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Analisis morfometrico del proceso de diferenciacion in vitro de neuronas del hipocampo.

Morphometric analysis of the differentiation process of hippocampal neurons in vitro.

INTRODUCCION

Uno de los principales atractivos de los cultivos primarios de celulas nerviosas es la posibilidad de acceder de manera inmediata a neuronas vivas para su observacion y manipulacion. Adicionalmente, los cultivos neuronales de densidades determinadas (baja y mediana densidad) son menos complejos que los tejidos de los cuales provienen, convirtiendolos en la preparacion ideal para investigar aspectos importantes de la biologia neuronal (1-5). Las lineas celulares clonales se han usado como modelos para el estudio de la fisiologia neuronal, sin embargo, estas celulas deben ser estimuladas con factores neurotroficos y cultivadas en las condiciones adecuadas para simular el comportamiento fisiologico de celulas nerviosas como la generacion de procesos (dendritas y axones) y la formacion de conexiones neuronales (6), lo que presenta limitaciones al establecer una comparacion directa entre el comportamiento de las celulas nerviosas in vivo y estos modelos. Por otra parte, aspectos de la biologia neuronal como son la diferenciacion, trafico y localizacion subcelular de proteinas, asi como ensayos con drogas de potencial terapeutico son estudiados mayormente en cultivos primarios de celulas del sistema nervioso, razones que justifican el amplio uso de estos cultivos.

En principio, los cultivos neuronales primarios pueden prepararse de cualquier region del cerebro, sin embargo, el hipocampo representa una de las regiones del cerebro mas utilizada debido a que su poblacion neuronal es bastante homogenea. La poblacion neuronal del hipocampo esta representada por las neuronas piramidales las cuales a su vez representan de 85% a 90% de la poblacion total de neuronas del SNC (7, 8). Adicionalmente, las neuronas piramidales en cultivo expresan muchas de las caracteristicas fenotipicas propias de estas celulas, como son el desarrollo de un axon simple, una larga dendrita apical y numerosas dendritas basales mas cortas (8, 9); en general estas celulas mantienen su identidad en cultivos in vitro, lo que hace a estos cultivos excelentes modelos para el estudio del funcionamiento del SNC (9-12).

Investigaciones sobre el desarrollo de celulas individuales del tejido nervioso requieren del estudio de la distribucion diferencial de marcadores especificos. Las condiciones de cultivo in vitro permiten el crecimiento de celulas a baja o mediana densidad, para facilitar la observacion de neuronas individuales (7, 9, 13, 14). El estudio de estas celulas en cultivos homogeneos y de densidad controlada, hace posible monitorear los cambios experimentados durante el periodo de cultivo.

La interpretacion del funcionamiento del sistema nervioso tanto en condiciones normales como patologicas es un tema controversial y de gran interes cientifico. Sin embargo, la gran diversidad y complejidad de las estructuras y los procesos involucrados en su funcionamiento han hecho dificil un total entendimiento de su fisiologia. No obstante, gracias a la implementacion de los cultivos celulares se ha facilitado enormemente el estudio de las estructuras, ofreciendo una mayor comprension de este complejo sistema (2-5, 15-19).

El desarrollo de todo tejido involucra procesos de proliferacion, migracion, adhesion, diferenciacion y sobrevivencia, eventos delimitados espacial y temporalmente durante el desarrollo in vivo. Dichos procesos, sumados a la regeneracion del tejido nervioso se encuentran influenciados por la accion conjunta de factores neurotroficos que activan cascadas de senalizacion celular que conducen a la proliferacion y eventual diferenciacion del tejido (1, 20-22). El efecto de los factores neurotroficos involucrados en su desarrollo y en el proceso de diferenciacion ha sido y continua siendo estudiado en cultivos homogeneos de distintos tipos neuronales. Estos cultivos no solo estan siendo empleados para el estudio de la regulacion de procesos celulares que conllevan a la degeneracion del tejido nervioso, sino tambien para el desarrollo de terapias de transplante para tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (19, 23, 24).

En el presente trabajo se planteo el establecimiento de cultivos primarios de celulas del hipocampo de ratas, para el estudio de la morfologia de las neuronas, asi como los cambios experimentados por estas, a medida que avanzaba el proceso de maduracion neuronal. Especificamente, se estudio la proporcion de tipos celulares originados (neuronas y glia), el desarrollo de las neuritas (dendritas y axones), la acumulacion de vesiculas sinapticas y los cambios experimentados por los conos de crecimiento, durante el desarrollo de dichos cultivos. Otros autores han analizado algunas de estas caracteristicas de manera independiente. Sin embargo, en el presente estudio se presenta una descripcion mas integral del desarrollo neuronal ya que se estudian y cuantifican las caracteristicas morfologicas y la expresion de marcadores celulares, lo que permite una mejor descripcion del desarrollo anatomico funcional de estas neuronas.

En el presente trabajo se estudian y cuantifican, de manera conjunta, parte de las caracteristicas morfologicas y su comportamiento durante el desarrollo in vitro, permitiendo establecer una relacion entre el tiempo de aparicion de estos marcadores, sus parametros morfometricos y la maduracion de la neurona; representando asi una buena descripcion integral del desarrollo anatomico-funcional neuronal.

MATERIALES Y METODOS

Animales

Para la preparacion de los cultivos neuronales se utilizaron embriones de rata Sprague-Dawley de 19 dias (E19). Los embriones se removieron por cesarea despues de sacrificar a la madre por exposicion a CO2 y decapitacion. Los animales se mantuvieron y sacrificaron segun regulaciones del Instituto de Estudios Avanzados (IDEA). Se tomaron precauciones para reducir el numero de animales asi como su sufrimiento.

Disociacion, cultivo y mantenimiento de las celulas del hipocampo

Todos los reactivos empleados en esta seccion, a menos que se indique lo contrario, se obtuvieron de Gibco-Invitrogen (Grand Island, NY). Los cultivos neuronales de hipocampo se prepararon a partir de embriones de rata E19 segun protocolos previamente descritos (26, 27).

En general, se extrajeron los hipocampos y se transfirieron al medio de diseccion [Solucion Salina Balanceada de Hanks (HBSS) suplementada con 10 mM HEPES pH 7,4 y una mezcla de Penicilina-Streptomicina (100 U/mL-100 ?ug/mL)]. Despues de 3 lavados con el medio de diseccion, los hipocampos se transfirieron a una solucion de Tripsina al 0,25% en HBSS y se incubaron a 37[grados]C durante 15 minutos. Se lavaron nuevamente y se disociaron mediante trituracion mecanica en 2 mL del medio de cultivo (medio Neurobasal[TM], suplementado con B27, 0,5 mM Glutamina, 0,0125 mM Glutamato y Penicilina-Streptomicina). Las celulas resultantes se resuspendieron a una concentracion final de 5 x [10.sup.4] cel/mL en medio de cultivo y se colocaron en placas de 24 pozos (0,5 mL/pozo); que contenian cubreobjetos de vidrios previamente tratados con una mezcla de Poli-D-Lisina (0,0375 mg/mL, Fisher CB40210) y lamini na (0,0021 mg/mL, Fisher CB40232). Las celulas se mantuvieron en incubadora (37[grados]C, C[O.sub.2] 5%, el resto de los gases representa el 95% y se encuentra en equilibrio con los gases encontrados en el aire) hasta su uso. Cada 3 dias se reemplazo la mitad del volumen del medio de cultivo, por medio fresco sin glutamato.

Caracterizacion morfologica por inmunofluorescencia

Para el marcaje de los conos de crecimiento se realizo la fijacion del cultivo mediante un protocolo de fijacion para citoesqueleto, para ello las celulas se incubaron en una solucion de fijacion-permeabilizacion (formaldehido al 3,7%, glutaraldehido al 0,075%, Triton X-100 al 1%, en PBS), durante 2 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente, se incubaron en la solucion de fijacion (formaldehido al 3,7%, glutaraldehido al 0,075%, en PBS) por 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se colocaron en la solucion de permeabilizacion (Triton X-100 al 1%, en PBS) por 30 minutos a temperatura ambiente. Las celulas se lavaron 3 veces con NaBH4 al 1% en PBS, durante 5 minutos. Para el marcaje de neuronas, glias, dendritas, axones y vesiculas sinapticas las celulas se fijaron con PFA-PBS al 4%, por 20 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente, se realizaron varios lavados con PBS en un tiempo total de 20 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,25% en PBS, por 10 minutos a temperatura ambiente. A partir de este momento los tratamientos fueron similares para los distintos tipos de marcaje. Se procedio al bloqueo con suero normal de cabra al 10% (NGS, Sigma, Saint Louis, MO) en PBS y se incubo a temperatura ambiente por 1 hora. Seguidamente se realizo la incubacion con los anticuerpos primarios diluidos en NGS al 2% en PBS y se dejaron a 4[grados]C durante toda la noche. Despues de varios lavados con PBS, se agregaron los anticuerpos secundarios en NGS (2%) en PBS, por 1h a temperatura ambiente, en caso de usar pruebas fluorescentes estas se incluyeron junto con el anticuerpo secundario. Despues de lavar con PBS se montaron en el medio para fluorescencia Mowiol-Dabco [(glicerol al 25%, Mowiol al 10% (Calbiochem, San Diego, CA) 6 mL de [H.sub.2]O destilada, 0,2 M Tris, pH 6,8; DABCO al 2,5% (Sigma)].

Anticuerpos y pruebas fluorescentes no inmunologicas

Para la cuantificacion de neuronas y celulas gliales se realizaron experimentos de triple marcaje, para ello se marcaron los nucleos celulares con la prueba fluorescente DAPI (1:10000, Molecular Probes-Invitrogen, Eugene, OR), las neuronas con MAP2 (1:5000, anticuerpo policlonal preparado en conejo, Millipore, Billerica, MA) y celulas gliales con GFAP (1:1000, anticuerpo monoclonal preparado en raton, Sigma). El desarrollo de las dendritas y la determinacion de su longitud se realizaron mediante el marcaje con MAP2 (1:5000, anticuerpo policlonal preparado en conejo, Millipore). El desarrollo de los axones se analizo con el anticuerpo SMI35 (1:5000, anticuerpo monoclonal preparado en raton, Covance, Princeton, NJ). Para determinar la distribucion de las vesiculas sinapticas sobre las dendritas y su densidad en areas de estos procesos (usados como referenciales) se realizo doble marcaje con sinaptofisina (1:500, anticuerpo monoclonal preparado en raton, Sigma) y MAP2 (1:5000). Para el estudio de los conos de crecimiento se realizo el doble marcaje con MAP2 (1:5000) y la prueba fluorescente Faloidina-Rodamina (1:40, Molecular Probes-Invitrogen), la cual marca los filamentos de actina enriquecidos en los conos de crecimiento. Los anticuerpos secundarios fueron anti-raton o anti-conejo Alexa 488 (1:200, Molecular Probes-Invitrogen) y anti-raton o anti-conejo Alexa 594 (1:600, Molecular Probes-Invitrogen).

Adquisicion de imagenes

Las celulas se observaron periodicamente para seguir el desarrollo y asegurar la homogeneidad de los cultivos. Para ello se obtuvieron imagenes en un microscopio invertido Axiovert 100 (Zeiss) equipado para contraste de interferencia diferencial (DIC) e inmunofluorescencia. Los objetivos fueron: Plan-Neofluar 10 X A.N 0,3; Plan Achromat 32X A.N 0,4 y Plan-Apochromat 100X A.N 1,4 (para inmersion en aceite). Las celulas se fotografiaron con una camara digital (Nikon, Cool pix 900) adaptada al microscopio, este microscopio se utilizo para los primeros experimentos de doble marcaje fluorescente usando los filtros XF25 Vivid Classic (excitacion 494 nm, emision 518 nm) y 488015 (excitacion BP 546/12 nm, emision LP 590 nm). Adicionalmente, para los experimentos de triple marcaje fluorescente se uso el microscopio invertido Axio Observer Z1 (Zeiss-Germany), equipado con los filtros 488049 (excitacion G365 nm, emision 445/50 nm), 489038 (excitacion 470/40 nm emision 525/50) y el 488020 (excitacion 546/12 nm emision 575-640). Las celulas se fotografiaron con una camara digital (Nikon modelo Cool pix 5400) adaptada al microscopio, utilizando los objetivos Plan Neofluar 40X A.N 0,6 y Plan Apochromat 100X A.N 1,4 (para inmersion en aceite). Las fotografias obtenidas fueron analizadas con la ayuda del Software ImageJ (NIH, Bethesda, Estados Unidos).

Cuantificacion

El proceso de extraccion y cultivo de las neuronas del hipocampo se realizo a partir de 4 disecciones independientes, con replicas por cada periodo y prueba. Cada condicion se fotografio en diez campos aleatorios para realizar los analisis correspondientes. La proporcion de los distintos tipos celulares se determino mediante la cuantificacion de las imagenes provenientes del triple marcaje de los nucleos celulares marcados con DAPI, celulas con marcaje positivo para MAP2 y celulas con marcaje positivo para GFAP. Para ello se utilizo la superposicion de imagenes obtenidas a un aumento de 40X.

La longitud promedio de dendritas por celula se obtuvo mediante la division de la longitud total de estos procesos marcados con MAP2 entre el total de neuronas contadas. El mismo criterio se utilizo para determinar la longitud de los procesos axonales, la cual solo se pudo realizar en los estadios iniciales del cultivo, Para ambos casos, se utilizo una correlacion de [micron]m/pixel en el programa ImageJ a partir de una escala preestablecida. Adicionalmente se determino el numero promedio de dendritas por celula, para lo cual se conto el numero total de dendritas y se dividio por el numero total de neuronas analizadas.

Para la determinacion de la densidad de vesiculas sinapticas sobre las dendritas y con la ayuda del doble marcaje con los anticuerpos Sinaptofisina y MAP2, se cuantifico la cantidad de vesiculas presentes en 10 areas de 5 [micron][m.sup.2] de procesos dendriticos. Estas areas fueron escogidas de manera aleatoria, por cada campo fotografiado y se utilizo la escala preestablecida mediante una correlacion de ?um/pixel en el programa ImageJ.

Por ultimo, para estudiar la morfologia de los conos de crecimiento, mediante la determinacion de la proporcion de conos abiertos y cerrados, se realizo un doble marcaje con Anti-MAP2 para los procesos neuronales y el trazador no inmunologico Faloidina-Rodamina.

Todas las cuantificaciones se realizaron de manera independiente por cada marcaje, para cada diseccion y periodo de tiempo, los resultados mostrados representan el promedio con su error estandar (X [+ o -] SEM). La cuantificacion se realizo a partir de cuatro experimentos independientes, con dos replicas cada uno.

RESULTADOS

Establecimiento de cultivos primarios y estudio del desarrollo de la morfologia neuronal in vitro

A partir del extracto celular de neuronas del hipocampo de los embriones se logro obtener un cultivo celular homogeneo, de mediana densidad, en donde se pueden observar celulas de manera independiente. Como se puede observar en las micrografias obtenidas por DIC (Fig. 1), las celulas en cultivo muestran un crecimiento progresivo de las neuritas, asi como tambien un aumento en la complejidad de la red neuronal. Sin embargo, en todos los periodos se pueden observar celulas individuales, lo que garantiza la precision de las observaciones con el marcaje inmunofluorescente. Las neuronas se mantuvieron en buen estado hasta 21 dias en cultivo, posterior a este tiempo se comenzo a observar un deterioro del cuerpo celular y la fragmentacion de los procesos, razon por la cual no se emplearon cultivos posteriores a este periodo.

Tipos celulares presentes en los cultivos

La extraccion del hipocampo y la disociacion de las celulas de manera mecanica no permiten seleccionar el tipo celular a cultivar. Por tal motivo, se utilizaron condiciones de cultivo, sustrato y un medio de cultivo, los cuales favorecen el crecimiento selectivo de neuronas (26, 27). En cuanto a la proporcion de los diferentes tipos celulares se observo una tendencia hacia el aumento del porcentaje de neuronas el cual oscilo entre 46,9 [+ o -] 4,40% y 68,51 [+ o -] 5,81%; mientras que, el porcentaje de celulas positivas para GFAP experimento variaciones entre 11,83 [+ o -] 7,51% y 26,93 [+ o -] 10,25%. La proporcion de celulas positivas para MAP2 experimento el pico mas alto a las 24 horas, con un leve decrecimiento a las 48 horas, a partir del dia 3 la proporcion de neuronas se recupero (57,66 [+ o -] 11,23%), estabilizandose a partir del dia 7, sin embargo es importante senalar que a pesar que se observo que estas variaciones no fueron lineales estas no son significativas, lo que se concluye luego de la aplicacion de un t-test entre ambos estadios, con el cual se obtuvo un p-valor igual a 0,3118 (P>0,05). Para las celulas positivas para GFAP, a excepcion del dia 3 donde se observa el pico mas alto (26,93 [+ o -] 10,25%), la proporcion de celulas gliales fue bastante estable (Fig. 2). Es importante senalar que los porcentajes de celulas positivas para MAP2 y GFAP no suman el 100%, quedando una poblacion celular entre 17,47 y 37,73% que no fue marcada por estos anticuerpos.

[FIGURA 1 OMITIR]

Longitud y numero de los procesos neuronales por celula

Para el estudio de los procesos neuronales (dendritas y axones), se determino el numero promedio de dendritas por celula y la longitud de los axones y las dendritas; para ello se realizo un doble marcaje inmunologico utilizando los anticuerpos MAP2 (dendritas) y SMI35 (axones). En los marcajes realizados en cultivos de 24-48 horas en la mayoria de las neuronas se observo que uno de los procesos presentaba una doble expresion de los marcadores axonales (verde) y dendriticos (rojo) (cabezas de flecha, Fig. 3A-ab). A las 72 horas, se comenzo a observar de manera mas marcada el marcador axonal mientras que comenzo a disminuir la expresion del marcador dendritico y a los 7 dias el marcaje de los axones fue completamente distinto del dendritico. Paralelamente, se midio la longitud de las dendritas y se observo un aumento de esta a medida que se incrementaba el tiempo de cultivo; los valores de la longitud de dendritas variaron de 93,90 [+ o -] 5,01 [micron]m (24 h) a 499,32 [+ o -] 35,27 [micron]m (21 d) por celula, observandose el mayor valor a los 15 dias (575,57 [+ o -] 72,91 %) (Fig. 3B). Por su parte, la cantidad de dendritas fluctuo de 3 a 6 dendritas por celula a lo largo del periodo de cultivo. Con respecto al desarrollo de los axones la longitud de los mismos solo se pudo determinar durante los periodos iniciales del cultivo (24-72 h). Esta longitud mostro tambien un aumento de 30 ?u-m (24 h) a 300[micron]m (72 h) por celula. En los cultivos de 7 a 21 dias se imposibilito la medicion precisa de los axones debido al incremento de la complejidad de la red axonal en estas etapas del desarrollo in vitro.

[FIGURA 2 OMITIR]

Densidad de vesiculas sinapticas

La determinacion de la densidad de vesiculas sinapticas sobre los procesos dendriticos, fue monitoreada a traves del desarrollo de los cultivos. Se observo una tendencia homogenea donde se evidencia un aumento gradual de las vesiculas sinapticas, a medida que transcurria el tiempo de cultivo (Fig. 4A). La cuantificacion de la densidad de vesiculas entre 24 y 48 horas no llego a superar la unidad, esto se debe a que en estos periodos pocas veces no se pudo observar vesicula alguna. A partir de los 3 dias, la densidad de vesiculas en el area mencionada aumento de 2 a 4 vesiculas por 5 [micron][m.sup.2] (Fig. 4B).

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

Cambios en la morfologia de los conos de crecimiento durante el cultivo

Se realizo la observacion de la morfologia de los conos de crecimiento durante el tiempo de cultivo (1-21 dias) para determinar si existia relacion entre los cambios morfologicos de dichas estructuras, con la maduracion del cultivo.

Como caracteristica morfologica considerada en esta determinacion fue el estado de los conos de crecimiento (abiertos y cerrados). La proporcion de los conos de crecimiento cerrados disminuyo de manera progresiva a medida que avanzaba el tiempo de cultivo, esta oscilo entre 79,98 [+ o -] 4,64 (24 horas) y 23,78 [+ o -] 1,07 (21 dias). Por otra parte, la proporcion de conos de crecimiento abiertos aumento considerablemente en el mismo tiempo de cultivo, observandose valores entre 20,03 [+ o -] 4,64 (24 horas) y 76,23 [+ o -] 1,07 (21 dias) (Fig. 5).

[FIGURA 5 OMITIR]

DISCUSION

En la presente investigacion se estudiaron las principales caracteristicas morfologicas del desarrollo neuronal, empleando neuronas del hipocampo cultivadas a mediana densidad. Este estudio contemplo, ademas del estudio cualitativo, un analisis cuantitativo de dichas caracteristicas cuyos resultados podrian usarse como referencia morfometrica del proceso de maduracion neuronal in vitro. Para relacionar los cambios morfometricos con la maduracion funcional del cultivo, se realizaron las observaciones correspondientes mediante tecnicas de inmunofluorescencia.

Estudios similares que muestran aspectos importantes del desarrollo neuronal, han sido descritos previamente (9, 25, 26), sin embargo aqui proveemos un analisis mas completo y cuantitativo de las principales variaciones de la morfologia neuronal.

Para establecer modelos de crecimiento y funcionamiento celular in vitro que tengan relevancia fisiologica deben incorporarse al sistema de cultivo los componentes del ambiente in vivo; estos comprenden principalmente el sustrato y componentes de los medios de cultivo (vitaminas, factores de crecimiento, etc.) (29). El medio de cultivo Neurobasal[TM], libre de suero y suplementado con B27 (MNB27), fue uno de los factores determinante para la selectividad del cultivo, tanto en nuestro sistema como en el de otros (9, 25). En nuestro estudio, las neuronas desarrollaron la morfologia caracteristica con extension y ramificaciones de neuritas, establecimiento de las sinapsis y aumento de la complejidad de las redes neuronales. Este desarrollo ocurre de manera adecuada gracias, en gran parte, a los sustratos empleados. Con respecto a esto ultimo, podemos mencionar que la glicoproteina laminina favorece la adhesion, diferenciacion, la sobrevivencia y el desarrollo de las neuritas (30), mientras que la poli-D-lisina, ademas de aumentar la adhesion celular a diferentes superficies (plasticas y de vidrio), favorece la absorcion de proteinas presentes en la matriz extracelular (29).

En este tipo de cultivos, es de principal interes obtener neuronas de manera homogenea y mayoritaria, para la preservacion de las principales caracteristicas funcionales. En los cultivos establecidos en este estudio, se observo en general, una mayor proporcion de neuronas en los diferentes periodos de tiempo. En este sentido, nuestros resultados concuerdan con lo reportado previamente de cultivos primarios de celulas del hipocampo (25), y esa menor proporcion de celulas gliales fue atribuida al uso de Poli-D-Lisina como sustrato.

Los medios libres de suero son especialmente utiles para el control de concentraciones criticas de factores de crecimiento, hormonas y algunos aminoacidos, necesarios para la seleccion celular del cultivo (27), dado que la presencia de suero ocasionaria que las neuronas crezcan a concentraciones mayores a 300 celulas/[mm.sup.2] lo que no permitiria una observacion de celulas individuales, ademas de una amplia proliferacion de celulas gliales. El Medio Neurobasal[TM] es un medio comercial para cultivo neuronal, por su parte el MNB27 presenta condiciones que favorecen el desarrollo de celulas neuronales por encima del desarrollo glial, tales como concentraciones optimas de algunos aminoacidos, sulfato de zinc, vitamina B12, entre otros, en comparacion con otros medios de cultivo como DMEM y DMEM/F12 (27).

Aun cuando las condiciones de nuestros cultivos eran muy similares a las descritas previamente (9, 25), las proporciones de celulas no neuronales obtenidas en el presente estudio fueron mas altas que las reportadas. No obstante, la poblacion neuronal cuantificada por nosotros represento mas de la mitad de la poblacion celular total, constituyendo asi la mayoria de la poblacion celular (dependiendo del estadio temporal) lo que permitio realizar las observaciones planteadas.

Estas diferencias pueden explicarse dado el delicado equilibrio de aminoacidos, factores de crecimiento y otras moleculas, factores de los cuales dependen estos cultivos, a pesar de haber utilizado los procedimientos, medios y suplementos recomendados, diferencias entre las especies de ratas usadas, reactivos de diferentes casas comerciales o numeros de lote pudieran explicar las diferencias reportadas en este estudio. Es importante senalar que, similar a estudios previos, estos cultivos se mantuvieron en ausencia de inhibidores mitoticos ya que su inclusion comprometia el buen estado de las neuronas. Ademas, la presencia de glia en los cultivos puede resultar beneficiosa si se tiene en consideracion que las neuronas no estan aisladas en el cerebro, las celulas gliales tienen una funcion critica en el establecimiento de la histoarquitectura neuronal (31, 32). Otro aspecto importante de nuestro estudio fue la presencia de una proporcion de celulas (15-38%) las cuales no reaccionaron positivamente a los anticuerpos para GFAP o MAP2. En este sentido, es oportuno mencionar que el anticuerpo para GFAP solo reconoce a los astrocitos tipo I y II y a las glias radiales mas no a las glias del tipo de los oligodendrocitos (33-35). Resultados preliminares de experimentos actualmente en curso parecieran indicar que esa poblacion celular, no identificada en nuestro estudio, esta representada por oligodendrocitos y sus precursores (Garcia, 2009, comunicacion personal).

Nuestras observaciones con respecto a la polaridad de la neurona, mostraron que durante los primeros dos dias de cultivo, esta estaba comenzando a definirse; en este periodo observamos ambiguedad en el marcaje de dendritas y axones. A partir del tercer dia observamos que el marcaje de MAP2 se hizo exclusivo para el arbol dendritico mientras que el de SMI35 lo hizo para el axon, observaciones similares han sido reportadas ampliamente en la literatura (9, 36, 37).

La proteina MAP2, se encuentra exclusivamente asociada al arbol dendritico de las neuronas mas no a los procesos axonales (26, 38-40). El SMI35, por su parte, reconoce neurofilamentos fosforilados presentes solo en los axones (9, 40, 41). La composicion molecular de los microtubulos dendriticos y axonicos muestra diferencias asi como tambien en sus neurofilamentos, de esta manera es posible diferenciar las estructuras dendriticas y axonales (42, 43). Igualmente, otros autores reportan que la composicion molecular del citoesqueleto axonal y dendritico es similar en los primeros estadios del cultivo (40).

Otro aspecto estudiado fue el crecimiento de las neuritas, a partir de las primeras 24 horas se desarrollaron normalmente (Fig. 3). En la primera semana se observo una longitud para las dendritas, medidas desde el cuerpo celular, superior a las 200 [micron]m, durante la segunda semana la longitud de dichas estructuras se incremento a valores cercanos a las 600 [micron]m. En este sentido se ha reportado que el crecimiento de las dendritas a partir del cuerpo celular, de manera radial, oscila alrededor de 300 [micron]m en la primera semana de cultivo (9). Para la tercera semana de cultivo (21 dias) observamos una tendencia leve a la disminucion de la longitud de las dendritas, esto quizas se debe a la perdida de estabilidad en las moleculas que conforman el citoesqueleto de estas estructuras mostrando un marcaje que evidencia estructuras con menor longitud que el estadio anterior. Este resultado no pareciera implicar una retraccion de los procesos neuronales o perdida de fragmentos, mas bien pareciera estar relacionado a una menor afinidad por parte de las proteinas presentes en la neurita hacia el anticuerpo utilizado para su visualizacion. Una de las razones alegadas a este fenomeno es el desarrollo de microglias que liberan citoquinas que resultan neurotoxicas lo que conlleva a un menor rendimiento del cultivo neuronal (9).

Ademas de la polaridad neuronal y del aumento de la longitud de las neuritas, observamos un incremento gradual del numero de dendritas por celula con respecto a un unico axon (Fig. 3). De la misma manera observamos que tanto las dendritas como el axon de cada celula muestran una ramificacion de sus estructuras en pro de la formacion de complejas redes sinapticas, resultados similares han sido ampliamente reportados en la literatura (9, 41, 44).

Otro importante aspecto estudiado para medir la maduracion neuronal, fue el seguimiento de la aparicion de las vesiculas sinapticas, en vista de que el cambio en la densidad de estas vesiculas y su distribucion sobre las estructuras celulares durante el cultivo agregaria informacion sobre la madurez funcional de las neuronas. Al inicio del cultivo (1-2 dias) la densidad de vesiculas (Numero de vesiculas/ 5 [micron][m.sup.2]) fue menor a 1 y cuando se observaban era principalmente alrededor del soma, mientras que en estadios mayores del cultivo (15-21 dias) se observo un incremento gradual en densidad de vesiculas en los contactos sinapticos sobre las dendritas. Estas observaciones concuerdan con resultados previos, en los cuales las vesiculas sinapticas se encontraban en mayor densidad en los extremos de los axones en contacto con dendritas o somas de otras neuronas a medida que avanzaba el proceso de maduracion neuronal (45, 46). La acumulacion de las vesiculas aca observadas, deberia corresponder a las conexiones pre-sinapticas de los axones que han realizado contacto efectivo con dendritas y somas de neuronas postsinapticas, lo cual se ha sido descrito en otros estudios (45, 47).

Teniendo esto en cuenta, la observacion de sinaptofisina en los cultivos neuronales permite correlacionar el incremento en la densidad de vesiculas con la maduracion funcional de estas neuronas, cuya caracteristica distintiva es la acumulacion de vesiculas sobre los procesos celulares (48, 49). Los axones y las dendritas en cultivo muestran la formacion de sinapsis que exhiben una polaridad sinaptica normal, los axones son predominantemente pre-sinapticos mientras que las dendritas son post-sinapticas (45, 50). El mecanismo mediante el cual se forman y se mantienen las sinapsis durante el desarrollo de las redes neuronales es de suma importancia en el estudio del funcionamiento de las celulas del sistema nervioso (45). Segun lo anterior se puede concluir que mediante el reconocimiento de ciertas proteinas sinapticas con la utilizacion de anticuerpos especificos, se puede cuantificar el cambio de densidad de vesiculas sinapticas en las celulas del cultivo, lo que permite inferir el cambio de actividad sinaptica durante el desarrollo de estas celulas, asi como la maduracion funcional de la neurona.

Finalmente, se estudiaron los cambios que experimentaron los conos de crecimiento durante el desarrollo in vitro. El marcador utilizado para la observacion de estas estructuras, Faloidina-Rodamina, pertenece a una familia de marcadores fluorescentes que presentan afinidad con los filamentos de actina presentes en los conos de crecimiento. En este estudio se observo que al principio del cultivo la mayoria de los conos estaban cerrados y a medida que maduraba el cultivo esta situacion se revertia con una disminucion del porcentaje de conos cerrados y el concomitante aumento en la proporcion de conos abiertos. Nuestros resultados concuerdan con publicaciones previas (51-56), en las que reportan que luego de las primeras 24 horas de cultivo se observa, en las celulas establecidas en el sustrato, el inicio del desarrollo de las neuritas unido a la presencia de conos pequenos y abundantes, condicion que cambia con la maduracion del cultivo y el consecuente aumento de sus neuritas, observando entonces mayor cantidad de conos abiertos. El fenomeno de apertura y cierre de los conos de crecimiento podria deberse a una respuesta a los movimientos realizados por estas estructuras para permitir la elongacion de las neuritas (51, 52).

De esto ultimo podriamos inferir que los conos cuando estan cerrados pudieran experimentar cambios a nivel de la membrana celular para favorecer el crecimiento de las neuritas. A medida que la necesidad de dicho crecimiento aumenta la membrana del cono seria capaz de expandirse para incrementar las superficies de contacto funcional y el movimiento en busqueda de blancos para las conexiones neuronales, lo cual seria posible solo con la apertura de los conos.

De lo descrito aqui deriva la gran importancia de estudiar los conos de crecimiento y su morfologia, estas estructuras estan compuestas por una red de filamentos de F-actina en su zona apical y areas globulares de G-actina en la base, ambas estructuras presentan polaridad que determinan la orientacion del cono (53). En la periferia de los conos existe una organizacion dinamica de los filamentos de actina resultando en dos estructuras claramente diferenciables denominadas lamelipodia y filopodia, conformando la region P (53). La translocacion de las moleculas de actina producto de la despolarizacion y/o desensamblaje de la G-actina resulta en el movimiento caracteristico de los conos de crecimiento llamado flujo retrogrado de la actina, que permite el desplazamiento hacia delante de la neurita o la retraccion de la misma (51, 53).

Durante el desarrollo del cultivo neuronal los conos de crecimiento guian el crecimiento de las neuritas hacia el blanco apropiado, adicionalmente estos son precursores de los terminales sinapticos y de la neurosecrecion, ademas de producir profundos cambios estructurales para el posterior reconocimiento funcional de estas estructuras (54). Durante estos procesos el cono de crecimiento se convierte en un terminal estable capaz de estimular o inhibir senalizacion quimica celular (51). El movimiento de los conos se caracteriza por cambios en la region periferica region P y por movimientos en forma de olas retrogradas organizadas, con una tasa de movimiento de 3-6 [micron]m/min (51). En cuanto a los cambios morfologicos de los conos, producto de los movimientos descritos anteriormente, en pro de la formacion de redes neuronales, otros reportan que su morfologia responde a senales de atraccion y repulsion generadas por las proteinas presentes en la matriz extracelular (54). Tambien se propone que la elongacion de las neuritas no solo depende del alargamiento del citoesqueleto sino tambien de la insercion de membrana recien sintetizada en el cono (55). Dicha expansion de la membrana esta acompanada por la fusion de vesiculas sinapticas con la superficie de la membrana plasmatica, lo cual contribuye tambien con la elongacion de las neuritas (56).

Para concluir, podriamos mencionar que el presente trabajo representa un avance en la caracterizacion morfometrica de los cultivos neuronales, puesto que recoge de manera simultanea y cuantitativa los principales aspectos que marcan el proceso de diferenciacion neuronal. En este estudio, la medicion de estas caracteristicas morfologicas hizo posible establecer parametros cuantitativos que ayudaran a identificar de manera mas precisa las diferentes etapas del proceso de diferenciacion neuronal.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer a la Lic. Lisbeth Garcia y al Sr. Jorge Nunez por su colaboracion con las tecnicas quirurgicas y diseccion. Tambien a la Fundacion Instituto de Estudios Avanzados IDEA, por su apoyo en la consecucion de los fondos para esta investigacion.

Recibido: 30-10-09. Aceptado: 03-06-10.

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Gisselle Correa [1,2] y Marines Longart [1].

[1] Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina Molecular, Instituto de Estudios Avanzados, Caracas y [2] Decanato de Estudios Profesionales, Universidad Simon Bolivar. Sartenejas, Baruta, Venezuela.

Autor de correspondencia: Marines Longart. Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina Molecular, Instituto de Estudios Avanzados. Apartado 17606. Caracas 1015A, Venezuela. Tlf: +58-212-9035191, Fax: +58-212-9035118. Correo electronico: mlongart@idea.gob.ve
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Author:Correa, Gisselle; Longart, Marines
Publication:Investigacion Clinica
Article Type:Perspectiva general del procedim
Date:Dec 1, 2010
Words:7745
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