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Aislamiento de Morganella morganii morganii en leche de cabra: a proposito de un caso de mastitis subclinica.

Isolation of Morganella morganii morganii in goat milk: report of a case of subclinical mastitis

INTRODUCCION

La infeccion intramamaria en cabras (Capra hircus) constituye un grave problema de salud animal, dado que altera la composicion de la leche, disminuye su calidad bacteriologica, desmejora las condiciones para su procesamiento y causa grandes perdidas economicas en la industria lechera [37, 39].

La mastitis subclinica no suele causar signos evidentes en el animal o en la leche [3], por lo tanto, no puede ser diagnosticada mediante examen fisico o evaluacion directa, por ello es necesario realizar el contaje de celulas somaticas o cultivo de la leche a fin detectar la presencia de agentes patogenos intramamarios [42]. En este orden de ideas, una de las pruebas cualitativas mas utilizadas para determinar la presencia de celulas somaticas en leche de cabra es el California Mastitis Test (CMT) [17]; segun Stuhr y Aulrich [37], esta prueba permite estimar el numero aproximado de celulas inflamatorias y epiteliales en una muestra de leche con un alto nivel de correlacion con los valores del contaje de celulas somaticas en leche de cabra, por lo cual juega un papel crucial en la deteccion de infeccion intramamaria subclinica en caprinos. Igualmente, los resultados obtenidos al comparar el CMT con los cultivos bacteriologicos de leche de cabra avalan la importancia de esta prueba a nivel de campo en el diagnostico de mastitis subclinica en caprinos [25].

La incidencia de mastitis clinica o subclinica en cabras varia en funcion de diversos factores como las condiciones nutricionales, sanitarias y de manejo de cada unidad de produccion (UP); esta patologia, ademas de su impacto economico puede tener efectos negativos sobre la salud publica [22].

Al respecto, Najeeb y col. [27] refieren que, los principales microorganismos involucrados en la etiologia de mastitis clinica o subclinica en cabras lecheras son Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli, Streptococcus spp. y especies de los generos Corynebacterium, Brucella, Bacillus y Pseudomonas. Entre estas especies, S. aureus es el principal causante de mastitis en cabras lecheras, sin embargo, la prevalencia y la importancia de los diferentes agentes etiologicos pueden variar en funcion de las regiones geograficas. Esta situacion se ve acentuada en UP, donde la suma de factores, entre ellos, la baja productividad por animal, el sistema de ordeno, las condiciones de explotacion, factores climaticos adversos y la dispersion de las actividades productivas en grandes areas geograficas, dificulta el monitoreo de la calidad sanitaria de la leche [18].

La tasa de incidencia de mastitis subclinica en cabras frecuentemente supera el 30%, siendo los estafilococos coagulasa negativo, S. aureus y estreptococos, los principales microorganismos identificados [3]. Se han reportado datos similares en varias regiones a nivel mundial, tal como lo demuestran investigaciones realizadas en Estados Unidos, Gran Bretana, Francia y Espana donde se han identificado cifras de 36; 36; 33 y 18%, respectivamente [42].

En el estado Falcon, en un estudio llevado a cabo por Clavijo y col. [6] se encontraron seis agentes etiologicos bacterianos implicados en los casos de mastitis subclinica en cabras, a saber: S. aureus (62%), E. coli (10,3%), Streptococcus dysgalactiae (10,3%), Streptococcus uberis (6,8%), Enterobacter aerogenes (6,8%) y Mycoplasma spp. (3,4%), con un porcentaje de positividad de 69% de las cabras muestreadas en su estudio.

En otro orden de ideas, Klinger y Roshenthal [18], al evaluar la presencia de enterobacterias en el proceso de elaboracion y maduracion de queso duro de cabra revelaron alteraciones de la flora microbiana a lo largo de la linea de produccion. Se identificaron abundantes especies bacterianas en leche cruda de cabra, tales como Serratia liquefaciens, Morganella morganii, Hafnia alvei, Klebsiella oxytoca y Yersinia enterocolitica.

Entre estas especies, M. morganii es frecuentemente aislada de heces, particularmente de seres humanos con diarrea y algunas cepas pueden ser causantes de esta condicion [36]. Aunque este microorganismo esta ampliamente distribuido entre varias especies, raramente causa enfermedad en individuos sanos, sin embargo, los casos clinicos descritos cursan con cifras importantes de severidad y mortalidad, quizas por la multiresistencia a antimicrobianos, sobre todo hacia cefalosporinas de primera generacion y ampicilina-clavulanato [21], tal como ha sido reportado tras el aislamiento de esta especie bacteriana en pollos, donde la cepa identificada mostro una alta tasa de resistencia a los antibioticos de uso frecuente, entre ellos: ampicilina, cefalosporinas de primera generacion (cefalexina, cefalotina y cefadrina) y eritromicina, asi como claritromicina, kanamicina y vancomicina; no obstante, se encontro sensibilidad a cefotaxima, cefoperazona, neomicina y norfloxacina [43].

M. morganii es una enterobacteria, inicialmente catalogada como la unica especie del genero, la cual consta de dos subespecies: morganii y sibonii. La diferenciacion entre ambas se basa en la fermentacion de la trehalosa, siendo M. morganii sibonii, trehalosa positivo [30]. Sin embargo, mas recientemente, Baylis y col. [2] refieren que ha sido identificada una nueva especie, Morganella psychrotolerans, con dos subespecies morganii y sibonii, en vista de los hallazgos que demuestran su capacidad de tolerar y crecer a temperaturas de 0 a 2 [grados]C, encontrandose un 98,6% de similitud en las secuencias del gen 16S rRNA con los aislados mesofilos [9].

En este reporte, se presento un caso de mastitis subclinica en una cabra lechera, en cuya muestra se realizo aislamiento e identificacion de M. morganii morganii mediante tecnicas bacteriologicas convencionales y evaluacion de la susceptibilidad a los antimicrobianos, siendo el primer caso descrito en el estado Falcon, Venezuela.

MATERIALES Y METODOS

Luego de establecido el diagnostico de mastitis subclinica por parte del Medico Veterinario encargado de la UP mediante la prueba cualitativa CMT y solicitado el apoyo diagnostico al laboratorio de Microbiologia Veterinaria de la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda (UNEFM), bajo condiciones de asepsia, con previo lavado y secado de la ubre y luego de descartar los tres primeros chorros, se tomaron muestras de leche de los medios afectados de las ubres de las cabras [24], las cuales son criadas en un sistema intensivo en una UP caprina ubicada en la comunidad El Recreo, municipio Miranda del estado Falcon, region caracterizada por un clima muy calido y escasamente lluvioso, con temperatura promedio superior a 26,0[grados]C y 300 a 699 mm3 de pluviosidad al ano [20].

Las muestras se trasladaron inmediatamente y bajo refrigeracion al laboratorio donde se procedio a su analisis bacteriologico.

Una de las muestras de leche, proveniente de una cabra mestiza Nubian--Alpino frances, de dos partos, fue procesada considerando el protocolo diagnostico del laboratorio de la UNEFM; se realizo cultivo para aislamiento primario mediante la tecnica de siembra por diseminacion y estrias en placas de agar sangre (BBL[TM], EUA), agar MacConckey (BBL[TM], EUA) y agar manitol salado (BBL[TM], EUA), fueron incubadas a 37[grados]C en condiciones de aerobiosis y microaerofilia (solo para agar sangre). Se realizaron lecturas a las 24 y 48 horas (h) de incubacion para la caracterizacion macroscopica de las colonias, verificando la pureza mediante realizacion de frotis y coloracion de Gram [19]. Las colonias aisladas fueron resembradas en agar inclinado Brain Heart Infusion (BHI) (BBL[TM], EUA) e incubadas a 37[grados]C durante 24 h, a fin de obtener cultivos puros [19, 23] para su posterior identificacion bioquimica.

Luego, se efectuaron las pruebas de catalasa y oxidasa, rojo de metilo, Voges-Proskauer, produccion de indol, reduccion de nitratos, uso del citrato como fuente de carbono, desaminacion de la fenilalanina, motilidad, hidrolisis de la gelatina y la urea, utilizacion del malonato, fermentacion de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa y trehalosa), produccion de gas y H2S, las cuales son recomendadas para la identificacion de enterobacterias [4, 16, 19, 23, 40] siendo claves para la caracterizacion de aislados de M. morganii [13, 15, 43], y en virtud de que estos microorganismos presentan poca variabilidad fenotipica [13, 15], no se estila realizar comparaciones con cepas de referencia [13, 15, 43].

Una vez identificado el especimen bacteriano, se procedio a realizar el montaje del ensayo de susceptibilidad a antimicrobianos segun la tecnica de Difusion en Disco [1, 7], aunque este metodo no es el mas confiable, ha sido aprobado por el Grupo Ad hoc de expertos en resistencia a antimicrobianos de la OIE [41] realizando la seleccion de los antibioticos y la lectura e interpretacion de los halos de susceptibilidad de acuerdo a los estandares del CLSI [8], tal y como se ha efectuado para M. morganii en otras investigaciones [15, 17, 43], tratando de evaluar en la medida de las disponibilidades, antibioticos de uso clinico, tanto en el campo de la medicina humana como en veterinaria [10, 29], por lo cual, se incluyeron farmacos como: ampicilina 10 [micro]g (Himedia[R], India), amoxicilina-acido clavulanico 30 [micro]g (BBL[TM], EUA), amikacina 30 [micro]g (BBL[TM], EUA), ciprofloxacina 5 [micro]g (Liofilchem[R], Italia) [8, 28].

RESULTADOS Y DISCUSION

En agar MacConckey se evidenciaron colonias redondas, de bordes lisos, elevadas, traslucidas y de aproximadamente 1 mm de diametro a las 24 y 48 h de incubacion en las zonas de inoculacion, descartando la posibilidad de contaminantes ambientales. La observacion microscopica de los frotis tenidos mediante la tincion de Gram revelo cocobacilos Gram negativos, los cuales resultaron ser positivos a la prueba de catalasa y negativos a la reaccion de oxidasa [9], de manera semejante a otras enterobacterias (Ej.: Proteus spp. y Providencia spp.), la cepa aislada no fermento la lactosa, mostro motilidad y se evidencio la produccion de fenilalanindesaminasa [33], ademas del resultado positivo a las pruebas de Rojo de Metilo y Ureasa [13, 15], siendo que la mayoria de los especimenes descritos de M. morganii son moviles [36].

Estos datos fenotipicos preliminares permitieron ubicar la bacteria aislada en el genero Morganella, que al conjugarse con la informacion obtenida del resto de las pruebas bioquimicas (TABLA I), permitio finalmente identificarle como M. morganii subespecie morganii, especialmente por el resultado negativo a la fermentacion de la trehalosa [10, 13, 15, 30], teniendo en especial consideracion que los aislamientos de M. morganii presentan poca variabilidad fenotipica en los ensayos bioquimicos [13, 15].

El aislamiento resulto sensible a la amikacina y resistente a la ampicilina, la amoxicilina/acido clavulanico y ciprofloxacina [35], coincidiendo con otros reportes de aislamiento de M. morganii en leche caprina [17], en casos clinicos humanos [5] y ensayos in vitro [28], mientras que otras fuentes describen la multiresistencia a varias familias de antimicrobianos [21,43]. El perfil de resistencia observado en la cepa aislada en esta ocasion, permite inferir que probablemente se deba a la presencia de una p lactamasa de la familia AmpC codificada cromosomicamente [21], de manera semejante a lo descrito para Providencia spp. [30]. Todo esto deja claro la existencia de altos niveles de resistencia bacteriana a los antibioticos, lo cual podria atribuirse al uso indiscriminado que se ha dado a estos farmacos [5].

La presencia de microorganismos potencialmente patogenos en la leche de cabra, ya sea por mastitis subclinica o por contaminacion secundaria durante su procesamiento, es un elemento de riesgo para la salud publica y animal, ademas de las conocidas implicaciones negativas en la produccion de leche [26] y el impacto economico asociado [39], ya que genera cambios significativos en su composicion y en el rendimiento de la produccion lactea [34].

Adicionalmente, M. morganii ha sido aislada en insectos comunes en lecherias, considerando a los artropodos como posibles vectores mecanicos que facilitarian la contaminacion de los productos lacteos con importantes patogenos [12], sin embargo, esta bacteria ha sido reportada como causante de infecciones intramamarias subclinicas en cabras con una baja frecuencia [17]; ahora bien, su potencial riesgo a la salud humana queda en evidencia al relacionarse con casos de sepsis neonatal [5] y otros cuadros clinicos severos [21], recordando la idiosincrasica costumbre en ciertos hogares de usar la leche de cabra sin pasteurizar, como reemplazo de la lactancia materna [14, 31] hecho tangible en las comunidades rurales falconianas y en otras zonas donde la cria caprina esta ampliamente difundida.

Por otra parte, M. morganii esta asociada a la generacion de histamina en alimentos ricos en histidina que no han sido preservados adecuadamente, con la consecuente intoxicacion alimentaria; este fenomeno ha sido relacionado principalmente con el consumo de ciertas especies de pescado [9,11,32] y en quesos de cabra [31], ya que este aminoacido es el octavo mas abundante en la leche de cabra y alcanza concentraciones de hasta 0,45 mg/dL, mas elevadas que las detectadas para la de ovinos (Ovis aries) [38].

CONCLUSIONES

Este es el primer reporte de M. morganii subespecie morganii aislada a partir de una muestra de leche de cabra criada bajo condiciones intensivas en el estado Falcon, por lo que se requiere profundizar en la identificacion de los agentes etiologicos de los casos de mastitis clinica y subclinica en la region.

Las condiciones de la toma de muestra sugieren que M. morganii es el causante de la infeccion intramamaria subclinica, no obstante, esta bacteria ha sido implicada en la contaminacion secundaria de la leche y subproductos lacteos.

El patron de resistencia a los antibioticos observado en la cepa evaluada, guarda relacion con los hallazgos de estudios previos, no obstante, es necesaria la evaluacion constante de los patrones de resistencia a los antimicrobianos en las diferentes cepas bacterianas aisladas a nivel de campo en diversos procesos infecciosos.

AGRADECIMIENTO

Especial agradecimiento al personal obrero que labora en el laboratorio de Microbiologia Veterinaria del Programa de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional Experimental "Francisco de Miranda", por la colaboracion prestada en la ejecucion de esta investigacion.

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Recibido: 23/11/2015 Aceptado: 04/03/2016

Victor Chavez-Oberto (1,2) *, Darjis Delgado (3), Leonardo Ruiz (1,3), Lilia Carrero (1,3,4) y Carmen Chirino-Zarraga (1,3)

(1) Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda, Programa de Ciencias Veterinarias, Departamento de Sanidad Animal; (2) Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias FCV-LUZ; (3) Laboratorio de Microbiologia e Inmunologia Veterinaria PCV-UNEFM; (4) Postgrado en Microbiologia del Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas. * Apdo. 7403, Coro, 4101. Area Ciencias del Agro y Mar, UNEFM. Coro. Estado Falcon. Venezuela. E-mail: veco1982@hotmail.com
TABLA I
COMPARACION ENTRE LAS CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS DE LA CEPA AISLADA
Y LAS SUBESPECIES DE Morganella morganii

                                            M. morganii     M. morganii
                                             morganii         sibonii
                                 Cepa        Biogrupos       Biogrupos
Caracteristicas bioquimicas     aislada      (A,B,C,D)        (E,F,G)

Produccion de indol                +             +               +
  (triptofanasa)
Rojo de metilo                     +             +               +
Voges-Proskauer                    -             -               -
Hidrolisis del citrato (medio      -             -               -
  Citrato de Simmons)
Ureasa                             +             +               +
Fenilalanina desaminasa            +             +               +
Motilidad                          +          50 (c)             +
Hidrolisis de la gelatina          -             -               -
Utilizacion del malonato           -           5 (b)             -
Reduccion de nitratos              +             +               +
Fermentacion de glucosa            +             +               +
Produccion de gas                  +             +               +
Produccion de [H.sub.2]S           -      15 (a) ; 25 (b)     22 (b)
  en agar TSI
Fermentacion de la Lactosa         -             -               -
Fermentacion de la Maltosa         -             -               -
Fermentacion de la Trehalosa       -             -               +

(a,b,c,d,e,f,g) Solo en el % de los aislamientos del biogrupo
correspondiente. [13, 30].
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Author:Chavez-Oberto, Victor; Delgado, Darjis; Ruiz, Leonardo; Carrero, Lilia; Chirino-Zarraga, Carmen
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Article Type:Ensayo
Date:Mar 1, 2016
Words:4147
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