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Analisis bioinformatico y prediccion de genes en secuencias genomicas de Clostridium sp. IBUN22A.

Bioinformatic analysis and gene prediction in genomic sequences from Clostridium sp. IBUN22A

RESUMEN

Este trabajo tuvo como proposito identificar secuencias de genes en clones obtenidos en una libreria genomica de la cepa colombiana de Clostridium sp. IBUN 22A. Los insertos de nueve clones con tamanos superiores a 500 pb fueron secuenciados y analizados por medio de busquedas de los insertos completos o de sus marcos abiertos de lectura (ORFs) traducidos en GenBank 141.0 y Uniprot 6.6 con BLAST 2.2.8. Se identificaron seis genes con alta similaridad a genes de metabolismo basico (housekeeping) en diferentes especies de Clostridium. En el clon pBsIBUN22A-1 se localizo una secuencia de 851 pb con una identidad del 99.74% respecto al gen codificante de la enzima glicerol deshidratasa (DhaB1) de Clostridium butyricum (AY968605) involucrada en la produccion de 1,3 Propanodiol (1,3-PD). La identificacion de genes presentes en la cepa nativa Clostridium IBUN 22A abre la puerta a la investigacion basica y a la ingenieria metabolica para hacer mas rentable el proceso de produccion de 1,3-PD junto al conocimiento de los genes presentes en la cepa nativa.

Palabras clave: analisis de secuencias, libreria genomica, Clostridium, glicerol deshidratasa, 1,3-propanodiol.

ABSTRACT

This work was aimed at identifying gene sequences in recombinant clones obtained from a genomic library from the Colombian Clostridium sp. IBUN 22A native strain. Nine clones greater than 500 bp were sequenced and analysed using BLAST 2.2.8 to search for complete inserts or their translated open reading frames (ORFs) in GenBank 141.0 and Uniprot 6.6. Seven genes having high similarity to housekeeping genes from different Clostridium species were identified. An 851 bp sequence was located in the pBsIBUN22A-1 clone, having 99.74% identity with the gene encoding the Clostridium butyricum enzyme glycerol dehydratase (DhaB1) which is involved in 1,3-propanediol (1,3-PD) production. Identifying genes in the native IBUN 22A strain formed the starting point for basic research and metabolic engineering aimed at making 1,3-PD production more profitable and increasing knowledge of genes present in the native strain.

Key words: glycerol dehydratase, 1,3-propanediol, genomic library, Clostridium, sequence analysis.

INTRODUCCION

Durante los anos 90 se aislaron 13 cepas del genero Clostridium provenientes de diferentes muestras de suelos colombianos caracterizadas por producir solventes (acetona, butanol, etanol) en una concentracion superior a la de cepas de referencia del mismo genero, y con capacidad para degradar polisacaridos naturales que incluyen almidon y carboximetilcelulosa (CMC) (Montoya et al., 2000). Posteriormente se realizaron analisis de taxonomia polifasica que incluyeron la secuenciacion del gen 16S rARN, caracterizacion molecular por campo pulsado (PFGE), deteccion de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion amplificados (AFLP), hibridacion ADNADN y pruebas bioquimicas y enzimaticas que sugirieron que las cepas mencionadas podrian constituir una especie nueva cercanamente relacionadas con Clostridium butyricum (Montoya et al., 2001; Jaimes et al., 2006; Suarez et al., 2006). Adicionalmente se determino que cinco de las cepas tenian la capacidad de producir 1,3-propanodiol (1,3 PD) a partir de glicerol en una concentracion mayor a la de tres cepas de referencia del genero Clostridium (Cardenas y Pulido, 2004) mediante una ruta bioquimica propia de algunos clostridios (figura 1). La cepa Clostridium sp. IBUN 22A coincide con los subgrupos con mayor capacidad celulolitica, solventogenica y de produccion de 1,3-PD a partir de glicerol. Por esta razon se genero una libreria genomica en Escherichia coli a partir de Clostridium IBUN 22A, destinada a la busqueda de genes de interes en clones con insertos de tamano superior a 500 pb.

[FIGURA 1 OMITIR]

A traves de una estrategia de mineria de datos se analizaron secuencias genomicas obtenidas con el proposito de identificar sectores codificantes de enzimas asociadas a procesos metabolicos de interes comercial. Uno de los resultados mas relevantes fue la identificacion de la secuencia parcial de uno de los genes involucrados en la sintesis de 1,3-PD. Asi mismo se identificaron seis genes de mantenimiento celular con secuencias altamente similares a los genes equivalentes en otras especies del genero Clostridium.

MATERIALES Y METODOS

Cepas bacterianas y plasmidos. La cepa celulolitica Clostridium sp. IBUN 22A, aislada de suelos colombianos (Montoya et al., 2000), fue usada para la construccion de una libreria genomica en E. coli XL1 BLUE con el vector de clonacion pBluescript[R] II KS+/-, como lo describe Vargas et al. (2002). Adicionalmente, el clon PBS-25 con actividad celulasa fue subclonado en Escherichia coli DH5a, obteniendose asi los clones PBSH-26 y PBSH-37 (Roncancio et al, 2005).

Secuenciacion de clones representativos de la libreria genomica y productos de subclonaje. Todos los plasmidos fueron evaluados electroforeticamente y se seleccionaron para secuenciacion aquellos cuyo tamano de inserto fuera superior a 500 pb. Nueve plasmidos fueron seleccionados y extraidos con el kit Wizard[R] de Promega (tabla 1). La secuenciacion se realizo por triplicado en las siguientes instituciones: servicio de secuenciacion automatizada de la UNAM (Mexico), el Laboratorio de Genomica e Expressao de UNICAMP (Brasil) y MACROGEN (Corea), usando los primers M13, F y R. (F, 5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGAC-3'; R, 5'-AGGAAACAGCTATGACCAT GATTAC-3'), T3 y T7 (T3, 5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3'; T7, 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3').

Analisis bioinformatico de las secuencias de los insertos. Las secuencias depuradas fueron comparadas contra la base de datos completa de Genbank 141.0 (Benson et al., 2005), al igual que contra bases de datos especificas de Clostridium acetobutylicum, C. botulinum A, C. difficile, C. perfringens ATCC 13124 y str. 13, C. tetani E88 y C. thermocellum ATCC 27405 almacenadas en el website de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/), usando las aplicaciones BLASTN 2.2.8 y TBLASTX. Las secuencias traducidas en los seis marcos de lectura posibles fueron comparadas contra la base de datos de proteinas SwissProt 42.8 (Boeckmann et al.2003) usando BLASTX 2.2.8 desde el portal de NCBI y contra la base de datos UniProt 6.6 (Leinonen et al., 2004). Por ultimo se extrajeron los marcos abiertos de lectura (ORFs) mas largos usando el programa getorf y plotorf de EMBOSS (Centro Internacional de Bioinformatica del IBUN, www.bioinf.ibun.unal.edu.co; Rice et al., 2000) y se confirmaron con Artemis v5 (Rutherford et al., 2000), ORFfinder de NCBI (Wheeler et al., 2005). Los ORF mas largos se compararon nuevamente contra UniProt usando BLASTP. En caso de hallarse una semejanza superior al 70% con genes o proteinas conocidos, sumada a la deteccion de senales de transcripcion en posicion -10 o -35, RBS (secuencias de union a ribosomas) o palindromes de terminacion, se considero que la secuencia correspond ia con alta probabilidad a un gen. Las secuencias seleccionadas fueron registradas manualmente en GenBank usando la herramienta BankIt (en linea).

RESULTADOS

Secuenciacion de clones representativos de libreria genomica y productos de subclonaje. Se obtuvieron 25 secuencias entre 248 y 1546 pb. Se sometieron a GenBank nueve secuencias, en siete de las cuales se identificaron genes de housekeeping o de interes para las rutas metabolicas de Clostridium (tabla 1).

Prediccion del gen dhaB1 en el clon pBsIBUN22A-1. Se determino que el inserto del clon pBsIBUN22A-1 tenia una longitud inicial de 851 pb. El analisis revelo que el ORF mas largo estaba ubicado entre las posiciones 76 y 851 en sentido 5' 3' (figura 2), con una region de 386 pb, con identidad de 99.74% respecto a la region codificante del gen dhaB1 de C. butyricum (E=1e-70) (figuras 3 y 4), con un sitio de union a ribosoma localizado entre las posiciones 57 y 61, mientras que el resto de la secuencia exhibio una similaridad menor a una proteina transportadora de prolina y triptofano dependiente de sodio en Clostridium tetani (Brueggemann et al., 2003).

[FIGURA 2-4 OMITIR]

El alineamiento de la traduccion en el segundo marco de lectura del inserto de pBSIBUN 22A-1 con la secuencia aminoacidica de DhaB1 en TBLASTX presenta una region de 152 aminoacidos (aa) con identidad perfecta y valor (E=2e-77). Este resultado es sobresaliente, dado que el gen dhaB1 es el primero del operon 1,3-PD de C. butyricum, y codifica para la enzima glicerol deshidratasa que permite la conversion de glicerol en 3-hidroxipropionaldehido en la ruta bioquimica de produccion de 1,3 PD (Raynaud et al., 2003). En este caso se identifico un sitio de union al ribosoma (RBS) en las posiciones 57 a 61, hecho que permite predecir el gen con alta probabilidad y que sugiere la presencia del resto de los genes en la cepa nativa en atencion a que se ha demostrado que tiene la capacidad de producir 1,3 propanodiol a partir de glicerol. Se requieren estudios posteriores para establecer la secuencia de los demas genes involucrados en la ruta de la cepa nativa, asi como su organizacion fisica (tabla 1).

Deteccion de genes metabolismo basico o housekeeping. En el tercer marco abierto de lectura del clon pBsIBUN22A-2 se hallo una region con 78% de identidad con el gen codificante de la proteina NifN-B de Clostridium beijerinckii (GenBank AAS91670) entre las posiciones 81 y 782, y con un sitio de union a ribosoma entre la posicion 68 y 72 (Chen et al., 2001). La calidad de los alineamientos obtenidos (E=3e-25) y el hecho de que la mayor parte de los resultados de la busqueda sean homogeneos en otras especies de Clostridium permiten predecir que esta secuencia codifica una proteina de 233 aa requerida para la biosintesis del cofactor hierro-molibdeno (o hierro-vanadio) usado por nitrogenasas implicadas en la fijacion de nitro-geno en bacterias (tabla 1).

En la secuencia del inserto del clon Gen22AC100 entre la posicion 20 y 127 se hallo una region de 93% de identidad con parte del gen que codifica para el factor de elongacion Tu de Clostridium perfringens str. 13 (Shimizu et al., 2002), asi como con el mismo gen de otras especies de Clostridios. El factor Tu promueve la union del aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma durante la biosintesis de proteinas. Adicionalmente, se ubico un palindrome de terminacion entre las posiciones 155 y 174 (tabla 1).

En el extremo 5' del inserto del clon 020801-30, entre las posiciones 2 y 112, se identifico un sector que guarda un 85% de identidad con una region de la enzima purina-nucleosido fosforilasa de Clostridium tetani E88 (GenBank NP 782010) y con otras del genero Clostridium. Esta enzima tiene la funcion de catalizar la reaccion de formacion de [alfa]-D-ribosa 1-fosfato en el metabolismo de las purinas. Este resultado sugiere que la secuencia obtenida corresponde a parte del gen codificante para la proteina mencionada, por lo que fue sometida a GenBank con el numero DQ225170. Adicionalmente en la region 3' del inserto del clon pBS25B se detecto una region de 121 pb con similitud del 67% a la misma proteina (purin-nucleosido fosforilasa DeoD) de Clostridium tetani (tabla 1) (Brueggemann et al., 2003).

En el inserto del clon pBS-25, en la region comprendida entre las posiciones 29 y 430, se encontro una region con una identidad del 69% (E=6e-38) con respecto al gen completo que codifica para el dominio carboxi terminal de la proteina transcetolasa de Clostridium thermocellum ATCC 27405 (GenBank ZP 00510628) y de 60% en el caso de la misma enzima en Clostridium perfringens str. 13 (GenBank: BAB80003) (Shimizu et al., 2002). Se identificaron RBS entre la posicion 17 y 22, y una senal -10 del promotor entre las posiciones 8 y 12, asi como un palindrome de terminacion entre los sitios 458 y 482, hechos que sugieren que la secuencia completa si corresponde al gen de una transcetolasa posiblemente involucrada en la via de las pentosas-fosfato, por lo que fue sometida a GenBank con el numero DQ228721. Adicionalmente en el inserto del clon 020803-16 se detecto que la traduccion de uno de los ORF mas largos presenta una similitud del 82% con el dominio de union a piridina en transcetolasas de Clostridium thermocellum y perfringens (GenBank: ZP_00510628 y BAB80003), respectivamente. Confirman la prediccion de esta proteina el hallazgo de una senal -10 del promotor entre las posiciones 21 y 26 (tabla 1) (Copeland et al., 2005; Shimizu et al., 2002).

En los insertos de los clones 011901-2 y 012901-20 (GenBank DQ223967 y DQ223968, respectivamente) no se identificaron ORF representativos.

DISCUSION

La identificacion o reconocimiento de genes es uno de los problemas mas importantes en la biolog ia molecular, que ha incrementado su complejidad debido al advenimiento de un gran numero de proyectos genoma. Las estrategias usualmente empleadas para resolver este problema se dividen en dos tipos, una de las cuales emplea la estadistica de composicion de las secuencias mientras que la otra recae en la busqueda de similaridad en bases de datos (Shibuya y Rigoutsos, 2002). En este trabajo se utilizo la segunda estrategia y las secuencias fueron contrastadas teniendo en cuenta las caracteristicas estructurales de los genes.

En los insertos de los clones pBsIBUN22A-2, DQ060835, 020801-30, pBs25, 020803-16, pBS25-B, fue posible identificar genes de mantenimiento celular por similaridad con genes descritos para especies del genero Clostridium. La deteccion de tales genes de metabolismo permite la exploracion genomica de las cepas nativas, aunque se requiere llevar a cabo pruebas bioquimicas y moleculares que demuestren la expresion y funcionalidad de estas enzimas en la cepa IBUN 22A.

La cepa colombiana Clostridium sp. IBUN 22A ha demostrado la capacidad de fermentar glicerol hasta 1,3-PD, y los ultimos analisis taxonomicos la ubican en el mismo nodo de las especies productoras de 1,3-PD como C. butyricum (Suarez et al., 2006). Cabe mencionar que Biebl y Sproer (2002) previamente demostraron que especies cercanamente relacionadas a la cepa nativa tienen la capacidad de metabolizar el glicerol y producir 1,3 propanodiol, como es el caso de algunas cepas de Clostridium diolis. La produccion de este solvente en las cepas nativas sugiere la existencia de un sistema genetico que regule la produccion de 1,3-PD, de manera similar a la descrita por Raynaud et al., 2003, para Clostridium butyricum VPI1718 (2003).

La ruta de conversion de glicerol a 1,3-propanodiol involucra enzimas agrupadas en el regulon dha o en el operon 1,3-PD de acuerdo al organismo. Dos de ellas (glicerol deshidrogenasa y dihidroxiacetona kinasa) se encargan de convertir al glicerol en piruvato, produciendo asi equivalentes NADH que son necesarios para la reduccion del glicerol por medio de otras dos enzimas (glicerol deshidratasa y 1,3-PD deshidrogenasa) (Sun et al., 2003) (figura 1). El paso limitante en este proceso es la conversion de glicerol en 3-hidroxipropionaldeh ido catalizado por la glicerol deshidratasa. En este paso se produce un radical intermediario que suele involucrar a la coenzima [B.sub.12] como cofactor (Knietsch et al., 2003). La glicerol deshidratasa DhaB1 de C. butyricum es una excepcion en dicha familia enzimatica, ya que esta compuesta por solo una subunidad (gen dhaB1) y no requiere coenzima B12 como cofactor (Nakamura y Whited, 2003). El hallazgo de una secuencia casi identica a una glicerol deshidratasa en IBUN 22A tiene particular relevancia dado que de su expresi on depende toda la ruta de produccion de 1,3-PD, siendo interesante averiguar en estudios posteriores si es o no dependiente de coenzima B12, considerando que este es un costo adicional dentro del proceso industrial de 1,3-PD (Raynaud et al., 2003, Sun et al., 2003).

Se debe resaltar que la identificacion de un gen del operon dha en IBUN 22A ademas de contribuir con la informacion sobre la cepa, abre las puertas para realizar mejoramiento de cualquiera de las cepas nativas aisladas junto con IBUN 22A, en las cuales se determino productividad volumetrica y rendimiento de 1,3-PD igual o superior a ella (Cardenas y Pulido, 2004). Actualmente se adelanta el proceso de secuencia de todo el operon que regula la produccion de 1,3 PD en varias cepas nativas y se planea realizar la caracterizacion de las enzimas involucradas en la ruta para optimizar la produccion de este metabolito. En el futuro una de estas cepas podria ser usada para la produccion industrial del solvente a partir de efluentes con alto contenido de glicerol como aquellos procedentes de las plantas de produccion de biodiesel.

CONCLUSIONES

Los resultados de este trabajo demuestran la utilidad del analisis de secuencias de insertos en librerias genomicas para el hallazgo de genes con aplicacion industrial y permite proyectar la investigacion basica hacia la rentabilizacion del proceso de produccion de 1,3-PD.

AGRADECIMIENTOS

El desarrollo de este proyecto fue posible gracias al respaldo economico de Colciencias y la Universidad Nacional de Colombia dentro del marco del proyecto. Produccion de 1,3 Propanodiol a partir de glicerol generado del proceso de produccion de biodiesel, empleando cepas nativas de Clostridium spp: estudio del operon, condiciones de produccion por fermentacion y su viabilidad economica. (1101-12-17848), desarrollado por el Instituto de Biotecnologia. Algunas de las secuencias fueron obtenidas por el Dr. Goncalo Guimaraes Pereira del Laboratorio de Genomica e Expressao, Departamento de Genetica e Evolucao del Instituto de Biologia de la Universidad de Campinas. Agradecemos la colaboracion del Dr. Emiliano Barreto y Andres Pinzon por su soporte en el analisis bioinformatico.

Recibido: enero 22 de 2006 Aceptado: mayo 02 de 2006

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Jose David Montoya Solano *, Zulma Rocio Suarez Moreno **, Dolly Montoya Castano ***, Fabio Ancizar Aristizabal Gutierrez ****

* QFUN. Universidad Nacional de Colombia. Instituto de Biotecnologia de la Universidad Nacional de Colombia.

** QFUN. MSc. Microbiologia. Instituto de Biotecnologia de la Universidad Nacional de Colombia.

*** QFUN. MSc. PhD. Instituto de Biotecnologia de la Universidad Nacional de Colombia. Correo electronico: dmontoyac@unal.edu.co

**** QFUN. PhD. Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.
Tabla 1. Clones secuenciados y registrados en GenBank

                                                           NUMERO
CLON           LONGITUD   GENES ENCONTRADOS                GENBANK

pBsIBUN22A-1     851      Contiene el extremo 5'del gen    AY968605
                          dhaB1 que codifica para
                          Glocerol Deshidretasa

pBsIBUN22A-2     808      Contiene el gen [TEXTO           DQ002548
                          IRREPRODUCIBLE EN ASCII.], que
                          codifica para la [TEXTO
                          IRREPRODUCIBLE EN ASCII.] de
                          blosintesis del confactor Fe
                          -Mo de la nitrogenasa. El
                          extremo t7 de la secuencia 16
                          de Corea no pudo ser alineado
                          con esta secuencia,
                          probablemente porque xiste una
                          region no secuendiada del
                          inserto entre los dos extremos
                          y por ello al extremo t7 se le
                          [TEXTO IRREPRODUCIBLE EN
                          ASCII.] pBsIBUN22A-2-B

pBsIBUN22A-3     228      Contiene el gen tufA que         DQ060835
                          codifica para el Factor de
                          Elongacion TU.

011901-2         951      No se identificaron genes.       DQ223957

012901-20        1002     No se identificaron genes.       DQ223968

020801-30        716      Contiene el extremo 3' de un     DQ225170
                          gen que codifica para Purina-
                          nucleosido Fostoritese, con
                          secuencia conservada en
                          Clostridium.

pBs25            591      El dominio C-terminal del gen    DQ228721
                          Transcetolasa.

020803-16        342      Contiene el extremo 5' del       DQ228722
                          dominio de union a piridina
                          [Transket_pyr] del gen
                          Transcetolasa.

pBS25-B          665      Contiene el extremo 3' de un     DQ228723
                          gen que codifica para
                          Purina-nucleisido Fostorilasa.
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Author:Montoya Solano, Jose David; Suarez Moreno, Zulma Rocio; Montoya Castano, Dolly; Aristizabal Gutierre
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2006
Words:4089
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