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Analisis digital de imagenes para la caracterizacion microscopica de parametros criticos en la produccion fermentativa de metabolitos secundarios.

Introduccion

El crecimiento de la industria biotecnologica se ha basado de manera importante en el uso de hongos filamentosos como fuente principal de enzimas y metabolitos como antibioticos, acidos organicos, pigmentos y otros aditivos alimentarios. Su capacidad para producir metabolitos de alto valor agregado a partir de materias primas de bajo costo ha impulsado un gran esfuerzo de investigacion tanto en el mejoramiento de cepas mediante tecnicas de biologia molecular como en la optimizacion de los procesos de produccion. Asi, en 1996 el mercado mundial de antibioticos era de 23 billones de dolares, de los cuales el 77% fue producido por microorganismos filamentosos (Demain, 1999).

Por otra parte, a partir de la decada de los ochenta, se ha llevado a cabo una busqueda sistematica de drogas con actividades biologicas diferentes a la antibiosis. Asi, se desarrollaron tecnicas para la seleccion de cepas productoras de metabolitos con actividades antitumorales, antihipersensitivas, inmunoestimulantes, antidiarreicas y antimutagenicas. Entre estos, las ciclosporinas inmunosupresivas y las mevaloninas (con actividad antihipersensitiva) son dos de los metabolitos mas importantes con aplicaciones farmaceuticas, producidos por hongos, descubiertos a finales del siglo pasado. Aunado a lo anterior, el desarrollo de las tecnicas de la ingenieria genetica y la biologia molecular ha colocado a los hongos filamentosos en una posicion privilegiada en el desarrollo de procesos comerciales de frontera, principalmente en la produccion de proteinas heterologas de uso farmaceutico. Lo anterior permite afirmar que se acerca una segunda "edad de oro" para la produccion de metabolitos secundarios a partir de cultivos de hongos filamentosos.

Los hongos filamentosos

Los hongos filamentosos son microorganismos que crecen formando redes tridimensionales compuestas por filamentos (hifas) de pared celular rigida y gruesa (figura 1). El crecimiento de las hifas se lleva a cabo en la region apical (puntas). Cuando una nueva punta se forma, esta crece hasta alcanzar una cierta longitud donde, en funcion de las condiciones ambientales, puede llegar a formar otra punta (ramificacion). Durante su crecimiento enfermentadores agitados mecanicamente, los hongos desarrollan dos tipos de morfologia ex-trema: pellets o agregados de hifas compactos semiesfericos (en donde limitaciones nutricionales hacia el centro del pellet representan la restriccion principal de crecimiento), y aquella filamentosa o de micelio disperso donde el incremento en la viscosidad del caldo de cultivo conduce a la formacion de gradientes nutricionales dentro del biorreactor (fermentador). Asi, la morfologia desarrollada por los cultivos miceliares influye en la productividad de los procesos. Particularmente, se ha sugerido que los pellets favorecen la produccion de metabolitos asociados al creci-miento, mientras que el crecimiento filamentoso (debido a una mayor diferenciacion celular) fa-vorece la biosintesis de metabolitos secundarios. En este sentido, el crecimiento filamentoso ha sido reportado como favorable para la produccion de diversos antibioticos y enzimas.

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Complejidad de los caldos de cultivo para la produccion de metabolitos secundarios por hongos filamentosos

Muchos procesos de las industrias quimica, de alimentos y farmaceutica requieren de la dispersion de una fase inmiscible en una fase acuosa. Entre los liquidos inmiscibles que mas se utilizan, como sustrato o como fase inmiscible para extraer, concentrar o eliminar efectos toxicos, estan los aceites. Tal es el caso de la produccion por procesos de fermentacion de antibioticos y otros metabolitos liposolubles de interes comercial. Por otra parte, como se menciono, la dispersion gas-liquido es tambien una operacion muy importante en las fermentacio-nes aerobias, donde es necesario dispersar efi-cientemente el aire al cultivo para satisfacer la demanda de oxigeno del microorganismo con el fin de que este desarrolle adecuadamente sus actividades metabolicas.

El proceso de homogenizacion de las fases se complica en el caso de fermentaciones con hongos filamentosos, donde la fase solida es tambien hidrodinamicamente importante ya que la biomasa miceliar hace al caldo de cultivo altamente viscoso. En estos procesos, la productividad generalmente esta limitada por el mezclado (liquido-liquido (figura 2), gas-liquido y solido-liquido-gas), que a su vez determina la transferencia de nutrientes y, en consecuencia, la productividad del proceso.

Derivado de lo anteriormente expuesto, es clara la extrema complejidad de las interac-ciones liquido(medio acuoso)-liquido(aceite)solido(hongo)-gas(aire) presentes en los cultivos miceliares para la produccion de antibioticos y metabolitos secundarios. Gran parte de los estudios encaminados a lograr un mejor entendi-miento de estos fenomenos y sus implicaciones en la fisiologia y la productividad de los proce-sos han sido enfocados desde un punto de vista macroscopico; es decir, se ha estudiado el efecto de las variables del proceso (agitacion, pH, tem-peratura, tension superficial, etc.) sobre la pro-ductividad de los cultivos miceliares. Lo anterior ha conducido a que diferentes autores lleguen a conclusiones muchas veces contradictorias y, finalmente, demasiado sistema-especificas, lo que ha impedido que puedan aspirar a tener una aplicacion mas generalizada.

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Recientemente, y con el avance de la capacidad de computo de los sistemas personales, se ha visto un surgimiento del uso de sistemas de analisis de imagenes para el estudio de los fenomenos de dispersion y mezclado en sistemas modelo liquidoliquido-gas. Esto ha abierto una via importante en el estudio de los mecanismos de transporte de nutrientes en sistemas de fermentacion complejos. Sin embargo, la mayoria de los trabajos hasta ahora disponibles en la literatura se han limi-tado a sistemas de dos fases (liquido-liquido o liquido-gas) que no son representativos de la complejidad real en sistemas de fermentacion. Ademas, estos sistemas han sido caracterizados mediante analisis bidimensional de imagenes y, debido a la limitada infraestructura hasta ahora utilizada, solo en zonas muy especificas del tanque. Para resolver estas limitaciones, el trabajo aqui resumido constituye un esfuerzo pionero hacia el desarrollo de una herramienta sin precedentes para el estudio, !n situy en tiempo real, de lo que ocurre a nivel microscopico en un biorreactor con un caldo de fermentacion de alta complejidad (hasta 4 fases).

Modelo de estudio: produccion de 6 gentil--a pirona por Trichoderma sp.

La 6-gentil-a-pirona (6PP) es una lactona (monoester ciclico) insaturada, de 10 carbonos, ligeramente hidrofobica, que presenta actividad fungicida sobre un amplio rango de fitopatogenos, y recientemente se ha reportado su efectividad contra el hongo Tnchophyton rrubrrum (Omero et al., 2004), responsable de infecciones dermicas (unas) en el ser humano. Estas infecciones son particularmente dificiles de erradicar mediante tratamientos convencionales (utilizando derivados de alilaminas y azoles administrados oralmente) que ademas presentan danos en el higado como efectos secundarios.

La produccion de la 6PP por hongos del genero Tnchoderma fue reportada por primera vez en 1972. La sintesis quimica de esta mo lecula requiere de 7 etapas de reaccion y de temperaturas extremas de hasta 490 [degrees]C, por lo que su sintesis por via microbiana (en donde las condiciones de operacion no son tan extremas) representa una alternativa atractiva desde el punto de vista economico. Sin embargo, el mayor cuello de botella para desarrollar un proceso economicamente viable ha sido la toxicidad de la molecula hacia el microorganismo productor. Nuestro grupo de trabajo ha estudiado diversas estrategias para incrementar la produccion de 6PP (metabolito inhibitorio para el microorganismo productor) en cultivos de Tnchoderrma har.Zianum. Inicialmente se implemento la recuperacion in situ de la molecula en el caldo de fermentacion mediante el uso de hexadecano como fase organica extrayente de la 6PP (SerranoCarreon et al., 2002). Mediante esta estrategia se logro incrementar la produccion de la molecula debido a la disminucion de la toxicidad en el caldo. Por otra parte, en muchos cultivos de hongos filamentosos se ha demostrado la existencia de condiciones hidrodinamicas optimas para el crecimiento o la produccion de un metabolito dado, evidenciando una relacion en forma de campana entre la productividad y la energia suministrada (Galindo et al., 2004). En este sentido, se ha demostrado (a nivel macroscopico) que la produccion de la 6PP es funcion de la hidrodinamica presente dentro del fermentados y responde a un cambio en el metabolismo de la fuente de carbono (Bocha-Valadez et al., 2005). Sin embargo, es importante mencionar que en este sistema tan complejo y dinamico, las relaciones entre la hidrodinamica, la dispersion y el transporte de nutrientes, la fisiologia del microorganismo y la productividad de los procesos estan muy lejos de estar plenamente entendidas.

Nuestro proyecto se ha enfocado a la caracterizacion fina y detallada de estos aspectos, usando tecnicas de analisis de imagenes que hemos desarrollado y adecuado para ese fin. Por una parte, se desarrollo una metodologia para la cuantificacion de la viabilidad del hongo que permitio estudiar el efecto de la hidrodinamica sobre la fisiologia del microorganismo y la productividad del proceso. Por otra parte, se desarrollo un sistema de adquisicion y analisis digital de imagenes para la caracterizacion in situ, en dos y tres dimensiones, de los fenomenos de transporte de nutrientes en cultivos miceliares complejos de hasta 4 fases (medio acuoso-fase organica extrayenteaire-hongo). Estas tecnicas, y su aplicacion, se encuentran en la frontera del conocimiento y han permitido entender los mecanismos que gobiernan el transporte de nutrientes -a nivel microscopico- en los procesos de fermentacion involucrados en la produccion de metabolitos secundarios por hongos filamentosos y, con ello, abren una puerta para el mejoramiento de tales procesos sobre bases cientificas. Este trabajo presenta un resumen del desarrollo y la aplicacion de estas metodologias, asi como las principales aportaciones cientificas derivadas del mismo.

Desarrollo de las metodologias utilizadas

Caracterizacion ex-situ de la viabilidad del hongo

Para la cuantificacion de la viabilidad del hongo se desarrollo una tecnica fluorescente basada en el hecho de que las celulas metabolicamente activas son capaces de hidrolizar intra-celularmente el diacetato de fluoresceina (FDA) produciendo la fluoresceina, compuesto que al fluorescer permite cuantificar el porcentaje de celulas viables en los agregados celulares. Esta metodologia, unica reportada para cuantificar la viabilidad de un cultivo miceliar, no podria haber sido implementada sin la ayuda de una metodologia de analisis de imagenes ad hoc. La metodologia desarrollada, ademas de precisa, permite llevar a cabo la cuantificacion de la via-bilidad de un cultivo miceliar de manera muy rapida y casi automatica (Hassan et al., 2002).

Para llevar a cabo esta cuantificacion es necesario tomar una muestra del caldo de cultivo y adicionar una solucion de diacetato de fluoresceina para lograr una concentracion final de 7,5 [micro]g/mL. Esta suspension se incuba a temperatura ambiente durante 5 min y parte de ella es colocada en un portaobjetos para su observacion al microscopio. Las imagenes digitales provenientes de la camara fueron digitalizadas. Utilizando este sistema, cada toma fue adquirida dos veces: la primera utilizando luz blanca con el fin de adquirir el area total de cada agregado; en la segunda adquisicion se utilizo luz ultravioleta para la deteccion del area fluorescente (metabolicamente activa). Al terminar, se enfoco otro campo al microscopio para adquirir otro juego de imagenes y asi hasta adquirir de 90-120 agregados diferentes.

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Como se menciono, se generaron dos archivos para el procesamiento de las imagenes (uno con luz blanca y otro con las imagenes fluorescentes). Las imagenes obtenidas fueron procesadas para corregir la heterogeneidad del fondo y eliminar ruido para su posterior segmentacion. Se logro la deteccion adecuada de los bordes del hongo, maximizando la separacion entre pixeles oscuros (correspondientes al hongo), y los pixeles claros (correspondientes al fondo).

El porcentaje de la biomasa activa (viabilidad) fue calculado como la proporcion del area tenida (en la imagen fluorescente) entre el area total detectada en la imagen con luz blanca. Un ejemplo de las imagenes (antes del procesa-miento) se muestra en la figura 3.

Caracterizacion in situ de los fenomenos de transporte

Configuracion general del sistema y descripcion de sus capacidades

Uno de los principales problemas que presenta el monitoreo en linea computarizado de las dispersiones que ocurren dentro de un cultivo microbiano en un fermentados bajo condiciones de agitacion mecanica, es la dificultad en la adquisicion de imagenes de alta calidad de los eventos microscopicos que ocurren a altas velocidades en el tanque. El problema es mas complejo cuando se requiere analizar zonas mas profundas del biorreactor (como por ejemplo las zonas mas cercanas a los impulsores), ya que las condiciones de iluminacion y de velocidad son aun mas criticas. Mas aun, los fenomenos dinamicos que ocurren en el tanque generan estructuras complejas, como por ejemplo gotas de la fase aceitosa que contienen en su interior fracciones de otras fases (como agua y aire), las cuales son imposibles de caracterizar con precision con metodos tradicionales de analisis de imagenes en dos dimensiones.

Con base en estos requerimientos, desde hace varios anos nuestro grupo de trabajo ha estado trabajando en el diseno de un sistema de analisis de imagenes original, que permita la caracterizacion cuantitativa de las dispersiones que ocurren dentro de un fermentador modelo, tanto en dos como en tres dimensiones. A continuacion se describen las configuraciones principales del sistema de analisis de imagenes disenado, el cual ha permitido resolver los problemas antes mencionados.

Adquisicion micro-estereoscopica de imagenes en dos y tres dimensiones del interior del biorreactor

La figura 4 muestra la configuracion para analisis en dos y tres dimensiones, que se puede llevar a cabo en zonas cercanas a la pared del tanque. El sistema consta principalmente de un tanque "modelo" de vidrio de 10 litros, montado en un soporte, alineado axialmente con una turbina de mezclado que administra potencia al sistema. De manera externa, se monto un soporte que sostiene un estereomicroscopio. El sistema incluye una fuente de iluminacion estroboscopica, la cual fue sincronizada a dos camaras de TV a traves de un dispositivo electronico construido por nosotros. De esta manera, las particulas que se mueven a alta velocidad en el tanque de mezclado son captadas unicamente durante el centelleo de la luz estroboscopica (10 microsegundos), lo que permite obtener imagenes "no movidas" de alta calidad de los eventos que ocurren en el tanque (descrito en detalle en Taboada et al., 2003). Esta luz es transmitida al interior del tanque por medio de una guia de luz de fibra optica, la cual es alineada con el punto focal de las camaras de TV Es importante hacer notar que la distorsion que produce la pared cilindrica del tanque es corregida con una chaqueta cubica llena de agua, instalada entre el tanque y las camaras de TV Al sistema se le suministra oxigeno, mediante burbujas de aire a traves de un difusor. La figura 5 muestra ejemplos de imagenes de alta calidad adquiridas en dos dimensiones, mostrando diferentes fenomenos.

Para la adquisicion de imagenes en tres dimensiones, el estereomicroscopio fue mecanicamente modificado para poder instalarle dos camaras de TV en los oculares del mismo. Cabe hacer notar que los estereomicroscopios comerciales solo tienen capacidad para una sola camara de TV (observacion de solo una de las dos imagenes del par estereoscopico). De hecho, estos equipos estan disenados para poder tener el efecto tridimensional visual solo a traves de los oculares del microscopio y no a traves de equipo electronico. Las camaras de TV estan conectadas a una sola tarjeta de adquisicion de imagenes RGB (instalada en una computadora de tipo personal), de tal manera que una de ellas esta conectada al canal rojo y la otra a los dos canales restantes verde y a.Zul. De esta manera, obtenemos una imagen estereoscopica combinada en rojo y cyan (figura 6) (descrito en detalle en Corkidi et al., 2008), la cual puede ser observada con efecto tridimensional a traves de lentes especiales.

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Deteccion automatica (segmentacion) de particulas esfericas (gotas de aceite, burbujas de aire)

Una vez solucionado el problema de la adquisicion de las imagenes, la dificultad por resolver es la deteccion (segmentacion) de las gotas y burbujas de las imagenes adquiridas. En general, la segmentacion automatica es una de las tareas mas complicadas dentro del monitoreo de la dispersion de fases, caracteristica que en ultima instancia lleva al exito o fracaso del proceso de analisis.

La segmentacion de las gotas y burbujas resulta compleja debido a la diversidad de objetos y artefactos que se pueden presentar en un campo dado, el traslape, el contraste hete-rogeneo y la similitud entre ellos. Debido a estos problemas, los metodos de segmentacion tradicionales no funcionan para discriminar los objetos de interes de la imagen ya que los objetos no tienen un brillo uniforme e incluso tienen regiones de la misma luminosidad del fondo.

Para resolver este problema de segmentacion disenamos un metodo basado en la transformada de Hough (descrito en Taboada et al., 2006). Un proceso global es aplicado previamente a las imagenes para poder llevar a cabo la segmentacion por Hough, tal como se muestra en la figura 7. Despues de la aplicacion de varios filtros digitales, se obtiene finalmente una imagen que contiene segmen-tos de arco que corresponden a secciones de bordes de los objetos de interes, en este caso, burbujas de aire (en negro) y gotas de aceite (semi-transparentes).

[FIGURA 7 OMITIR]

Una vez filtradas las imagenes, se implemento un algoritmo conocido como la trans-formada de Hough (1962), el cual se puede utilizar para el reconocimiento de objetos de cualquier tipo de estructura definida por una funcion matematica simple como es el caso de circulos, curvas o arcos, por mencionar algunos. La idea basica es mapear los pixels de los segmentos detectados hacia un espacio transformado definido, de tal manera que los pixels pertenecientes a la curva o borde de interes se proyecten sobre un mismo punto en ese espacio (figura 8). Si en la imagen hay presentes muchos pixels que pertenecen todos a la misma curva, ellos daran origen a un pico en el espacio de Hough. La transformada de Hough es utilizada para la deteccion de los contornos de las burbujas por medio de la busqueda de sus circunferencias. La figura 9 muestra algunos ejemplos de la segmentacion lograda en 2, 3 y 4 fases, utilizando la metodologia descrita.

[FIGURA 8 OMITIR]

Analisis tridimensional de particulas

En procesos de fermentacion multifasicos de interes farmaceutico, caracterizados con tecnicas de analisis de imagenes, se han observado interacciones muy complejas entre las fases (aire, agua, aceite, biomasa) y la formacion de estructuras que contienen burbujas de aire y lo que parecen ser pequenas gotas de la fase acuosa atrapadas en gotas de aceite (figura 10). Con las tecnicas actuales no es posible establecer en forma rigurosa si estas estructuras es-tan incluidas (o solo se traslapan) con las gotas de aceite. Por tanto, desarrollamos un metodo de adquisicion y de analisis de pares de ima-genes estereoscopicas dentro de cultivos para determinar la posicion tridimensional relativa de particulas dentro del fermentador modelo, a partir de las imagenes estereoscopicas adqui-ridas con dos camaras de video. Se utilizaron algoritmos para el calculo de profundidades relativas entre burbujas o gotas con el fin de discernir si provienen de planos diferentes o si estan fisicamente unas dentro de otras.

El sistema de analisis se baso en el mismo principio que el de los ojos humanos con los cuales logramos ver los objetos cotidianos en tres dimensiones, esto debido a la interpretacion que hace el cerebro de las imagenes provenientes de los dos ojos. Estas dos imagenes no son iguales: representan la misma escena pero vista desde un angulo diferente. Estas pequenas diferencias son las que dan el efecto de profundidad. En nuestro caso, obtenemos estas condiciones con el microscopio: los dos oculares estan separados con la ayuda de un sistema optico por un angulo muy pequeno, pero suficiente para tener dos escenas con pequenos detalles distintos. Asi, podemos establecer cuantitativamente la profundidad (como se describe en detalle en Corkidi et al., 2008). La figura 11 muestra una secuencia de imagenes generada a partir de una escena real.

[FIGURA 9 OMITIR]

[FIGURA 10 OMITIR]

Con los datos tridimensionales obtenidos con el sistema, una escena real es rotada sobre el eje vertical, mostrando como objetos que aparecen aparentemente traslapados en un cierto angulo de vista, no lo estan en la realidad, haciendo evidente el error que se introduce en observaciones donde no se utilizan tecnicas tridimensionales.

[FIGURA 11 OMITIR]

Metodo optico para discernir sobre particulas traslapadas

Como se menciono, se ha observado la formacion de estructuras complejas o gotas de aceite, dentro de las cuales puede haber atrapadas, tanto burbujas de aire como lo que parecen ser pequenas gotas de la fase acuosa (figura 10), principalmente en presencia de agentes tensoactivos. Esto hablaria de una dispersion multiple donde no solo se favorece la inclusion de burbujas de aire dentro de las gotas sino que-durante la coalescencia de las gotas- tambien se incluyen pequenas gotas de la fase continua dentro de las gotas de aceite.

Ademas del sistema tridimensional des-crito anteriormente, el cual permitio calcular por metodos estereoscopicos la posicion espacial de cada particula, y por tanto discernir sobre su inclusion real dentro de otra particula, disenamos otro metodo optico que permitio establecer de manera precisa la naturaleza de las estructuras complejas (gotas de emulsion multiple) presentes en un sistema de fermentacion modelo (como se describe en detalle en Cordova-Aguilar et al., 2008).

Usando la diferencia entre indices de refraccion de cada fase y las propiedades de formacion de imagenes de los objetos (gotas de aceite, burbujas de aire y agua), fue posible determinar la naturaleza de cada estructura, asi como discernir si estas particulas se encuentran dentro o fuera de las gotas complejas. Fue posible determinar de esta manera que las pequenas particulas observadas dentro de las gotas de aceite pertenecen a la fase acuosa, las cuales son atrapadas junto con burbujas de aire dentro de las gotas de aceite. Esta informacion es de interes basico para entender los mecanismos de transferencia de oxigeno y nutrientes a los microorganismos.

La figura 12 muestra el elemento clave de este metodo, que consiste en un objeto negro no translucido que fue instalado para obstruir la mitad de la ventana de salida de la luz de la fibra optica, de tal manera que se proyecte un patron de luz (mitad blanco, mitad negro) sobre las particulas que se van a evaluar. En funcion de la imagen formada a traves de las diferentes particulas que se comportan como lentes esfericas, y del indice de refraccion de dichas particulas, el patron optico sufrira de in-versiones opticas que serviran para determinar la naturaleza de la particula, asi como si estas se encuentran dentro o fuera de otra estructura. La figura 13 muestra algunas posibilidades de patrones opticos formados en las estructuras complejas, y su significado en cuanto a natura-leza y posicion espacial.

Videoendoscopia de alta velocidad

Los procesos de produccion de metabolitos secundarios por hongos filamentosos son altamente complejos y, por tanto, muy dificiles de caracterizar. En estos procesos se ha obser-vado la existencia de estructuras complejas, las cuales consisten en gotas de aceite que contie-nen una gran cantidad de burbujas de aire y de gotas muy pequenas de agua (como se describe en Lucatero et al., 2003). Este fenomeno se acentua cuando hay concentraciones altas de biomasa, o bien, cuando en el medio existen proteinas, lo que puede modificar la transferencia de oxigeno al cultivo. Este aspecto tiene un efecto muy importante en el proceso de fermentacion ya que el microorganismo, al tener mayor dis-ponibilidad de oxigeno, generalmente maximiza la produccion de metabolitos o biomasa. Has-ta el momento se desconocen los mecanismos por los cuales se forman estas gotas multifasicas. Una hipotesis es la posible ocurrencia de eventos que pudieran influir en dichas formaciones, tales como colisiones gota-burbuja o gota-mice-lio. El primer paso que dimos para empezar a dar respuesta a estos interrogantes fue la implementacion de un sistema capaz de visualizar el proceso de formacion de dichas estructuras, de manera que se puedan conocer los factores que estan participando en su formacion.

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[FIGURA 13 OMITIR]

Hasta el momento, el sistema descrito ha permitido la adquisicion de imagenes en zonas cercanas a la pared del tanque, con base en un montaje externo de las camaras de TV Sin embargo, se tienen evidencias de que la formacion de estructuras complejas ocurre en zonas mas profundas del tanque, probablemente cercanas a la zona de los impulsores. Por esta razon, resulta poco probable poder capturar, en zonas cercanas a la pared del tanque, imagenes que describan las interacciones dinamicas entre las fases dispersas. Ademas, para poder filmar una secuencia de imagenes que permita observar la evolucion de las estructuras en formacion dentro del tanque, no basta la velocidad de una camara de video estandar ya que entre un cuadro de video y otro se pierden los objetos de interes que se mueven a alta velocidad.

Para resolver este problema se implemento un sistema de video-endoscopia de alta velocidad que permite capturar secuencias de imagenes en diferentes zonas del tanque donde se esten generando las estructuras complejas, a fin de abrir la posibilidad para describir y entender los fenomenos que ocurren durante la interaccion dinamica de las diferentes fases.

La figura 14 muestra el sistema disenado para la adquisicion de imagenes. El sistema esta compuesto por una camara digital de video de alta velocidad que permite adquirir hasta 5130 cuadros/segundo de 512 x 512 pixeles. Con esta camara se pueden captar secuencias de imagenes de procesos que suceden a alta velocidad y, ademas, realizar una reconstruccion secuencial de los eventos de interes. Asi mismo, se le acoplo a la camara un boroscopio de prisma oscilante. El uso del boroscopio permitio la captura de secuencias dinamicas de las interacciones de las fases dispersas en diferentes puntos del tanque. La iluminacion se realizo con una fuente de luz Arco Xenon de 180W, directa, y de considerable mayor intensidad a la luz estroboscopica utilizada en el sistema desarrollado anteriormente. La luz se transmite al interior del tanque por medio de una guia de luz de fibra optica, la cual fue acoplada al boroscopio de manera rigida (alineada con su eje optico) de manera que se puedan mover simultaneamente por el tanque, conservando constante una distancia luz-boroscopio. De esta manera se tiene la iluminacion suficiente para capturar imagenes en zonas profundas del tanque. La camara con el boroscopio y la luz fueron colocadas en un tripie para facilitar su manejo por las diferentes zonas del tanque.

Con este sistema se logro la toma de secuencias de imagenes en diversas zonas de turbulencia del tanque. La alta velocidad de ad quisicion (5130 imagenes/segundo) permitio visualizar de manera detallada las estructuras complejas que se forman en estas zonas, como las que se muestran en la figura 15. Para efectos de visualizacion, en esta figura se muestran solo algunos cuadros de la secuencia completa que permite apreciar claramente el movimiento de las estructuras a traves de la zona de enfoque.

Aplicacion de las tecnicas desarrolladas para la caracterizacion de parametros criticos de la fermentacion (viabilidad del hongo y transporte de nutrientes)

Las tecnicas de analisis de imagenes que hemos desarrollado se han usado tanto para caracterizar la viabilidad del hongo Tnchoderrma liar.Zzanum, como para caracterizar la dispersion de las fases involucradas.

Uno de los aportes de mayor relevancia del uso de las tecnicas de analisis de imagenes que hemos desarrollado se refiere a la posibilidad de cuantificar la viabilidad del hongo durante el proceso de fermentacion. Esta metodologia es, hasta el momento, la unica reportada en la literatura, que permite cuantificar de manera rapida y precisa la viabilidad de un cultivo miceliar. La importancia de esto radica en que en todo cultivo miceliar, la productividad de metabolitos esta relacionada con la proporcion de la biomasa viva en un determinado momento en el cultivo (Hassan et al., 2002). De esta manera, utilizando procedimientos de procesamiento de imagenes que permitieron determinar el area de las hifas que fluorescen, respecto al area total de las mismas (tomando dos imagenes, una con luz visible y la otra con luz ultravioleta), fue posible calcular el cociente entre ambas areas y con ello medir experimentalmente la viabilidad de la biomasa, la cual se correlaciono con otros parametros fisiologicos como la velocidad de crecimiento del hongo. Demostramos asi mismo que la relacion de areas (fluorescente/total) permite cuantificar la viablidad sin importar la forma como la biomasa fue tratada para disminuir su viabilidad (por estres me-canico, termico o electromagnetico). Como parte de la aplicacion de esta tecnica se llevo a cabo un estudio de los efectos hidrodinamicos sobre la produccion de la 6-pentil-alfapirona por Trichoderma harzianum. Se estudio el efecto del estres hidrodinamico sobre la produccion de la 6-pentil-alfa-pirona (fungicida) por Tnchoderma liar.Zianum bajo condiciones no limitantes de oxigeno disuelto. De manera general, el aumento en la energia suministrada redujo el diametro de los agregados miceliares (debido a que se favorecio su fragmentacion) y origino cambios en el metabolismo de la fuente de carbono (necesarios para satisfacer los requerimientos energeticos del hongo), los cuales favorecieron, hasta un valor critico, la produccion del metabolito de interes. Demostramos que es posible manipular la velocidad de crecimiento y la productividad de Tnchoderma liar.Zianum (y posiblemente la de otros hongos) a traves de la energia suministrada al cultivo, al inducir cambios en el metabolismo de la fuente de carbono (Rocha-Valadez et al., 2005). Desde el punto de vista tecnologico, se demostro que, manipulando el estres hidrodinamico, es posible inducir el metabolismo secundario de un microorganismo filamentoso. Esto constituye una gran herramienta tecnologica pues la productividad de los procesos con microorganismos filamentosos esta limitada por los largos tiempos de fermentacion usualmente necesarios para que se inicie el metabolismo secundario de estos microorganismos.

[FIGURA 14 OMITIR]

[FIGURA 15 OMITIR]

En lo que se refiere a la caracterizacion de la dispersion de las fases (aceite-aire-hongo), hemos desarrollado un sistema de adquisicion y analisis de imagenes unico en su tipo a nivel internacional, capaz de realizar estudios in situ en dos y tres dimensiones sobre los eventos microscopicos que ocurren en el interior del fermentador. La alta calidad de imagenes obtenida nos permitio observar y registrar fenomenos muy interesantes, por ejemplo, la introduccion de burbujas de aire dentro de gotas de aceite y la presencia de microgotas de agua dentro de las mismas. El descubrimiento de estos fenomenos tiene una gran trascendencia ya que implica el replanteamiento de lo comunmente aceptado sobre el transporte de nutrientes en la fermentacion. La otra tecnica implica el uso de video digital de muy alta velocidad.

Con una camara que puede tomar mas de 5000 imagenes por segundo hemos registrado los eventos que suceden en las dispersiones (principalmente interacciones entre burbujas, gotas de aceite y biomasa miceliar), lo que nos permitira establecer los mecanismos de estas interacciones y colisiones y, con ello, contribuir al entendimiento basico de los fenomenos que ocurren en el fermentados, lo que redundara en un mejoramiento basado en conceptos fundamentales- de los procesos de manufactura de metabohtos secundarios.

Las metodologias que hemos desarrollado nos han permitido analizar varios fenomenos que suceden en los cultivos (Galindo et al., 2005), incluyendo con detalle el analisis del porcentaje de burbujas que se encuentran dentro de gotas (Larralde-Corona et al., 2002), la influencia de la morfologia de la biomasa sobre la dispersion agua-aceite-aire (Lucatero et al., 2003) y el efecto que tiene la presencia de proteinas (y su grado de hidrofobicidad) (Pulido-Mayoral y Galindo, 2004). Hemos demostrado que la morfologia de la biomasa tiene un efecto importante en la dispersion de las fases, sobre todo cuando el hongo crece en forma de agregados laxos. En ese caso, un aumento en la biomasa disminuye los diametros promedio tanto de burbujas de aire como de gotas de aceite. Esto esta en contra de lo que se esperaria al aumentar el contenido de biomasa (debido al incremento de la viscosidad) pero claramente indica que el area disponible para la transferencia de sustratos (que es inversamente proporcional al diametro de las burbujas de gas -oxigeno- y de las gotas de aceite -acidos grasos como fuente de carbono) aumenta conforme el microorganismo se multiplica en el cultivo. Por su parte, cuando la biomasa se encuentra en forma de pellets, practicamente no tiene influencia sobre los diametros de estas estructuras.

De forma tambien relevante hemos podido establecer que un mayor contenido de biomasa (en forma de agregados laxos), o la presencia de bajas concentraciones de proteina aumentan el porcentaje de burbujas que se encuentran dentro de gotas de aceite, llegando a constituir hasta un 60% del total (Lucatero et al., 2003). Este hecho es particularmente relevante ya que la transferencia de oxigeno (de la burbuja al seno del liquido, donde puede ser aprovechado por el microorganismo) es muy complejo, ya que involucra, primero, la difusion del oxigeno de la burbuja de aire al medio aceitoso (que es cerca de 500 veces mas viscoso que el agua, pero que tiene una solubilidad de cerca de 8 veces mas alta que en agua) y luego su difusion de la gota de aceite al seno del liquido. Usualmente, los modelos aceptados de transferencia de oxigeno en fermentaciones solo asumen que la principal resistencia a la transferencia de masa sucede en la interfase gas-agua. En consecuencia, nuestros descubrimientos permitiran explicar mejor los fenomenos que suceden en las fermentaciones multifasicas y, por tanto, proponer mejores modelos de transferencia de oxigeno en estos sistemas.

Impacto tecnologico y perspectivas

El proyecto ha contribuido a entender la influencia de parametros de cultivo relevantes sobre la productividad de cultivos de microorganismos filamentosos. Los resultados obtenidos hasta ahora permitiran establecer estrategias racionales para un desarrollo de procesos eficientes en la produccion de ingredientes activos farmaceuticos. En este trabajo se resumen las metodologias y estrategias de proceso que permiten incrementar la sobrevivencia y la productividad de microorganismos filamentosos productores de metabolitos secundarios. Lo anterior incidira positivamente en la economia del proceso al permitir a los productores de estos metabolitos incrementar su produccion sin necesidad de inversiones adicionales en infraestructura. Por otra parte, el incremento en la productividad de los procesos permitira hacer mas eficiente el uso de la infraestructura de la industria al abrir la posibilidad de utilizar su capacidad instalada para la produccion de otros principios activos.

Desde el punto de vista de la tecnologia desarrollada, el estudio de las interacciones dinamicas entre los componentes del medio de cultivo constituye una herramienta fundamental en el diseno y la operacion de los reactores biologicos para el cultivo de microorganismos filamentosos productores de farmoquimicos. Este trabajo demostro que existen oportunidades muy grandes para la reduccion de costos de los procesos tradicionales de produccion. Entre estas oportunidades esta el uso de impulsores mas eficientes que incrementen la disponibilidad de los nutrientes (oxigeno y aceites) sin dano para el microorganismo. Esto puede incidir positivamente en el desarrollo de nuevos procesos para la obtencion de nuevos productos con tecnologia competitiva, lo que deberia acelerar el desarrollo de la industria farmoquimica.

Cabe mencionar que la mayor parte de los procesos para la produccion de farmoquimicos estan basados en conocer el como ha cerlo ("know-how") pero sin conocer el porque del proceso ("know-why"). Este trabajo propone conocer el porque las variables de proceso influencian la productividad de los cultivos micellares para implementar procesos mas robustos y eficientes. Si bien los retos por vencer son aun importantes, tal vez el mayor de ellos este constituido, particularmente en Latinoamerica, por la pobre interaccion entre la industria y la academia. Sin embargo, del desarrollo de esta interaccion depende en buena medida la competitividad de la industria farmoquimica.

Si bien este trabajo ha permitido alcanzar logros muy relevantes, existen aun retos importantes. Uno de los principales es lograr una caracterizacion profunda de los fenomenos de dispersion en la totalidad del biorreactor. Esto incidira en el desarrollo de modelos precisos que permitan estimar velocidades de transferencia de nutrientes asi como del grado de homogeneidad del proceso. Establecer y validar estos modelos revolucionaria el area de la ingenieria bioquimica tanto en sus aspectos academicos como tecnologicos.

Agradecimientos

Se reconoce y agradece la extensiva colaboracion del doctor Rufino Diaz del Laboratorio de Optica del Centro de Ciencias Aplicadas y Desarrollo Tecnologico (CCADET) de la UNAM. Se agradece el apoyo tecnico de Blanca Taboada, Leticia Vega, Ma. Soledad Cordova y Celia Flores.

Se reconoce la participacion de los doctores Patricia Larralde, Jose A. Rocha, Teddy Voisson, Mainul Hassan, y de los estudiantes Ma. Teresa Brito, Savidra Lucatero, Nancy Pulido, Jean-Baptiste Briere, Othon Escobar, Luz Helena Horita, Suani Velazquez, Eliane Guevara, Itzma Itzel Ruiz y Gabriela Maciel en el desarrollo de las tecnicas y los trabajos de caracterizacion de sistemas de analisis de imagenes que conforman este trabajo.

Recibido: abril 14 de 2008

Aprobado: mayo 21 de 2008

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Gabriel Corkidi (1), Leobardo Serrano-Carreon (2), Enrique Galindo (3)

(1) Unidad de Microscopia Avanzada, Laboratorio de Imagenes y Vision por Computadora, Instituto de Biotecnologia, Universidad Nacional Autonoma de Mexico. Cuernavaca, Morelos, Mexico. corkidi@ibt.unam.mx

(2) Departamento de Ingenieria Celular y Biocatalisis, Instituto de Biotecnologia, Universidad Nacional Autonoma de Mexico. Cuernavaca, Morelos, Mexico. Ieobardo@ibt.unam.mx

(3) Departamento de Ingenieria Celular y Biocatalisis, Instituto de Biotecnologia, Universidad Nacional Autonoma de Mexico. Cuernavaca. Morelos. Mexico. ealindoCfibt.unam.mx
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Author:Corkidi, Gabriel; Serrano-Carreon, Leobardo; Galindo, Enrique
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2008
Words:7212
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