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Agro-industrial residues utilization of palm oil for lipase production by Aspergillus niger/Aproveitamento de residuos da agroindustria do oleo de dende para a producao de lipase por Aspergillus niger.

INTRODUCAO

Enzimas sao proteinas com atividade catalitica que possibilitam inumeras reacoes quimicas em condicoes muito suaves, comparativamente aos processos quimicos tradicionais. As lipases sao empregadas em mais de 20% das biotransformacoes de sintese organica (JAYAPRAKASH & EBENEZER, 2010). Essas enzimas podem ser usadas para catalisar a sintese de esteres de acidos carboxilicos, componentes importantes de aromas naturais empregados na industria alimenticia, que contribuem na formacao e acentuacao dos aromas em alimentos ou em catalisar a hidrolise de triacilglicerois aos acidos graxos correspondentes e glicerol, como na producao de biodiesel por esterificacao de oleos vegetais (JAEGER et al., 1993; MACEDO & PASTORE, 1997; FERNANDES, 2007). As lipases podem atuar tanto em meio aquoso quanto em meio organico, com teor de agua restrito, e sao consideradas carboxilesterases que atuam em substratos emulsificados (CASTRO et al., 2004).

A popularizacao do uso de enzimas, que esbarra no elevado custo das enzimas comerciais, e depende da escolha de micro-organismos mais eficientes, de meios de cultivos mais baratos ou de processos fermentativos mais adequados que, dessa forma, possibilitem aumentar a produtividade e o rendimento, reduzindo custos e ampliando a producao (SANTOS, 2014).

As linhagens de Aspergillus niger tem se mostrado mais promissoras para produzir lipase extracelular, o que facilita a recuperacao da enzima (AGUIAR & MENEZES, 2000; MESSIAS et al., 2011).

Aproducao de enzimas de baixo custo passa, tambem, pela utilizacao de residuos agroindustriais, como suporte e substrato para o agente fermentativo. Diferentes combinacoes de residuos agroindustriais tem sido testadas para a producao de lipase, como torta de babacu com oleo de oliva (CASTILHO et al., 2000) e oleo de mamona com farelo de trigo (DUTRA et al., 2008). O residuo resultante da extracao do oleo da amendoa do dende ou palmiste (torta de dende), usada quase que na sua totalidade na alimentacao animal, possui alto conteudo de fibra, teor de proteina bruta de 14% a 15%, 3% a 5% de oleo residual, cerca de 11% de agua, 48% de carboidratos e 4% de cinzas (FURLAN JUNIOR, 2006).

Ainda vinculada a industria do oleo de dende, a borra alcalina, subproduto do refino de oleos comestiveis durante a etapa de neutralizacao alcalina do oleo, representa um grande problema ambiental. Ela consiste de uma mistura de sabao, oleo arrastado, substancias insaponificaveis, gomas, fosfatideos, pigmentos, agua e acidos graxos (MURUCI, 2012).

Neste trabalho, objetivou-se avaliar o desempenho de duas linhagens de Aspergillus niger para a producao de lipases por fermentacao em estado solido (FES). Os meios de cultivo foram formulados a partir da torta de dende (palmiste) e da borra alcalina do refino do oleo de dende (borra de dende), residuos da agroindustria do oleo de dende.

MATERIAL E METODOS

Manutencao e ativacao dos micro-organismos

Os agentes da fermentacao foram os fungos filamentosos Aspergillus niger 11T53A14 (mutante obtido por tecnica convencional de exposicao a agente mutagenico) e Aspergillus niger C (selvagem), pertencentes a Colecao de Culturas da Embrapa Agroindustria de Alimentos e bons produtores de lipase (MURUCI et al., 2012; SANTOS et al., 2014). As linhagens foram mantidas e ativadas em meio basico, em gelose inclinada, tendo como fonte de carbono o oleo de oliva e contendo os seguintes elementos (g [L.sup.-1]): nitrato de sodio (3,0), sulfato de magnesio (0,5), cloreto de potassio (0,5), sulfato ferroso (0,01), fosfato dibasico de potassio (1,0), agar-agar (30,0) e azeite de oliva (20,0mL [L.sup.-1]) (COURI & FARIAS, 1995).

Producao dos esporos

Apos inducao na gelose com oleo de oliva, foram adicionados 20mL de solucao aquosa 0,3% de Tween 80 sobre os conidios da gelose inclinada para, assim, obter uma suspensao de esporos. Um mililitro dessa suspensao foi transferido para o meio de sabugo de milho moido (COURI & FARIAS, 1995). Esse meio foi preparado a partir do sabugo de espigas de milho . O sabugo foi seco a 100[degrees]C em estufa com aeracao por 4 horas e moido em moinho de facas (granulometria de 3-4mm). Para preparacao do meio solido de producao de esporos, sao adicionados, por grama de sabugo de milho, 1,3mL de uma solucao com nutrientes contendo peptona (56,0g [L.sup.-1]), fosfato de potassio monobasico (0,76g [L.sup.-1]), sulfato de zinco (19,8mg [L.sup.-1]), sulfato de ferro (23,0mg [L.sup.-1]) e sulfato de manganes (0,05mg [L.sup.-1]). Os frascos conicos de 125mL com 4,6g do meio de sabugo foram autoclavados a 1atm por uma hora e, apos resfriamento e inoculacao dos esporos, foram incubados por cinco dias a 32[degrees]C. Os frascos contendo os esporos foram mantidos por ate um mes a 4[degrees]C.

Preparo do inoculo para a producao de lipase

Para o preparo do inoculo, foram adicionados 20mL de uma solucao aquosa, 0,3% de Tween 80 por frasco de meio de sabugo de milho contendo os esporos. Apos filtracao com gaze, a concentracao de esporos foi determinada por contagem em Camara de Neubauer. O inoculo foi padronizado em 106 esporos por grama de meio de fermentacao.

Materias-primas

A torta e a borra de dende, foram fornecidas pela Industria de Extracao da Amazonia, localizada em Belem (PA). Ambos os residuos foram transportados congelados e armazenados em freezer. Para verificar a necessidade de se adicionar substancias complementares na formulacao dos meios. foram determinadas a composicao centesimal e o teor de umidade, de acordo com AOAC (2011).

Pre-tratamento da torta de dende

A torta de dende foi seca em estufa a 60[degrees]C por 8 horas, para melhor conservacao durante a armazenagem. Apos secagem, a torta foi triturada em moinho de facas para padronizacao das particulas solidas na granulometria de 6mm.

Preparo dos meios para fermentacao em estado solido O meio para fermentacao foi composto por 100g de torta de dende (massa seca), umidificada com 80mL de solucao salina (NaCl 0,85%), pH 7,0, ou 80mL de solucao de sulfato de amonio (1,2% p/v), pH 7,0, e adicionado ou nao de indutores (borra alcalina) na concentracao de 3% (p/p), de acordo com resultados obtidos por MURUCI et al. (2012). A seguir, 40g do meio foram colocados em frasco Erlenmeyer para esterilizacao a 121[degrees]C, a 1atm por 15min.

Determinacao da umidade do meio de fermentacao A umidade das amostras foi realizada antes da fermentacao e com o meio inoculado. A analise foi determinada por gravimetria, por secagem em estufa a 100[degrees]C ate peso constante.

Producao de lipase por fermentacao em estado solido Os experimentos de producao da enzima foram conduzidos em colunas aeradas, incubadas em banho-maria a 32[degrees]C e alimentada com 1,0vvm (volume de ar por volume de meio por minuto) de ar, baseado nos experimentos de MACEDO et al. (2009), que tambem estudaram a producao de lipase por A. niger em borra de milho e farelo de trigo por FES. Cada coluna recebeu 40g de meio de fermentacao. Na primeira etapa, Aspergillus niger 11T53A14 foi inoculado no meio de cultivo contendo como substrato a torta de dende em tres diferentes condicoes: umidificada com solucao salina; umidificada com solucao de sulfato de amonio; e umidificada com solucao de sulfato de amonio e 3% de indutor (borra alcalina de dende). Na segunda etapa, Aspergillus niger 11T53A14 ou Aspergillus niger C foram inoculados no meio otimizado com torta de dende umidificada, com 80mL de solucao de sulfato de amonio e com adicao de 3% de borra de dende como indutor. Os processos foram conduzidos por 96 horas e os valores expressos representam a media de dois experimentos em duplicatas.

As analises estatisticas foram realizadas utilizando-se o programa STATISTICA 12 da StatSoft, Inc. Na comparacao das medias dos tratamentos, usou-se o teste de Fisher LSD, ao nivel de probabilidade de 5%.

As variaveis de processo estudadas para a producao de lipase foram: necessidade de adicao de sulfato de amonio (80mL por 100 gramas de meio); necessidade de adicao de 3% de indutor (3g de borra de oleo de dende por 100g de meio).

A enzima foi extraida com a adicao de 2,5mL de tampao fosfato de sodio (pH 7,0) por grama de meio fermentado, permanecendo por 1 hora sob agitacao de 90 oscilacoes por minuto em shaker, com banho a 32[degrees]C (Thermo Scientific Precision Reciprocal Shaking Water Bath 50). O extrato enzimatico bruto foi filtrado em papel de filtro e depois em membrana de microfiltracao (0,45pm), para posterior determinacao do teor de proteina total (LOWRY et al., 1951) e da atividade lipasica.

Determinacao de atividade lipasica

A determinacao da atividade lipasica no extrato bruto foi realizada por metodo titulometrico, segundo o procedimento descrito por PEREIRA et al. (2001), com pequenas modificacoes: adicionouse 1mL do extrato enzimatico a 4mL de tampao citrato de sodio 50mM pH 4,0 e 5mL de emulsao de goma arabica (48mL de agua destilada, 48mL de oleo de oliva e 7g de goma arabica). Apos 15min a 35[degrees]C, a reacao foi interrompida com a adicao de 10mL de uma solucao 1:1:1 de acetona/etanol/ agua e a titulacao realizada com NaOH (0,05N), ate pH final 11,0, e o resultado foi expresso em U por grama de substrato seco (U [g.sub.ss.sup.-1]). O branco da reacao foi realizado adicionando-se a enzima no momento da titulacao. Uma unidade de atividade lipasica foi definida como a quantidade de enzima que produz 1pmol de acidos graxos (oleico) por minuto, sob as condicoes de ensaio padrao. Toda a analise foi feita em duplicata para os brancos e em triplicata para as amostras.

RESULTADOS E DISCUSSAO

Caracterizacao da torta e da borra de dende

A analise centesimal da torta de dende (Tabela 1) mostrou haver uma boa quantidade de proteinas (4,08g 100[g.sup.-1]), embora esse valor seja muito inferior aquele encontrado no farelo de trigo (13,8g 100[g.sup.-1]) por SILVEIRA & BADIALE-FURLONG (2007), um residuo bastante recomendado como substrato para o desenvolvimento de fungos, visando a producao de lipases (KUMAR et al., 2011; REHMAN et al., 2011; TOSCANO et al., 2013; DAYANANDAN et al., 2013). O teor de lipideos na torta de dende (7,81g 100[g.sup.-1]) pode ser considerado satisfatorio para promover a inducao e a sintese de lipases, pois se mostrou superior ao valor encontrado no farelo de trigo por SCHUBER et al. (2012). Estudos anteriores utilizando a cepa Aspergillus niger C mostraram que o farelo de trigo ja possuia um teor de lipideos suficiente para producao de lipases e que a adicao de diferentes borras, como de girassol, de milho e de canola, nao aumentou a producao da enzima (MURICI et al., 2012). A borra de dende testada como indutor apresentou em sua composicao 97,86% de lipideos, valor semelhante ao reportado por SANTOS et al., 2014.

Avaliacao do uso da torta de dende como suporte e substrato para a producao de lipase por Aspergillus niger 11T53A14

Os resultados apresentados na figura 1 mostram que o meio contendo exclusivamente torta de dende umedecida com solucao salina e 60% de umidade, conduziu a uma baixa producao de lipase por A. niger 11T53A14 em 72h (10,64U [g.sub.ss.sup.-1]), seguida de uma reducao para 2,45U [g.sub.ss.sup.-1], em 96 horas. Na mesma figura, observa-se que a complementacao da torta de dende com sulfato de amonio (1,2%) aumentou a maxima atividade enzimatica produzida em 4,6 vezes, elevando-a para 49,19U [g.sub.ss.sup.-1], alem de reduzir o tempo de processo de 72 para 48 horas, tambem seguido de uma reducao para 33,61U [g.sub.ss.sup.-1] em 72 horas. Esse declinio pode ser devido ao termino do indutor presente ou dos lipideos presente na torta de dende. A presenca de proteases no extrato enzimatico produzido por fungos tambem pode influenciar na perda de atividade enzimatica (AZEREDO et al., 2001) e CASTRO (2006).

O aumento da producao da lipase mostrou a importancia da suplementacao de uma fonte de nitrogenio a torta de dende. Esses resultados estao de acordo com os obtidos por PALMA et al. (2000), em que a maior atividade lipasica (27,8U [g.sub.ss.sup.-1]) produzida por Penicillium restrictum, em FES, foi obtida quando a torta de babacu foi enriquecida com peptona. MURUCI (2012) obteve valores expressivos em meio com farelo de trigo (201,81U [g.sub.ss.sup.-1] em 72 horas), substrato que contem consideravel teor de proteinas, quando comparado a outras fontes. A escolha de uma fonte de nitrogenio adequada e um fator importante ao processo de fermentacao industrial, pois tem um grande impacto sobre os custos e tambem pode afetar seletivamente o crescimento celular e a formacao de produto, em resposta as medidas bioquimicas basicas relacionadas com a sua utilizacao por parte da celula (GOTTSCHALK et al., 2013). A complementacao da torta de dende com sulfato de amonio utilizada nesse trabalho, aumentou a maxima atividade enzimatica e reduziu o tempo de processo, melhorando a produtividade.

Os experimentos realizados com o objetivo de avaliar a influencia da adicao de uma fonte lipidica (borra de dende) como indutor da producao de lipases por A. niger 11T53A14, quando cultivado em meio contendo torta de dende umedecida com solucao sulfato de amonio (1,2%) na proporcao 1:0,8, permitiram observar que a adicao de 3% de borra de dende aumentou consideravelmente a atividade enzimatica (Figura 1). O valor maximo atingido de 72,57 U.[g.sub.ss.sup.-1] em 48 horas foi 47,5% maior do que aquele obtido no meio sem indutor (49,19U [g.sub.ss.sup.-1] em 48h). Nesse caso, nao foi observada uma reducao da atividade, que se manteve num plato, devido a presenca do indutor e de uma maior concentracao de lipideos nesse meio. Esses resultados corroboram os resultados obtidos em trabalhos anteriores, em que a producao de lipase por A. niger 11T53A14 em FES, com farelo de trigo como substrato, na presenca de 3,0% de borra de girassol (201,8U [g.sub.ss.sup.-1]), foi maior do que na ausencia de indutor (182,35U [g.sub.ss.sup.-1]) (SANTOS et al., 2014). MALA et al. (2007) tambem estudaram diferentes combinacoes de indutores para a producao de lipases de A. niger em FES. Segundo os autores, o farelo de trigo adicionado da torta do oleo de gergelim na proporcao 3:1, possibilitou a obtencao de atividade lipasica de 384U [g.sub.ss.sup.-1].

Apesar dos resultados inferiores aos encontrados com o farelo de trigo, a torta de dende demonstra ser um substrato promissor, considerandose haver, ainda, a possibilidade da melhoria do processo de producao. Como a borra e um residuo do refino de oleos, pode haver a presenca de inibidores/ contaminantes neste material, que, em concentracoes elevadas, podem inibir a sintese da enzima. Alem disso, grandes quantidades de borra podem dificultar a transferencia de massa no meio, um dos principais problemas encontrados para a FES. A analise estatistica dos resultados desse bloco de ensaios mostrou haver diferencas significativas (P<0,05) entre os valores comparados.

A comparacao da producao da lipase por uma cepa mutante Aspergillus niger 11T53A14 e por uma selvagem Aspergillus niger C foi tambem avaliada nas condicoes otimizadas (meio torta de dende umidificado com 80% solucao de sulfato de amonio e adicionado de 3% de borra de dende). Os resultados estao na figura 2.

Os resultados mostraram que A. niger 11T53A14 atingiu valor maximo (72,57U [g.sub.ss.sup.-1] em 48h) muito proximo ao de A. niger C (67,49U [g.sub.ss.sup.-1]). Os valores maximos da concentracao de proteina extracelular obtidos foram semelhantes para os dois fungos avaliados, 6,3g [L.sup.-1] e 6,5g [L.sup.-1] para o A. niger 11T53A14 e o A. niger C , respectivamente. Embora nao haja diferenca significativa entre os valores da atividade enzimatica (P<0,05), o tempo de fermentacao para alcanca-lo foi consideravelmente maior (72-96h). Portanto, a linhagem A. niger 11T53A14 mostrou-se mais produtiva por ter produzido, em 48 horas, a atividade maxima que a linhagem A. niger C atingiu somente apos 72 de processo.

CONCLUSAO

A torta de dende pura mostrou ser um substrato incompleto para a producao de lipase por A. niger 11T53A14, necessitando ser suplementado com fonte de nitrogenio pela adicao de solucao de sulfato de amonio.

A adicao de 3% de borra de dende ao meio de fermentacao a base de torta de dende com sulfato de amonio mostrou influenciar positivamente a producao de lipase por A. niger 11T53A14, uma vez que foi capaz de aumentar a maxima atividade em 47,5%.

A comparacao do desempenho de A. niger 11T53A14 (mutante) com uma cepa selvagem (A. niger C) mostrou que o meio composto por torta de dende adicionado de sulfato de amonio e borra de dende induziu ambas as linhagens a produzir lipases com bons niveis de atividade, alem de reduzir o tempo de processo de fermentacao de 72 para 48 horas, quando foi utilizada a cepa mutante.

Portanto, os resultados mostraram ser possivel aproveitar os residuos do processo de fabricacao do oleo de dende (torta e borra) para a producao de lipase por Aspergillus niger 11T53A14 e, consequentemente, contribuir para reduzir seu custo de obtencao.

http ://dx.doi.org/10.1590/0103-8478cr20131673

REFERENCIAS

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Edmar das Merces Penha (I) * Ludmila de Araujo Nunes Viana (II) Leda Maria Fortes Gottschalk (I) Selma da Costa TerziI Erika Fraga de Souza (I) Sidinea Cordeiro de Freitas (I) Juliana de Oliveira Santos (I) Thais Fabiana Chan Salum (III)

(I) Laboratorio de Processos Fermentativos, Embrapa Agroindustria de Alimentos, Av. das Americas, 29501, 23020-470, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. E-mail: edmar.penha@embrapa.br. *Autor para correspondencia.

(II) Centro Universitario Estadual da Zona Oeste (UEZO), Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

(III) Embrapa Agroenergia, Brasilia, DF, Brasil.

Recebido 18.12.13 Aprovado 04.08.15 Devolvido pelo autor 03.12.15 CR-2013-1673.R4

Tabela 1--Composicao centesimal da torta e da borra de dende e
do farelo de trigo.

Determinacao            Torta de   Borra de   Farelo de
(g 100 [g.sup.-1])      dende      dende      trigo * (1)

Carboidratos totais     58,78      1,45       60,1
Proteinas               4,08       ND * (2)   13,8
Extrato Etereo          7,81       97,86      5,2
Cinzas                  3,99       0,003      6,3
Umidade                 25,34      0,69       9,4

* (1) Valores obtidos de SILVEIRA & BADIALE-FURLONG
(2007).

* (2) ND--abaixo do limite de deteccao.
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Title Annotation:tecnologia de los alimentos; texto en portugues
Author:Penha, Edmar das Merces; Viana, Ludmila de Araujo Nunes; Gottschalk, Leda Maria Fortes; Terzi, Selma
Publication:Ciencia Rural
Date:Apr 1, 2016
Words:3866
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