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Analisis de inmunoblot de antigenos de Leishmania infantum y Leishmania donovani en sueros de pacientes con leishmaniasis visceral de Venezuela.

Immunoblot analysis of Leishmania infantum and Leishmania donovani antigens in sera of patients with visceral leishmaniasis in Venezuela.

INTRODUCCION

Leishmania donovani Ross, 1903 y Leishmania infantum Nicolle, 1908 son los agentes etiologicos de la leishmaniasis visceral humana [1, 2, 3]. La OMS [4], al senalar que la parasitosis es endemica en 88 paises del mundo, reporta 14 millones de personas infectadas, estimando 350 millones a riesgo de contraer la enfermedad, registrando 500.000 nuevos casos por ano. De este total el 90% lo suman Bangladesh, India, Nepal, Sudan y Brasil. En Venezuela, la leishmaniasis visceral se distribuye en el territorio norte, siendo los estados mas afectados Nueva Esparta, Anzoategui, Lara, Aragua y Sucre seguida por los estados Carabobo, Guarico, Trujillo, Falcon y Cojedes, con una incidencia anual que oscila entre 7,2 y 0,4 por 100.000 habitantes [5, 6, 7, 8, 9].

El cuadro visceral se presenta con un espectro clinico que va desde la condicion asintomatica, pasando por la subclinica hasta objetivarse en el cuadro agudo clasico, con sus rasgos cardinales: fiebre intermitente, palidez cutaneo-mucosa, emaciacion, anemia, leucopenia, trombocitopenia, hipergammaglobulinemia e hipoalbuminemia, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatias y puede complicarse con manifestaciones infecciosas y hemorragicas [5, 7, 10, 11,12, 13, 14,15]. La mortalidad es muy alta en los casos no tratados (90%--100%) y aun con tratamiento puede alcanzar tasas de 5% a 30% [11, 16].

El diagnostico clinico es complejo ya que el cuadro nosologico produce un espectro de posibles diagnosticos diferenciales de patologias que coexisten en las mismas areas geograficas, como lo son la malaria, fiebre tifoidea, tuberculosis, algunas leucemias y la enfermedad de Chagas [5, 10, 12, 14]. Tradicionalmente, el diagnostico definitivo lo constituye el parasitologico, por la demostracion del parasito en muestras de tejidos, siendo el metodo de eleccion el aspirado de medula osea, seguido de puncion ganglionar, biopsia hepatica y aspirado esplenico. No obstante, estas practicas clinicas invasivas, de gran riesgo en pacientes en la fase aguda, a veces no son exitosas, ya que los parasitos pueden estar presentes en escaso numero a pesar de la severidad de la sintomatologia clinica [12].

El diagnostico serologico para la deteccion de anticuerpos anti-leishmania circulantes ha sido la alternativa mas util, para confirmar el diagnostico clinico, sin embargo, se han reportado reacciones inespecificas. Modificaciones a las pruebas serologicas han sido propuestas para disminuir el problema de la reactividad serologica cruzada en el diagnostico diferencial de leishmaniasis visceral. En este contexto, varias proteinas especificas de Leishmania incluyendo de L. infantum y de L. donovani han sido identificadas por inmunoprecipitacion y por electroforesis en geles de poliacrilamida en sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE), mediante la tecnica de inmunoblot. Tecnica utilizada para el diagnostico y propositos epidemiologicos cuando antigenos inmunodominantes han sido propuestos para el diagnostico de infecciones asintomaticas y sintomaticas [17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26].

El proposito del presente estudio fue investigar mediante Inmunoblot la respuesta inmune humoral en sueros de pacientes con leishmaniasis visceral activa diagnosticada clinica, parasitologica y/o serologicamente frente a polipeptidos separados en SDS-PAGE de promastigotos de dos cepas de L. infantum, una del estado Trujillo, Venezuela y la otra de referencia del Mediterraneo y una cepa de L. donovani de referencia de la India, a fin de examinar si el patron de reactividad antigeno-anticuerpo es similar para los tres extractos leishmanicos y comparar ese patron de respuesta con sueros de otras patologias que coexisten en areas endemicas del pais, para asi identificar antigenos relevantes que sirvan para el diagnostico y propositos epidemiologicos de leishmaniasis visceral.

MATERIALES Y METODOS

Antigenos

L. infantum (MHOM/TN/80/IPT-1) zimodemo 1 (MON-1), L. donovani (MHOM/IN/80/DD-8) zimodemo 2 (MON-2), cepas de referencia OMS y L. infantum (MHOM/VE/87/TRU-3) zimodemo 1 (MON-1) del estado Trujillo, Venezuela [2, 27].

Preparacion de Antigenos de L. infantum y de L. donovani.

Promastigotos de L. infantum y L. donovani fueron obtenidos por cultivo en masa en medio NNN, cosechados en la fase estacionaria. Siguiendo la tecnica de Towbin y col. [28], los promastigotos lavados en PBS 0,02 M pH 7,2, fueron lisados en Tris-HCl 0,1 M pH 6,8, Sodio Dodecil Sulfato (SDS) 2%, Glicerol 10% y 2-Mercaptoetanol 2%. Los sobrenadantes, se conservaron como extracto antigenico. La concentracion de proteinas se determino segun el metodo de Lowry [29]. Los extractos antigenicos se guardaron a -20[grados]C hasta su uso.

Sueros.

Se evaluaron 19 muestras de sueros de casos clinicos activos de leishmaniasis visceral procedentes de varias areas endemicas del pais: estados de Carabobo (n=6), Nueva Esparta (n=3), Sucre (n=2), Anzoategui (n=4), Lara (n=2) y dos (n=2) sueros de casos infantiles del estado Trujillo, todos con diagnostico clinico, parasitologico y/o serologico (ELISA/promastigotos de L. infantum estandarizado). Asimismo, se incluyeron 26 muestras de sueros de pacientes con otras patologias: 14 de diversas formas clinicas de Leishmaniasis tegumentaria, uno de leishmaniasis cutanea mucosa (LCM) del estado Miranda (n=1), cinco de leishmaniasis cutanea difusa (LCD) procedentes de los estados Apure (n=2), Anzoategui (n=2) y Cojedes (n=1), y ocho de leishmaniasis cutanea localizada (LCL) de los estados Sucre (n=2), Miranda (n=1) y Trujillo (n=5); nueve de enfermedad de Chagas y tres de tuberculosis del estado Trujillo. Ademas se emplearon cinco sueros controles negativos de donadores sanos sin historia clinica ni evidencia serologica de leishmaniasis, tripanosomiasis u otras hemoparasitosis, ni evidencia serologica de enfermedades bacteriales y virales, donados por el Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC). Todos los sueros fueron guardados a -20[grados]C hasta su uso. El estudio fue realizado siguiendo los lineamientos establecidos en la Declaracion de Helsinki para investigacion en humanos resenados en el Codigo de Bioetica y Bioseguridad del FONACIT [30].

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida en Sodio Dodecil Sulfato (SDS-PAGE).

Geles de poliacrilamida en SDS fueron preparados de acuerdo a la metodologia descrita por Laemmli [31]. El gel de corrida al 12% de SDS y el gel espaciador al 4% de SDS. En el gel espaciador se dispenso por duplicado en tres pozos sucesivos 30 mg de cada extracto antigenico (L. infantum Venezuela; L. infantum Mediterraneo y L. donovani India) resuspendidos en buffer de lisis adicionado de azul de bromofenol 0,3%. En el pozo central, se dispenso una mezcla de estandares pretenidos de proteinas de bajo peso molecular (BIO-RAD). La corrida electroforetica se realizo en camara Mini PROTEAN II (BIO-RAD), con buffer de corrida, Tris Base 25 mM, Glicina 192 mM y SDS al 10% pH 8,4, a 4 [grados]C durante 45 minutos 150 voltios.

Inmunoblot.

La electrotransferencia de los polipeptidos desde geles de SDS-poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa (0,45 mm de diametro de poro) se realizo en camara de transblotting (BIO-RAD), siguiendo la metodologia de Towbin y col. [28] modificada por Bittner y col. [32]. Finalizada la electrotransferencia, las membranas se secaron sobre papel filtro y se cortaron en tiras de 2,5 cm de ancho y luego fueron bloqueadas en Albumina Serica Bovina (BSA) 5% en Buffer Fosfato Salino (PBS) 0,15 M pH 7,2-Tween-20, 0,1% [33]. Seguidamente, las tiras fueron incubadas con suero diluido 1:200 en buffer BSA-PBS-Tween-20.

Despues de la incubacion con el conjugado antiIgG humana-peroxidasa (Sigma) diluido 1:2.000, las membranas fueron lavadas con NaCl-T (NaCl 150 mM y 0,2% Tween-20) y los anticuerpos revelados por adicion de diaminobencidina + CO[Cl.sub.2] + [H.sub.2][O.sub.2] en PBS. La determinacion de los pesos moleculares, movilidades relativas y densidad, se realizo en Densitometro GelDoc 2000 (BIO-RAD), empleando el programa Quantity One (BIO-RAD).

Analisis de Varianza y Analisis Factorial de Correspondencias Multiples (AfCM).

Para determinar si el patron de respuesta de anticuerpos de cada grupo serico es similar frente a cada uno de los tres antigenos leishmanicos, se aplico un analisis de varianza para un solo factor (Antigeno) con tres niveles del factor (A1= L. infantum, Trujillo, Venezuela; A2= L. infantum, Tunez, Mediterraneo, OMS; A3= L. donovani, India, OMS), con una variable de respuesta, proporcion de reconocimiento de las bandas antigenicas por las inmunoglobulinas. Antes de aplicar el analisis de varianza, se procedio a verificar el supuesto de normalidad mediante el estadistico de Prueba de Kolmogorov-Smirnov y el supuesto de igualdad de varianza mediante el estadistico de Prueba de Levene, para decidir si es pertinente la aplicacion del analisis de varianza para el modelo lineal completamente aleatorizado [34]. Para este analisis se utilizo el software SPSS version 15.0.

Con los resultados obtenidos del analisis de varianza, se procedio a realizar el AFCM, para estudiar las relaciones simultaneas entre las variables: bandas antigenicas, proporcion de reconocimiento por inmunoglobulinas, enfermedad, diagnostico parasitologico y diagnostico serologico, en la muestra de 45 sueros. Muestra donde se estudiaron todas estas variables y a las cuales corresponde solamente una alternativa de respuesta [35, 36]. A partir de un cuadro de contingencia de naturaleza categorica transformada a escala, el AFCM objetiva la busqueda directa de la mejor representacion simultanea de dos conjuntos sobre un mismo grafico de contingencias de multiples variables activas, para la formacion de los ejes factoriales. Uno constituido por las filas (sueros estudiados) y el otro por las columnas (variables activas). El objetivo de este analisis es el de visualizar lo esencial de la informacion inicial haciendo las transformaciones correspondientes para redefinir la dimensionalidad de los datos, extrayendo aquellas variables de mayor peso explicativo. De esta forma, el analisis permite evidenciar relaciones entre variables al eliminar la redundancia de la informacion. Este analisis se aplico por dos razones: 1- es una tecnica que no exige un supuesto sobre la naturaleza de las variables y 2- porque se adapta a la naturaleza de cada variable (de escala nominal y ordinal) incluida en el estudio. Para procesar los resultados del AFCM se utilizo el software SPAD version 4.5.

[FIGURA 1 OMITIR]

RESULTADOS

Los 19 sueros de pacientes con leishmaniasis visceral reconocieron polipeptidos en un rango de masas moleculares relativas entre 16-17KDa a 119 KDa, siendo la banda de 94 KDa reconocida por todos los sueros, seguida por la de 70 KDa (79%) y la de 83 KDa (58%), en los tres extractos leihsmanicos, incluyendo el suero de un caso autoctono infantil del estado Trujillo (MHOM/ VE/87/TRU-3), suero utilizado de referencia positiva para todos los ensayos de inmunoblot. Aunque no se detecto variacion en el patron de respuesta individual frente a uno u otro extracto leishmanico, si se observo entre sueros (Figura 1). Los 14 sueros de pacientes con otras formas clinicas de leishmaniasis, reconocieron entre 3 y 10 bandas antigenicas, siendo la region de 50-55 KDa y la banda de 77 KDa, reconocidas por el 100% de los sueros, bandas de reactividad cruzada. El unico suero de LCM reconocio ademas la banda de 80 KDa.

En los nueve sueros de pacientes con enfermedad de Chagas cronica tambien se detecto una extensa reactividad serologica cruzada con los sueros de leishmaniasis visceral. Solo una banda, la de 106 KDa, no fue reconocida. Resultados que confirman una vez mas la similaridad antigenica entre especies de los generos Leishmania y Trypanosoma de la familia Trypanosomatidae. Similarmente, los tres sueros de pacientes con tuberculosis, tambien exhibieron reactividad cruzada con los sueros de leishmaniasis visceral, incluyendo las bandas de 80 KDa de LCM y 106 KDa de enfermedad de Chagas. Estos resultados sugieren igualmente cierta similaridad antigenica entre Mycobacterium y kinetoplastida. Finalmente, el pool de sueros negativos de donadores sanos no reconocio ninguna fraccion antigenica en los tres extractos leishmanicos.

[FIGURA 2 OMITIR]

A pesar de esta extensa reactividad cruzada, la region polipeptidica entre 83-102 KDa es reconocida solo por los sueros de pacientes con leishmaniasis visceral. Resaltando la banda de 94 KDa reconocida por el 100% de estos sueros (Figura 2).

Para el analisis de varianza de los resultados obtenidos se realizo previamente la comprobacion de los supuestos de normalidad y de igualdad de varianza; en cuanto al primer supuesto se determino que el estadistico de Prueba de KolmogorovSmirnov, rechazo la hipotesis nula para cualquier nivel de significacion (Tabla 1). A pesar de que no se cumplio, esto no afecto la validez del analisis de varianza puesto que este es un metodo estadistico bastante robusto, en el sentido de que el estadistico de prueba F no se ve fuertemente influenciado por valores contaminados, mientras que el estadistico de Prueba de Levene, no rechazo la hipotesis nula del supuesto de igualdad de varianza para un valor del estadistico de prueba de 0,044 con un [alfa]=0,01 menor que p=0,957 (Tabla 1).

Una vez que se realizo la comprobacion de los supuestos se procedio a efectuar el analisis de varianza (Tabla 2). El mismo revelo que efectivamente no existen diferencias significativas ([alfa]=0,01 y p=0,923) en la proporcion de reconocimiento de polipeptidos en los tres extractos antigenicos por anticuerpos de los diferentes grupos de sueros estudiados, lo cual sugiere que cualquier extracto antigenico de promastigotos de L. infantum (de Venezuela o del Mediterraneo) o de L. donovani (de la India), puede ser utilizado para el diagnostico de la afeccion. En funcion de los resultados anteriores, se procedio a realizar el analisis factorial de correspondencias multiples (AFCM), utilizando solo la data referida y se escogio el extracto antigenico de L. infantum autoctono de Venezuela. Con los resultados se selecciono el grafico formado por los ejes I y II, ya que estos ejes acumularon el 13% de la varianza total de la informacion, la cual representa mas de la mitad del total acumulado (24%). En la Figura 3, se observa la formacion de sietes grupos de variables que hacen correspondencias multiples entre si, y al mismo tiempo se observa que estos grupos presentan comportamientos opuestos, resaltando por debajo del eje I, en el centro inferior del eje II, el tercer grupo VIS (leishmaniasis visceral) de particular interes porque es el unico en el cual hacen correspondencias multiples las variables: enfermedad, leishmaniasis visceral (VIS) y las bandas antigenicas de 94 KDa, 70 KDa y 83 KDa.

[FIGURA 3 OMITIR]

DISCUSION

El analisis de los blots demostro que las inmunoglobulinas G (IgG) de los sueros de pacientes con leishmaniasis visceral reaccionaron variablemente con la mayoria de polipeptidos presentes en los extractos de L. infantum y de L. donovani, reflejando probablemente la fase de la enfermedad en la cual se encontraba el paciente. Estos resultados confirman que altos niveles de anticuerpos especificos como de no especificos de Leishmania son producidos durante el curso de la enfermedad [22, 23, 37], debido a la distribucion de los parasitos en las visceras de los pacientes, los cuales inducen a una pronunciada hipergammaglobulinemia en respuesta a la activacion policlonal de celulas B [20, 38, 39] y a la inmunosupresion de la respuesta proliferativa de celulas Th1 frente a antigenos del parasito [40, 41].

En este trabajo el antigeno de 94 KDa presente en los extractos de L. infantum (Mediterraneo y Venezuela) y L. donovani (India), fue reconocido por el 100% de los sueros de pacientes con leishmaniasis visceral, clinica, parasitologica y/o serologicamente confirmada, de variada procedencia geografica del pais. El antigeno no fue reconocido por los sueros controles negativos. Asimismo, no se observo variacion en los patrones de bandas reconocidas por cada uno de los sueros, aunque si se observo entre sueros (Figura 1). Estos resultados son consistentes a los obtenidos por Rolland-Burger y col. [20], quienes al analizar la especificidad de la respuesta inmune humoral en sueros de pacientes con leishmaniasis visceral humana confirmada y casos sospechoso, asi como en sueros de pacientes con leishmaniasis cutanea y con sueros de otras enfermedades producidas por otros protozoos, helmintos, hongos y bacterias, frente a blots de polipeptidos de cepas de L. infantum, L. donovani, L. tropica, L. major, L. guyanensis y L. mexicana, reportan que aunque el componente de 94-KDa esta expresado en todos los perfiles polipeptidicos de diferentes especies de Leishmania, solamente fue reconocido en los blots de L. infantum y de L. donovani por el 100% de los sueros de pacientes con leishmaniasis visceral aguda y por el 75% de los sueros de casos sospechosos. Al respecto, Rolland y col. [22] reportan ademas, que sueros de casos de leishmaniasis cutanea infectados por L. brasiliensis, L. amazonensis, L. guyanensis o L. tropica, no reaccionaron frente a este antigeno de 94 KDa en los blots de L. infantum y de L. major, mientras que, algunos sueros de pacientes que presentaron lesiones cutaneas producidas por L. infantum, si desarrollaron anticuerpos anti-94KDa. En este sentido, Neogy y col. [42], reportan ese mismo hallazgo en sueros de perros infectados con L. infantum y animales sospechosos cuyos sueros produjeron anticuerpos anti-94 KDa. Por otra parte, Rolland y col. [21] demostraron que en extractos axenicos de L. mexicana el antigeno de 94 KDa, no fue reconocido por sueros de leishmaniasis visceral humana y canina.

En Turquia, Dayangac y col. [25], utilizando antigenos de L. infantum, encuentran que el polipeptido de 94 KDa es reconocido especificamente por los sueros de casos clinicos con leishmaniasis visceral humana pre y postratamiento.

En este estudio, otro antigeno, el de 70 KDa, reconocido por el 79% de los sueros de leishmaniasis visceral estudiados, no fue identificado por anticuerpos de ninguno de los sueros controles incluyendo los de las diversas formas clinicas de leishmaniasis tegumentaria. Este hallazgo se correlaciona con lo reportado por Jaffe y Zalis [43], quienes senalan que dos antigenos: 70 KDa y 72 KDa, ambos extraidos de membrana de L. donovani, tambien han sido reconocidos especificamente por anticuerpos de pacientes con leishmaniasis visceral y no por sueros de pacientes con leishmaniasis cutanea y enfermedad de Chagas. Asimismo, en Kenia (Africa Oriental), Okong'o-Odera y col. [44] reportan que el antigeno de 70 KDa ademas del de 116 KDa de promastigotos de L. donovani son reconocidos por sueros de pacientes con leishmaniasis visceral. Posteriormente, Okong'oOdera y col. [45] al evaluar la especificidad de la respuesta de celulas T frente a este antigeno y el de 116 KDa, senalan que sueros de individuos sanos residentes en areas endemicas, reconocen hasta en un 85,7% el de 70 KDa, proponiendo que este antigeno puede revelar infecciones subclinicas en esas regiones. En este orden de ideas, en la India, Kumar y col. [23] demuestran que ese polipeptido de 70 KDa ademas del de 65 KDa son reconocidos por sueros de pacientes pre- y postratamiento con Glucantime o Miltefosina, sugiriendo que estos polipeptidos pueden tener valor diagnostico y pronostico.

Este polipeptido de 70 KDa ha sido identificado y caracterizado como miembro de la familia de las proteinas de choque termico, Hsp70. Recombinantes de la region carboxilo terminal de esa proteina de L. donovani [46] de L. infantum [47] y de L. chagasi [48] producen una fuerte respuesta inmune humoral en ELISA e Inmunoblot, solo por sueros de pacientes con leishmaniasis visceral de areas endemicas tales como Brasil y Sudan. Da Silva y col. [48] demuestran que sueros policlonales de conejos inmunizados con el recombinante de L. chagasi producen altos titulos de anticuerpo en test de aglutinacion directa, concluyendo que esa proteina nativa Hsp70 de L. chagasi esta distribuida sobre la superficie del parasito.

Con respecto al polipeptido de 83 KDa, fue reconocido solo por el 58% de los sueros de pacientes con leishmaniasis visceral estudiados. En relacion a este antigeno, Angel y col. [49] al analizar la secuencia de un clon expresado de una libreria de cADN de promastigotos de L. infantum, inmunoseleccionado frente a un suero de leishmaniasis visceral canina, estimaron que el genoma de ese parasito contiene 7 genes Hsp83 organizados en tandem y que la proteina completa y subfragmentos de la proteina recombinante, LiHsp83, al ser utilizados como antigenos en un FASTELISA en sueros de perros con leishmaniasis visceral, encuentran que el 90% de los sueros reconocieron ese recombinante, sugiriendo que la Hsp83 de L. infantum o subfragmentos de la misma pueden ser utiles en el serodiagnostico de la afeccion canina.

CONCLUSIONES

1. El extracto antigenico de promastigotos de la cepa de L. infantum autoctona del estado Trujillo, Venezuela, demostro ser de igual reactividad y especificidad que el de L. infantum del Mediterraneo y el de L. donovani de la India. En efecto, el analisis de varianza revelo que no existen diferencias significativas en el patron de reconocimiento de polipeptidos en los tres extractos leishmanicos por las inmunoglobulinas de los sueros con leishmaniasis visceral, por lo que se sugiere utilizar la cepa L. infantum de Trujillo (MHOM/VE/87/TRU-3) como antigeno en Inmunoblot.

2. La consistente deteccion del polipeptido de 94 KDa por el 100% de los sueros estudiados con o sin diagnostico parasitologico, confirma que es candidato idoneo en el Inmunodiagnostico diferencial de la afeccion en el pais, tal como en otras regiones endemicas del viejo y nuevo mundo, mientras que los polipeptidos 70 KDa (79%) y 83 KDa (53%) pueden contribuir tambien al diagnostico aunque en menor proporcion.

3. El analisis factorial de correspondencias multiples (AFCM) confirmo la formacion siete grupos de variables, siendo el unico de interes, la enfermedad leishmaniasis visceral (VIS) en el cual hacen correspondencias multiples las variables: VIS y las bandas antigenicas de 94 KDa, 70 KDa y 83 KDa.

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Hilda Perez y Lic. Mercedes De La Rosa (IVIC). Dra. Haidee Urdaneta del IDIC-ULA. Dr. Cruz Manuel Aguilar (Universidad de Carabobo) y a la Dra. Marian Ulrich, (Instituto de Biomedicina), quienes desinteresadamente proporcionaron algunos sueros. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Cientifico Humanistico y Tecnologico de la Universidad de Los Andes (CDCHT-ULA, proyecto NURR-C-300-01-07-C).

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Carrillo-Rosario Teolinda (1), Moreno Glenda (1), Marquez Jairo (2).

(1) Laboratorio de Investigacion en Ecologia y Epidemiologia de Leishmaniasis Visceral (LIELV), Departamento de Biologia y Quimica; (2) Departamento de Ciencias Economicas y Contables; Nucleo Universitario "Rafael Rangel", Trujillo. Universidad de Los Andes, Republica Bolivariana de Venezuela.

* Correspondencia al autor: teolindacarrillo@ula.ve

Recibido junio 2012--Aceptado octubre 2012
TABLA 1

Supuestos del ANOVA

Test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov.

                                            BRECO

N                                            420

Parametro Normal         Media             ,222768
                         Std. Desviacion   ,268694
Modo de Extremo          Absoluto           ,216
Diferencias              Positivo           ,216
                         Negativo          -,204
Kolmogorov-Smirnov Z                       4,417
Asymp. Sig. (2-tailed)                      ,000

Test de Homogeneidad de Varianza.

        Levene
        Estadistico   df1   df2   Sig.

BRECO      ,044        2    417   ,957

TABLA 2

Analisis de Varianza.

                       Suma de           Media de
                       Cuadrados   Df    Cuadrados   F      Sig.

BRECO   Entre Grupos   1,2E-02     2     5,8E-03     ,080   ,923
        Dentro de
        Grupos         30,239      417   7,3E-02

        Total          30,250      419
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Title Annotation:Articulo Original
Author:Carrillo-Rosario, Teolinda; Moreno, Glenda; Marquez, Jairo
Publication:Revista de la Facultad de Farmacia
Date:Jan 1, 2012
Words:5577
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