4. Con respecto a las fracciones volumetricas de eucromatina se observa que aumentan considerablemente en fibroblastos irradiados y la heterocromatina disminuye desde los fibroblastos normales hasta los irradiados. Estos resultados se evidencian en la FIG. 4.

5. En cortes transversales se observa claramente que los fibroblastos normales sintetizan y secretan filamentos de dos diametros diferentes, por el contrario en el caso del fibroblasto irradiado solo es posible visualizar filamentos de diametro unico.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

Como se evidencia en la TABLA I, el area celular perteneciente a los fibroblastos irradiados con esta dosis infrarroja experimenta una drastica disminucion en comparacion con el fibroblasto normal. Del analisis de los resultados se concluye que la aplicacion de esta alta densidad de energia determina cambios drasticos, tanto en la morfologia como en ultraestructura y por ende, en la funcionalidad de los fibroblastos.

En este sentido, se demostro mediante metodos morfometricos y ultraestructurales que, cuando estas celulas son estimuladas con dosis de 2 J/[cm.sup.2] sus constituyentes celulares varian significativamente [3]. En este mismo contexto, se podria argumentar que el sostenido aumento en el volumen nuclear es producto de las estimulaciones infrarrojas y ademas, considerando que las fracciones volumetricas correspondiente a la eucromatina en las celulas irradiadas aumentan considerablemente respecto al fibroblasto normal, indicaria que la tasa de expresion genica se mantendria constante para cuando la maquinaria celular lo requiriera.

Sin embargo, la notoria disminucion en las fracciones volumetricas correspondiente al citoplasma y a las del RER, desde el fibroblasto normal a los estimulados, demuestra que este aumento en las inducciones estan determinando que la funcion celular, sobre todo lo relativo a la sintesis de colageno, esta deprimida, hecho que se confirma en las propias microfotografias electronicas.

Del mismo modo y sin lugar a dudas, la acentuada disminucion en el area celular cuantificada en los fibroblastos estudiados, constituye una optima representacion del efecto nocivo que esta dosis de laser infrarrojo genera en este tipo celular produciendo un verdadero estado de involucion en su morfofuncion.

Los parametros descritos son coincidentes con los hallazgos comunicados por varios investigadores [7, 9, 10], en el sentido que han determinado que altas densidades de energia basicamente sobre 5 J/[cm.sup.2] corresponden a dosis nocivas para la viabilidad y funcionalidad de fibroblastos, mientras que el optimo en la densidad de energia aplicada corresponde a 3 J/[cm.sup.2] situacion en donde se percibe alta tasa de sintesis y secrecion de colageno, aumento en la densidad de estas fibras y proliferacion de estas celulas [23, 26].

En este contexto, otras investigaciones [18] han demostrado histologicamente que, el tejido fibrocartilaginoso de la articulacion temporo-mandibular de conejos presenta una disposicion desordenada del colageno secretado y una notable variacion en las dimensiones de la articulacion luego de ser irradiada con dosis de 2 J/[cm.sup.2] de laser infrarrojo.

De igual manera, otros estudios [19, 25] comunican que los fibroblastos estudiados y estimulados con dosis de 4 J/[cm.sup.2] se caracterizan por presentar un notable incremento en la sintesis y secrecion, tanto de fibras colagenas como de elasticas y que por tanto, mayores dosis infrarrojas pueden determinar, como en este informe, ausencia en sintesis y secrecion de fibras elasticas.

La drastica disminucion en el area de los fibroblastos irradiados evaluada en este estudio presenta semejanza con los datos obtenidos por Chen y col. [2], los cuales describen que fibroblastos irradiados con altas dosis de laser se traducen en una acentuada disminucion de la funcion celular y sintesis de colageno y sobre todo, generando la perdida de la arquitectura normal del fibroblasto, incluso llegando a la lisis de las celulas.

El analisis de los datos morfologicos obtenidos con la microscopia electronica de transmision traducidos en resultados, considerando los relativos a las fracciones volumetricas disminuidas, tanto del RER como del citoplasma, pero sobre todo la drastica disminucion en el area de las celulas irradiadas y mas aun, el cambio en la electrodensidad del citoplasma en los fibroblastos estimulados, constituyen una optima representacion del efecto que estas emisiones infrarrojas generan en estas celulas, mostrando entonces un activo proceso de cambio en la expresion genica modulada por esta densidad de energia utilizada.

CONCLUSIONES

En respuesta al aumento desmesurado en la utilizacion de las emisiones infrarrojas en el tratamiento de diversas afecciones, basado principalmente en sus propiedades analgesicas y antiinflamatorias, los resultados obtenidos sugieren que, altas dosis de estimulaciones infrarrojas son nocivas para la funcion de las celulas y por ende, de los tejidos.

En la presente investigacion se muestra con claridad que el fibroblasto perteneciente a la articulacion temporo-mandibular evidencia una notable disminucion de su area celular y un progresivo decrecimiento en la sintesis de proteinas considerando la sostenida baja en las fracciones volumetricas de reticulo endoplasmatico rugoso cuantificada en estas celulas.

De acuerdo a lo descrito, se concluye que para el uso terapeutico del laser infrarrojo es necesario determinar las dosis optimas de potencia para conseguir una accion eficaz del instrumento y evitar el deterioro o inhibicion de la funcion celular con estas estimulaciones.

AGRADECIMIENTO

Este estudio fue financiado por la Direccion de Investigacion de la Universidad de La Frontera, Temuco, Chile; Proyecto DI 08-0022.

Recibido: 17 / 09 / 2009. Aceptado: 26 / 03 / 2010.

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Ricardo Cornejo Uribe (1), Fernando Matamala Vargas (1), Hector Silva Mella (1) y Orlando Garrido Onate (2)

(1) Departamento de Ciencias Basicas, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera.

(2) Instituto de Embriologia, Facultad de Ciencias Universidad Austral de Chile.

E-mail: rcornejo@ufro.cl
TABLA I
AREA CELULAR ([u.sup.2]) CORRESPONDIENTE A
FIBROBLASTOS NORMALES E IRRADIADOS CON DOSIS
10 J/[cm.sup.2] PERTENECIENTES AL DISCO DE LA
ARTICULACION TEMPORO-MANDIBULAR DE CONEJO /
CELLULAR AREA CORRESPONDING TO NORMAL AND IRRADIATED
FIBROBLASTS BY A DOSES OF 10 J/[cm.sup.2] ON RABBIT
TEMPORO-MANDIBULAR DISK JOINT.

Fibroblasto normal      Fibroblasto irradiado 10 J/[cm.sup.2]

82 micrones cuadrados   35 micrones cuadrados

FIGURA 3. FRACCIONES VOLUMETRICAS (%) CORRESPONDIENTES
A LOS COMPONENTES DE LOS FIBROBLASTOS
NORMALES E IRRADIADOS CON 10 J/[CM.sup.2] DURANTE
5 MINUTOS PERTENECIENTES AL DISCO DE LA
ARTICULACION TEMPORO-MANDIBULAR DE CONEJO/
VOLUMETRIC FRACTIONS (%) OF NORMAL AND IRRADIATED FIBROBLASTS
COMPONENTS BY A DOSES OF 10 J/[CM.sup.2] FOR 5 MINUTES
FROM RABBIT TEMPORO-MANDIBULAR DISK JOINT.

                Fibroblasto    Fibroblasto
                 Irradiado       Normal

R.E.R.              10             16
Nucleo              59             29
Citoplasma          40             70

Nota: Tabla derivada de grafico de barra.

FIGURA 4. FRACCIONES VOLUMETRICAS DE LA CROMATINA
EVALUADA EN LOS FIBROBLASTOS NORMALESCONTROLES
E IRRADIADOS CON 10 J/[CM.sup.2] DURANTE 5
MINUTOS PERTENECIENTES A LA ARTICULACION TEMPORO-MANDIBULAR
DE CONEJO/CHROMATIN VOLUMETRIC
FRACTION ASSESEED ON NORMAL AND IRRADIATED FIBROBLASTS
BY A DOSES OF 10 J/[CM.sup.2] FOR 5 MINUTES 98.FROM RABBIT
TEMPORO-MANDIBULAR DISK JOINT.

                     Fibroblasto       Fibroblasto
                       Normal           Irradiado

Heterocromatina          60                32
Eucromatina              40                66

Nota: Tabla derivada de grafico de barra.
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Author:Cornejo Uribe, Ricardo; Matamala Vargas, Fernando; Silva Mella, Hector; Garrido Onate, Orlando
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Article Type:Report
Date:Sep 1, 2010
Words:2894
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