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Analisis de variabilidad genetica en Moniliophthora roreri con AP-PCR y RAPD en Antioquia, Colombia.

INTRODUCCION

El cacao (Theobroma cacao L.) es atacado por hongos patogenos siendo los mas importantes Phytophthora palmivora, Moniliophthora perniciosa y M. roreri (Antunez, 2003; Bateman et al, 2005; Bowers et al, 2001; Crozier et al, 2006; Griffith et al, 2003; Samuels et al, 2006). A nivel mundial se han realizado estudios amplios de diversidad genetica para Phytophthora spp. y Moniliophthora perniciosa, hasta ahora se estan realizando los primeros estudios para M. roreri en America Latina (Aime y Phillips, 2005; Aime, 2006; Evans et al, 2002; Evans et al, 2003a; Phillips, 2003; Phillips et al, 2005; Phillips et al, 2006a; Phillips et al, 2006b).

M. roreri muestra uniformidad genetica en America Central, Ecuador y Peru donde se ha dispersado en forma clonal encontrandose actualmente en una fase invasiva. En Colombia, en la region del Magdalena medio, muestra un alto nivel de variacion genetica (Kennedy y Aime, 2005; Phillips, 2003; Phillips et al, 2006a). La fuente de esta variacion reside en las mutaciones y la reproduccion sexual entre aislamientos en el hospedante silvestre Theobroma gileri que generan un nuevo arreglo de genes, suficiente para responder a la presion de seleccion, lo que explicaria por que M. roreri ha desplazado rapidamente a M. perniciosa en el Peru a pesar de que su presencia en este pais es muy reciente (Evans, 1981; Evans et al, 2003; Phillips, 2003).

En el 2003 se designaron cinco grupos geneticos para M. roreri en America Latina, dos endemicos de Colombia: Grupo Co-oriente restringido al oriente, y Grupo Co-central restringido a la region central, el Grupo Gileri endemico de Ecuador localizado al noroccidente, los dos restantes se encuentran en una fase invasiva, el Grupo Bolivar localizado en el oriente de Colombia (Norte de Santander), periferia de Ecuador, Venezuela y Peru, y el Grupo Co-occidente en el occidente de Colombia, centro de Ecuador, Panama, Costa Rica, Nicaragua y Honduras (Phillips, 2003). De estos cinco grupos geneticos cuatro se encuentran en Colombia excepto Gileri. En Colombia el grupo Co-oriente tiene la mayor diversidad genetica, y el grupo Co-central muestra un grado de variacion importante y parecen estar estrechamente relacionados; estos dos grupos ocupan areas adyacentes aunque con diferentes altitudes, Co-oriente en el Magdalena medio y Co-central en la cordillera Andina Central (Phillips, 2003). Los ultimos estudios de variabilidad genetica en America Latina determinaron tres grupos geneticos para M. roreri con diferentes modelos de distribucion, preferencias de huesped y aparente aislamiento reproductivo entre ellos; un primer genotipo encontrado en Theobroma y Herrania al noroccidente de Sur America, un segundo genotipo en T. gileri al norte del Ecuador, y un tercer genotipo en T. cacao en Centroamerica extendido hacia el norte, responsable de la dispersion reciente y rapida de la moniliasis causada por M. roreri a traves de esta zona (Aime, 2006; Kennedy y Aime, 2005).

La moniliasis esta restringida en Sur y Centroamerica; en algunas areas de Suramerica ha causado perdidas en los cultivos del 60 al 100% (Evans et al, 1978; Evans, 1986; Phillips, 2003; Phillips et al, 2005; Phillips et al, 2006a; Phillips et al, 2006b). En Colombia es la enfermedad mas importante del cacao, restringida al occidente y noroccidente del pais, generando perdidas en produccion de hasta un 60% (Evans, 1981; Espinal et al, 2005). En Antioquia es la enfermedad mas importante del cacao siendo los municipios mas afectados Apartado y Valdivia (Maya et al, 2004). El objetivo de este estudio fue determinar la variabilidad genetica de aislamientos de M. roreri en zonas productoras de cacao en Antioquia con marcadores moleculares RAPD (Random Amplyfied Polymorphism of DNA) y AP-PCR (Arbitraly Primed Polymerase Chain Reaction). Este conocimiento es fundamental para el diseno de estrategias encaminadas al control de la moniliasis, y programas de mejoramiento genetico de T. cacao con la seleccion de genotipos resistentes a las variantes de M. roreri en Antioquia que permitira mejorar las condiciones fitosanitarias de los cultivares de cacao en el departamento.

MATERIALES Y METODOS

Los aislamientos de M. roreri fueron obtenidos de frutos de cacao con sintomas de la enfermedad colectados en doce municipios productores de cacao en Antioquia siguiendo la metodologia empleada por Evans (1981). Como cepas de referencia para el estudio se utilizaron cuatro aislamientos de Colombia, Co2 de Norte de Santander (Grupo Bolivar), Co8 de Antioquia (Grupo Cooccidente), Co11 y Co18 de Caldas (Grupo Co-central) proporcionados por Wilbert Phillips Mora (Phillips, 2003). Cada aislamiento fue cultivado en medio solido agar extracto de malta (50 g/l) hasta obtener su esporulacion, de cada cultivo se preparo una suspension acuosa de esporas (1 x [10.sup.6] esporas/ ml) de la cual se adiciono 1 ml a 100 ml de medio liquido caldo levadura malta (3 g/l extracto malta, 3 g/l extracto levadura, 5 g/l peptona y 10 g/l glucosa), con incubacion en oscuridad total y agitacion constante a 120 rpm por quince dias. Al termino de este tiempo se recupero el micelio producido por filtracion al vacio seguido de liofilizacion por 48 horas, maceracion con nitrogeno liquido y almacenamiento a -20 [grados]C.

El protocolo usado para la extraccion de ADN genomico total fue el descrito por Afanador et al, (1993). La cantidad y calidad del ADN se determino por electroforesis en gel de agarosa al 0,8% en solucion buffer TBE 1X (Tris base PM 121.14--acido borico PM 61,84 y EDTA 0,5 M, pH 8,0) tenidos con bromuro de etidio (0,5 [micron]g/ml) corriendo 4 [micron]l de ADN con 4 [micron]l de buffer de carga a 80 voltios durante 45 minutos. Los productos de la extraccion de ADN se visualizaron en un transiluminador de luz UV, y se obtuvo una imagen de estos en formatos tif y jpg con el software BioDocAnalyze. Las reacciones de amplificacion para los marcadores AP-PCR se realizaron en un volumen final de 20 [micron]l con 1,5 [micron]l de ADN en una dilucion 1:10, 2 [micron]l de dNTP (1,25 mM), 1 [micron]l de cebador (20 pM/ [micron]l), 11,3 [micron]l de agua ultrapura, 2 [micron]l del buffer (10X) de la enzima, 2 [micron]l de Mg[Cl.sub.2] (25 mM) y 0,2 [micron]l de Taq polimerasa (5U/[micron]l) (Afanador et al, 2003; Freeman et al, 1993; Freeman et al, 1995). Estas se realizaron en un termociclador con el programa termico de amplificacion con un ciclo a 95 [grados]C por 5 minutos seguido de 30 ciclos a 95 [grados]C por 30 segundos, 48 [grados]C por 30 segundos, 72 [grados]C por 1,5 minutos, un ciclo de extension a 72 [grados]C por 5 minutos, y un ciclo de almacenamiento a 4 [grados]C por tiempo indefinido. En la tabla 1 se indican los cuatro cebadores tipo AP-PCR evaluados.

Las reacciones de amplificacion para los marcadores RAPD se realizaron en un volumen final de 46 [micron]l, ADN 1:10 4 [micron]l, dNTP (1,25 mM) 8 [micron]l, cebador (10ng/[micron]l), 2,4 [micron]l, agua ultrapura 21 [micron]l, Buffer (10X) 5 [micron]l, MgCl2 (25 mM) 5 [micron]l y Taq polimerasa (5U/[micron]l) 0,6 [micron]l (Andebrhan y Furtek, 1994; Andebrhan et al, 1999). Estas se realizaron en un termociclador con el programa termico de amplificacion con un ciclo a 95 [grados]C por 5 minutos seguido de 42 ciclos a 95 [grados]C por 30 segundos, 36 [grados]C por 1 minuto, 72 [grados]C por 2 minutos, un ciclo de extension a 72 [grados]C por 5 minutos, y uno de almacenamiento a 4 [grados]C por tiempo indefinido (Afanador et al, 2003; Andebrhan y Furtek, 1994; Andebrhan et al, 1999); en la tabla 2 se indican los 49 cebadores tipo RAPD evaluados. Todos los productos de amplificacion, junto con un marcador de peso molecular de 1 kb, fueron corridos en geles de agarosa al 1,5%, tenidos con bromuro de etidio (0,5 [micron]g/ ml) en una camara de electroforesis horizontal a 70 voltios durante 90 minutos, visualizados en un transiluminador de luz UV con obtencion de imagenes de estos con el software BioDocAnalyze en formato tif y jpg.

Con los datos generados por cada tipo de marcador se elaboro una matriz binaria comparando los patrones de bandeo entre los aislamientos designando la presencia de una banda como 1 y su ausencia como 0. Con las matrices generadas se realizo un analisis de agrupamiento mediante el programa NTSYS-pc 2.0 (Rohlf, 1998; Rohlf, 2005), con el metodo de la media aritmetica no ponderada (UPGMA) y el coeficiente de similitud de Dice, se calculo el coeficiente de correlacion cofenetico a cada dendrograma generado a fin de determinar su confiabilidad para representar la matriz de similitud original, y se realizo un analisis de componentes principales para visualizar las interrelaciones entre los aislamientos (Warburton y Crossa, 2000; Warburton y Crossa, 2002). Para estimar la confiabilidad de los grupos geneticos designados en cada dendrograma se calculo el valor Bootstrap (P) (Felsenstein, 1985) de los nodos de cada grupo utilizando el programa WinBoot (Yap y Nelson, 1996) basado en 1000 replicas.

A partir de los datos conjuntos de los dos marcadores, y con el empleo del programa Popgene version 1.31 (Yeh et al, 1997) se estimo la variabilidad genetica en la poblacion asumiendo que esta se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg por el uso de marcadores dominantes en el estudio. Para cada municipio se calculo el porcentaje de loci polimorficos y el indice de Shannon (Shannon y Weaver, 1949); en cada subregion de Antioquia, y en la poblacion total se calculo el porcentaje de loci polimorficos, indice de Shannon, diversidad total de genes (Ht), diversidad de genes de los individuos relativo a su poblacion (Hs) y diferenciacion genetica (Gst) (Nei, 1973), y entre pares de municipios se realizo un analisis de identidad y distancia genetica basado en Nei (1972). Con el programa XLSTAT 2007 para los municipios se calculo el coeficiente de correlacion entre indice de Shannon y porcentaje de loci polimorficos; para las subregiones el coeficiente de correlacion entre indice de Shannon y porcentaje de loci polimorficos, indice de Shannon y diversidad total de genes. Para determinar la distribucion de la variabilidad genetica total entre y dentro de las subregiones, y entre la poblacion de cada municipio, los doce municipios (poblaciones) se agruparon en seis subregiones (grupos): bajo Cauca y norte (Taraza y Valdivia), Uraba (Apartado y Chigorodo), suroeste y oriente (Tamesis y Narino), occidente (Dabeiba y San Jeronimo), Magdalena medio (Puerto Berrio y Maceo), nordeste (Segovia y Remedios); esta estructura de la poblacion se analizo con el Programa Arlequin Ver. 3.1 (Excoffier et al, 2006) empleando el analisis de varianza molecular (Amova) (Excoffier et al, 1992).

RESULTADOS Y DISCUSION

Se obtuvieron un total de 170 aislamientos de M. roreri; el numero de aislamientos para cada municipio se indica en la tabla 3. Con el protocolo de extraccion de Afanador et al, (1993) se obtuvo ADN de un peso molecular superior a 7000 pb. Los cuatro cebadores tipo AP-PCR evaluados generaron patrones de bandas con tamanos que oscilaron entre 250 y 2000 pb, el numero total de fragmentos amplificados fue de 42 de los cuales nueve fueron polimorficos, 12 se obtuvieron con el Oligo 1, 13 con el Oligo 2, ocho con el Oligo 3 y nueve con el Oligo 4. En la figura 1 se presentan los productos de amplificacion obtenidos con los Oligos 1, 2, 3 y 4 para 18 aislamientos. De los 49 cebadores tipo RAPD evaluados el Oligo 8, Oligo 10 y OPA-10 generaron patrones de bandas para todos los aislamientos. Solo los Oligos 8 y 10 fueron evaluados con los aislamientos de M. roreri generando productos de amplificacion que oscilaron entre 500 a 3000 pb. Con el Oligo 8 se obtuvo un total de diez bandas y con el Oligo 10 doce para un total de 22 fragmentos, siete de ellos polimorficos. En la figura 2 se presenta los patrones de amplificacion obtenidos con los Oligos 8 y 10 para 18 aislamientos.

El analisis de agrupamiento para los datos generados con AP-PCR, y a un nivel de similitud de 0,73, resolvio seis grupos geneticos para M. roreri designados como G1 a G6. El calculo del coeficiente de correlacion cofenetico para el dendrograma arrojo un valor de r = 0,86, dando un grado de confiabilidad alto de que este representa la matriz de similitud original. El grupo G1 represento el 96% de la poblacion evaluada, los grupos restantes fueron mas pequenos y los conformaron un numero reducido de aislamientos con coeficientes de similitud entre 0,60 y 0,70. Los aislamientos referencia formaron parte del Grupo G1. Los grupos G5 y G6 mostraron los coeficientes de similitud mas bajos con un valor de 0,46 del grupo que los contenia con respecto a los demas. Estos resultados reflejaron que no existe un patron de agrupamiento entre los aislamientos, y que la poblacion de M. roreri en Antioquia posee una gran similitud genetica con un coeficiente de similitud entre los aislamientos de 0,7 y 1,0. Solo se encontraron coeficientes de similitud moderadamente bajos (0,46) en un numero reducido de aislamientos de Apartado y Dabeiba. En la figura 3 se muestra el fragmento inferior del dendrograma obtenido con el metodo UPGMA mediante marcadores AP-PCR mostrando los grupos G2 a G6.

En el analisis de componentes principales, con los datos generados por AP-PCR, los tres primeros componentes principales explicaron el 27,3, 8,12 y 6,56% de la variacion total respectivamente que, en conjunto, explican el 42% de la variabilidad observada, detectandose una gran similitud genetica entre los grupos G1, G2 y G3 que representaron mas del 96% de la poblacion al observarse una gran proximidad entre los aislamientos que los conforman, una menor similitud genetica entre los grupos G4, G5 y G6, y con el resto de la poblacion al observarse muy alejados entre si y de la gran nube de aislamientos de G1, G2 y G3, mostrando la gran homogeneidad genetica en la poblacion de M. roreri en Antioquia con excepcion de una subpoblacion muy reducida en Apartado y Dabeiba (grupos G4, G5 y G6). En la figura 4 se presenta la representacion tridimensional del analisis de componentes principales para los 170 aislamientos de M. roreri de Antioquia basado en el perfil de bandas generado por los marcadores AP-PCR.

El analisis de agrupamiento para los datos generados con los RAPD resolvio seis grupos geneticos para M. roreri designados como G1 a G6 a un nivel de similitud de 0,70. El calculo del coeficiente de correlacion cofenetico para el dendrograma obtenido arrojo un valor de r = 0,78 indicando un grado de confiabilidad alto de que este representa la matriz de similitud original. El grupo G1 represento el 83% de la poblacion evaluada, los grupos restantes fueron mas pequenos y se conformaron por un numero reducido de aislamientos con coeficientes de similitud entre 0,60 y 0,70. Los aislamientos referencia formaron parte del grupo G1. Los grupos G5 y G6 mostraron los coeficientes de similitud mas bajos con respecto a los demas, con un valor del coeficiente de similitud de 0,57 para el grupo que los contenia. Este analisis revelo que no existe un patron de agrupamiento en la poblacion de M. roreri en Antioquia, y entre los aislamientos de referencia, mostrando una composicion genetica muy homogenea en la poblacion; sin embargo, un numero muy reducido de aislamientos de Apartado y Dabeiba mostraron coeficientes de similitud moderadamente bajos con respecto a los demas aislamientos. En la figura 5 se muestra el fragmento inferior del dendrograma obtenido mediante el metodo UPGMA basado en el perfil de bandas generado con RAPD mostrando los grupos G2 a G6.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

En el analisis de componentes principales con los datos generados por RAPD, los tres primeros componentes principales explicaron el 18,83, 12,25 y 10,56% de la variacion total respectivamente que en conjunto explicaron el 41,64% de la variabilidad total observada detectandose una gran similitud genetica entre los grupos G1, G2, G3, G4 y G5A que representaron el 98% del total de la poblacion de M. roreri, con una correlacion muy estrecha entre estos grupos geneticos ya que los aislamientos que los conformaron se entremezclaron unos con otros siendo dificil discriminar un grupo genetico de otro. Los grupos G5B y G6 mostraron una menor similitud genetica entre ellos y con el resto de la poblacion, representados por dos puntos muy alejados entre si y de los demas grupos.

Con los analisis de componentes principales con AP-PCR se detectaron cuatro aislamientos de Apartado y Dabeiba (A2021, A1024, D031 y D036) y con RAPD se detectaron dos aislamientos de Apartado y Dabeiba (A1024 y D031) que difirieron geneticamente entre si y con el resto de la poblacion. Estos resultados muestran que algunos aislamientos de Apartado y Dabeiba posiblemente estan generando una variabilidad genetica importante en M. roreri al noroccidente de Antioquia; Apartado fue uno de los dos municipios donde se detecto una mayor incidencia de la moniliasis (Maya et al, 2004). En la figura 6 se presenta la representacion tridimensional del analisis de componentes principales para los 170 aislamientos de M. roreri de Antioquia basado en el perfil de bandas generado por los marcadores RAPD.

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

En el analisis de diversidad genetica por municipio, Apartado y Dabeiba mostraron altos niveles de variabilidad genetica con los valores mas altos para el indice de Shannon con 0,304 para Apartado y 0,312 para Dabeiba, y un porcentaje alto de loci polimorficos de 79,03% para Apartado y de 82,3% para Dabeiba, comparado con los demas municipios. Se detecto una correlacion significativa entre el indice de Shannon y el porcentaje de loci polimorficos para los municipios (coeficiente de correlacion de Pearson r = 0,987, P < 0,05). En la tabla 4 se muestran los valores del indice de Shannon y el porcentaje de loci polimorficos calculados para cada municipio. El analisis de diversidad genetica por subregiones mostro que la mayor variabilidad genetica se encuentra en las subregiones occidente y Uraba al noroccidente de Antioquia, a las que pertenecen Dabeiba y Apartado respectivamente. Estas mostraron los valores mas altos para el porcentaje de loci polimorficos (P), indice de Shannon (H') y Diversidad total de Genes (Ht), en las demas subregiones la diversidad genetica fue baja reflejada en los bajos valores para estos mismos estimadores de diversidad genetica, lo que refleja una poblacion de M. roreri geneticamente uniforme en Antioquia a excepcion de Apartado y Dabeiba, donde posiblemente se esta generando una variacion genetica incipiente en M. roreri.

[FIGURA 5 OMITIR]

Para las subregiones la diversidad genetica (H') inferida del indice de Shannon fue mas alta que la diversidad total de genes (Ht), revelando que dicha diversidad esta distribuida entre linajes clonales, atribuida principalmente a la diversidad dentro de las subregiones indicando que los aislamientos difieren geneticamente dentro de estas. La diversidad de genes dentro de la poblacion (Hs) oscilo entre 0,10 y 0,15, y la diversidad de genes total (Ht) oscilo entre 0,12 y 0,19 mostrando que la diversidad genetica fue baja dentro de la poblacion y en las subpoblaciones individuales representadas por las subregiones. Tambien se detecto una correlacion significativa entre el indice de Shannon y la diversidad total de Genes (Ht) (Coeficiente de correlacion de Pearson r = 0,982, P < 0,05), y entre el indice de Shannon y la diversidad de genes dentro de la poblacion (Hs) (Coeficiente de correlacion de Pearson r = 0,951, P < 0,05) para las subregiones.

La diferenciacion genetica (Gst) en las subregiones oscilo entre 0,12 y 0,25 que puede ser atribuida a una reciente introduccion de M. roreri en Antioquia y a una baja presion de seleccion. Estos valores tambien indican que la diversidad genetica en el total de la poblacion se encuentra en las subpoblaciones de M. roreri, y que estas son muy homogeneas entre si. El analisis de diversidad genetica para la poblacion total mostro que los municipios de Apartado y Dabeiba estan aportando la mayor proporcion de variabilidad genetica en la poblacion de M. roreri en Antioquia, ya que los valores para el porcentaje de loci polimorficos, indice de Shannon de diversidad genotipica, y diversidad total de genes disminuyeron en la poblacion cuando estos estimadores se calcularon al excluir estos dos municipios del analisis. En la tabla 5 se indican los valores obtenidos para los estimadores de diversidad genetica en cada subregion, y en la tabla 6 los valores obtenidos para estos mismos estimadores en la poblacion total con y sin Apartado y Dabeiba.

[FIGURA 6 OMITIR]

El analisis de identidad y distancia genetica basado en Nei (1972) entre pares de poblaciones de los municipios reflejo un alto grado de similitud genetica entre los municipios de la region noroccidente de Antioquia -Apartado, Chigorodo y Dabeiba-, con un valor promedio de identidad genetica de 0,976, y los municipios del suroccidente de Antioquia -San Jeronimo y Tamesis-, con un valor de identidad genetica de 0,978. Para el resto de la poblacion los valores de identidad genetica entre los pares de municipios oscilaron entre 0,86 y 0,98 indicando una gran similitud genetica en la poblacion de M. roreri. La mayor distancia genetica se encontro entre los aislamientos de Apartado y Puerto Berrio del occidente y oriente de Antioquia respectivamente, con un valor de distancia genetica entre estos de 0,141, y entre los aislamientos de Dabeiba y San Jeronimo del occidente de Antioquia con un valor de distancia genetica de 0,137. Para el resto de la poblacion la distancia genetica oscilo entre 0,023 y 0,141, mostrando que las poblaciones de M. roreri en la mayoria de municipios de Antioquia tienen muy pocas diferencias geneticas entre si. En la tabla 7 se muestran los valores de identidad y distancia genetica entre pares de poblaciones de los municipios de Antioquia.

Al determinar la distribucion de la variabilidad genetica en la poblacion de M. roreri en Antioquia con AMOVA (analisis de varianza molecular) se encontro que el 5,94% de la variabilidad se atribuye a diferencias entre las subregiones (grupos), el 18,4% a diferencias entre los municipios (poblaciones) dentro de cada subregion, y el 75,68% restante a diferencias dentro de la poblacion de los municipios con la mayor contribucion aportada por Apartado y Dabeiba. Esta distribucion de la variabilidad genetica podria ser explicada por la predominancia de una reproduccion de tipo clonal en M. roreri en Antioquia, y su gran homogeneidad genetica, o al efecto de las diferencias en el tamano de muestra entre los municipios, con un mayor numero de aislamientos en Apartado, Dabeiba y Maceo. En la tabla 8 se muestran los resultados del analisis de varianza molecular entre subregiones, dentro y entre la poblacion de M. roreri en los municipios de Antioquia.

El alto nivel de similitud genetica, y los bajos niveles de diversidad y diferenciacion genetica entre los aislamientos de la poblacion de M. roreri evaluada, donde mas del 95% de la poblacion hizo parte del mismo grupo genetico, muestran que su introduccion en Antioquia es muy reciente, y que su propagacion ha sido en una forma clonal, favorecida por la presencia de condiciones climaticas muy uniformes, y por el tipo de material vegetal utilizado para el establecimiento de los cultivos, hibrido en su gran mayoria. Estos datos son similares a los obtenidos en la caracterizacion morfologica de la misma poblacion (datos no publicados) donde se encontro una gran similitud morfologica entre todos los aislamientos. Tambien estos datos son congruentes con la definicion de los tres grupos geneticos dada por Aime (2006), donde la poblacion de M. roreri en Antioquia estaria relacionada con el genotipo 1 el cual se encuentra distribuido al noroccidente de Suramerica, zona en la cual se encuentra ubicado Antioquia. Ademas, es de anotar que el genotipo 1 de Aime (2006) encierra cuatro de los cinco grupos geneticos definidos por Phillips (2003) a excepcion del grupo Gileri de Ecuador, resultados que concuerdan con los obtenidos en la presente investigacion donde todos los aislamientos de referencia pertenecientes a tres de los cinco grupos geneticos definidos por Phillips (2003) (Bolivar, Co-occidente y Co-central) hicieron parte del mismo grupo genetico G1, el cual represento mas del 95% de los aislamientos de Antioquia.

La estructura genetica de la poblacion de M. roreri en Antioquia difiere de lo reportado por Phillips (2003). La cercania de la zona del Magdalena medio antioqueno con el Magdalena medio santandereano, hizo suponer que los aislamientos procedentes de esta region podrian mostrar la mayor variabilidad y diferenciacion genetica de toda la poblacion, y que los municipios ubicados en las regiones mas distantes geograficamente de esta region, como el noroccidente Antioqueno, mostrarian la menor variabilidad y diferenciacion genetica. Contrario a lo esperado, Maceo y Puerto Berrio en el Magdalena medio en Antioquia mostraron una gran similitud genetica con el resto de la poblacion y una baja variabilidad genetica, mientras que la mayor variabilidad genetica se detecto en Apartado y Dabeiba al noroccidente de Antioquia, la region mas distante del Magdalena medio en Santander.

La moderada variabilidad genetica en un numero reducido de aislamientos de Apartado y Dabeiba hace pensar en una evolucion incipiente de variantes de M. roreri en estos municipios. Estas variantes posiblemente fueron introducidas por intervencion humana desde la zona del Magdalena medio en Santander considerada el centro de origen y diversidad de M. roreri por Phillips (2003); sin embargo, los aislamientos de Apartado y Dabeiba mostraron poca similitud genetica con los aislamientos de la region del Magdalena medio en Antioquia adyacente a la region del Magdalena medio en Santander. Otra posible explicacion seria la evolucion de nuevas variantes como respuesta a una alta presion de seleccion impuesta por las condiciones climaticas particulares del noroccidente de Antioquia, al tipo de material vegetal utilizado en los cultivares de cacao en esta region, o a la presencia de hospedantes silvestres como T. gileri y Herrania, ya que no existen estudios previos con evidencia biologica que indiquen la ocurrencia de reproduccion sexual de M. roreri en esta region de Antioquia.

CONCLUSIONES

La poblacion de M. roreri en Antioquia posee una gran similitud genetica, bajos niveles de diversidad y diferenciacion indicando que su introduccion en Antioquia posiblemente es muy reciente, con una propagacion de forma clonal, favorecida por la presencia de condiciones climaticas poco agresivas para el hongo y el tipo de material vegetal utilizado para el establecimiento de los cultivos, lo que impone una baja presion de seleccion. Sin embargo, M. roreri mostro una variacion genetica moderada en Apartado y Dabeiba que pueden representar sitios de evolucion y focos de dispersion de nuevas variantes del hongo. El mayor porcentaje de variabilidad genetica se encontro dentro de los municipios con la mayor contribucion aportada por los aislamientos de Apartado y Dabeiba, con un porcentaje pequeno de variacion entre los municipios dentro de cada subregion, y una variacion de magnitud muy pequena y poco significativa entre las subregiones de Antioquia. Con base en los resultados de la presente investigacion se sugiere emprender estudios de variabilidad genetica con la misma poblacion estudiada o con aislamientos de la region noroccdiente de Antioquia, en particular de Apartado y Dabeiba, con marcadores codominantes u otras tecnicas moleculares que permitan la estimacion de parametros en la poblacion que no pueden ser determinados con marcadores dominantes y que permitan identificar estas posibles nuevas variantes, tambien para esclarecer una posible reproduccion sexual de M. roreri en esta region, y descartar el efecto del tamano de la muestra en los municipios con mayor numero de muestras: Apartado, Dabeiba y Maceo.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigacion fue financiada por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, y desarrollada con el apoyo del Instituto de Cooperacion para la Agricultura IICA, Federacion Nacional de Cacaoteros (Fedecacao), Secretaria de Agricultura y Desarrollo Rural de Antioquia, Compania Nacional de Chocolates de Medellin, Posgrado en Biotecnologia, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellin, los Laboratorios de Sanidad Vegetal, Biologia Celular y Molecular de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellin. Los autores expresan sus agradecimientos al doctor Wilbert Phillips Mora por la donacion de los aislamientos de referencia, y a la empresa Coltabaco y el doctor Mauricio Marin por la donacion de 39 cebadores tipo RAPD.

Recibido: Julio 13 de 2007 Aceptado: Noviembre 8 de 2007

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Sandra Patricia Grisales Ortega (1), Lucia Afanador Kafuri (2)

(1) Biologa, M.Sc. en biotecnologia, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellin, Facultad de Minas, Laboratorio de Biomineralogia. spgrisal@unalmed.edu.co

(2) Biologa, M.Sc. en fitopatologia, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellin, Facultad de Agronomia. lafando@ unalmed.edu.co
Tabla 1. Secuencia de bases de los cebadores
tipo AP-PCR utilizados en la evaluacion de
170 aislamientos de M. roreri de Antioquia

Codigo cebador   Secuencia de bases

Oligo 1          [(CAG).sub.5]
Oligo 2          [(AGG).sub.5]
Oligo 3          [(GACAC).sub.3]
Oligo 4          [(GACA).sub.4]

Tabla 2. Secuencia de bases de los cebadores tipo RAPD utilizados
en la evaluacion de 170 aislamientos de M. roreri de Antioquia

Codigo Cebador   Secuencias de bases

Oligo 1          5'-TCC CGA ACC C-3'
Oligo 2          5'-CAA ACG TCG G-3'
Oligo 3          5'-GGG GGT CTT T-3'
Oligo 4          5'-AAA GCT GCG G-3'
Oligo 5          5'-TGT CAT CCC C-3'
Oligo 6          5'-CAC ACT CCA G-3'
Oligo 7          5'-TTC CCC CCA G-3'
Oligo 8          5'-GTG ACG CCG C-3'
Oligo 9          5'-ATC GTC CAA C-3'
Oligo 10         5'-GGG GGC CTC A-3'
OPA 02           5'-TGC CGA GCT G-3'
OPA 03           5'-AGT CAG CCA C-3'
OPA 05           5'-AGG GGT CTT G-3'
OPA 06           5'-GGT CCC TGA C-3'
OPA 08           5'-GTG ACG TAG G-3'
OPA 09           5'-GGG TAA CGC C-3'
OPA 10           5'-GTG ATC GCA G-3'
OPA 11           5'-CAA TCG CCG T-3'
OPA 12           5'-TCG GCG ATA G-3'
OPA 13           5'-CAG CAC CCA C-3'
OPA 14           5'-TCT GTG CTG G-3'
OPA 15           5'-TTC CGA ACC C-3'
OPA 16           5'-AGC CAG CGA A-3'
OPA 17           5'-GAC CGC TTG T-3'
OPA 19           5'-CAA ACG TCG G-3'
OPA 20           5'-GGT GCG ATC C-3'
OPAB 12          5'-CCT GTA CCG A-3'
OPAB 17          5'-TCG CAT CCA G-3'
OPAN 05          5'-GGG TGC AGT T-3'
OPB01            5'-GTT TCG CTC C-3'
OPB03            5'-CAT CCC CCT G-3'
OPB04            5'-GGA CTG GAG T-3'
OPB05            5'-TGC GCC CTT C-3'
OPB06            5'-TGC TCT GCC C-3'
OPB07            5'-GGT GAC GCA G-3'
OPB08            5'-GTC CAC ACG G-3'
OPB09            5'-TGG GGG ACT C-3'
OPB10            5'-CTG CTG GGA C-3'
OPB11            5'-GTA GAC CCG T-3'
OPB12            5'-CCT TGA CGC A-3'
OPB13            5'-TTC CCC CGC T-3'
OPB14            5'-TCC GCT CTG G-3'
OPB15            5'-GGA GGG TGT T-3'
OPB16            5'-TTT GCC CGG A-3'
OPB17            5'-AGG GAA CGA G-3'
OPB18            5'-CCA CAG GAG T-3'
OPB19            5'-ACC CCC GAA G-3'
OPB20            5'-GGA CCC TTA C-3'
OPE 17           5'-CTA CTG CCG T-3'

Tabla 3. Numero de aislamientos de M. roreri obtenidos de doce
municipios productores de cacao en Antioquia.

                                      Numero
Subregion Antioquia   Municipio       aislamientos

Bajo Cauca            Taraza                    15
Magdalena Medio       Maceo                     24
                      Puerto Berrio             17
Nordeste              Remedios                  13
                      Segovia                    4
Norte                 Valdivia                  10
Occidente             San Jeronimo               7
                      Dabeiba                   26
Oriente               Narino                    10
Suroeste              Tamesis                    9
Uraba                 Apartado                  28
                      Chigorodo                  7
                      Total                    170

Tabla 4. Valores de indice de Shannon y porcentaje de loci
polimorficos para M. roreri en doce municipios productores de
cacao en Antioquia.

Subregion                         % loci        Indice de
Antioquia         Municipio       polimorfico   Shannon

Bajo Cauca        Taraza          37,10         0,18
Magdalena Medio   Maceo           54,84         0,25
                  Puerto Berrio   45,16         0,215
Nordeste          Temedios        37,10         0,199
                  Segovia         19,35         0,115
Norte             Valdivia        33,87         0,188
Occidente         San Jeronimo    27,42         0,157
                  Dabeiba         82,26         0,312
Oriente           Narino          33,87         0,171
Suroeste          Tamesis         27,42         0,157
                  UrabaApartado   79,03         0,304
                  Chigorodo       35,48         0,177

Tabla 5. Valores de porcentaje de loci polimorficos, indice de
Shannon, diversidad genetica total, diversidad genetica dentro de la
poblacion, y diferenciacion genetica para los aislamientos de M.
roreri en las subregiones de Antioquia.

Subregion Antioquia   P (a)   H (tb)   Ht (c)

Bajo Cauca y Norte    46,8    0,229    0,155 [+ o -] 0,041
Magdalena Medio       59,7    0,261    0,170 [+ o -] 0,039
Nordeste              38,7    0,217    0,142 [+ o -] 0,038
Occidente             82,3    0,320    0,190 [+ o -] 0,034
Oriente y Suroeste    38,7    0,194    0,127 [+ o -] 0,032
Uraba                 83,9    0,304    0,172 [+ o -] 0,027

(a) Porcentaje de loci polimorfico

(b) Indice de Shannon de diversidad genotipica

(c) Diversidad de genes total

(d) Diversidad de genes dentro de la poblacion

(e) Diferenciacion genetica

Tabla 6. Valores de porcentaje de loci polimorficos, indice de
Shannon, diversidad genetica total, diversidad genetica dentro de la
poblacion y diferenciacion genetica para la poblacion total de M.
roreri en Antioquia

Poblacion             P (a)   H (tb)   Ht (c)

Poblacion total con      93   0,321    0,190 [+ o -] 0,037
Apartado y Dabeiba

Poblacion total sin   66,13   0,273    0,174 [+ o -] 0,039
Apartado y Dabeiba

Poblacion             Hs (d)                 Gst (e)

Poblacion total con   0,132 [+ o -] 0,017   0,306
Apartado y Dabeiba

Poblacion total sin   0,120 [+ o -] 0,019   0,312
Apartado y Dabeiba

(a) Porcentaje de loci polimorfico

(b) Indice de Shannon de diversidad genotipica

(c) Diversidad de genes total

(d) Diversidad de genes dentro de la poblacion

(e) Diferenciacion genetica

Tabla 7. Valores de identidad genetica (sobre la diagonal) y distancia
genetica (bajo la diagonal) basados en Nei (1972) entre las
poblaciones de M. roreri de doce municipios productores de cacao en
Antioquia

                Apartado   Chigorodo   Dabeiba   Maceo   Narino

Apartado           *         0,954      0,977    0,923   0,912
Chigorodo        0,047         *        0,975    0,937   0,948
Dabeiba          0,023       0,048        *      0,913   0,914
Maceo            0,081       0,065      0,092      *     0,957
Narino           0,092       0,054      0,090    0,044     *
Puerto Berrio    0,141       0,073      0,090    0,089   0,077
Remedios         0,104       0,098      0,105    0,048   0,062
San Jeronimo     0,117       0,085      0,137    0,022   0,063
Segovia          0,101       0,090      0,097    0,062   0,072
Tamesis          0,061       0,066      0,065    0,072   0,064
Taraza           0,081       0,082      0,072    0,049   0,076
Valdivia         0,075       0,059      0,085    0,058   0,063

                Puerto              San
                Berrio   Remedios   Jeronimo   Segovia

Apartado        0,868     0,901      0,889      0,904
Chigorodo       0,930     0,907      0,919      0,914
Dabeiba         0,914     0,900      0,872      0,907
Maceo           0,915     0,954      0,978      0,940
Narino          0,926     0,940      0,939      0,930
Puerto Berrio     *       0,909      0,890      0,923
Remedios        0,095       *        0,939      0,952
San Jeronimo    0,116     0,063        *        0,912
Segovia         0,080     0,049      0,092        *
Tamesis         0,123     0,073      0,083      0,076
Taraza          0,077     0,051      0,072      0,040
Valdivia        0,092     0,040      0,075      0,086

                Tamesis   Taraza   Valdivia

Apartado         0,941    0,922     0,928
Chigorodo        0,936    0,922     0,943
Dabeiba          0,938    0,931     0,919
Maceo            0,931    0,953     0,944
Narino           0,938    0,927     0,939
Puerto Berrio    0,885    0,926     0,913
Remedios         0,930    0,950     0,961
San Jeronimo     0,921    0,930     0,928
Segovia          0,927    0,961     0,918
Tamesis            *      0,940     0,913
Taraza           0,062      *       0,934
Valdivia         0,091    0,069       *

Tabla 8. Analisis de varianza molecular (AMOVA) entre subregiones,
dentro y entre la poblacion de M. roreri en doce municipios
productores de cacao en Antioquia

Fuente de           Suma de     Componentes   % de
variacion           cuadrados   de varianza   variacion   P

Entre subregiones     177,22          0,388       5,94    <0,001
Entre municipios      113,50         12,019      18,38    <0,001
  dentro de la
  subregion
Dentro de los        1072,71          4,949      75,68    <0,001
  municipios
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Author:Grisales Ortega, Sandra Patricia; Afanador Kafuri, Lucia
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2007
Words:7734
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