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Adaptacion de una cepa compatible con Acidithiobacillus ferrooxidans sobre concentrados de calcopirita (CuFe[S.sub.2]), esfalerita (ZnS) y galena (PbS).

Adaptation of a strain Acidithiobacillus ferrooxidans compatible on concentrates of chalcopyrite (CuFe[S.sub.2]), sphalerite (ZnS) and galena (PbS)

Introduccion

La biolixiviacion de sulfuros metalicos ha despertado gran interes en las ultimas decadas debido al agotamiento de menas de alto grado, lo cual hace necesario encontrar nuevas tecnologias "ambientalmente mas amigables" que permitan el beneficio de menas de bajo tenor (Brierley y Luinstra, 1993; Marsden y House, 1992; Watling, 2006).

Los sulfuros utilizados en este trabajo presentan gran importancia industrial. La esfalerita ([Zn.sub.x][Fe.sub.i_x]S) es la fuente primaria de zinc en el mundo, presentando gran interes en aplicaciones industriales como la galvanizacion de aceros, la obtencion de laton y en fabricacion de pinturas (Harmer et al., 2006; Haghshenas et al., 2009).

La calcopirita (CuFe[S.sub.2]) es la fuente primaria de cobre en el mundo, representando el 70% de las reservas. Su beneficio se hace generalmente por pirometalurgia; sin embargo, esta tecnologia genera contaminaciones de S[O.sub.2], principal causante de las lluvias acidas. La investigacion se ha centrado, por tanto, en la hidrometalurgia donde la extraccion de cobre se ve limitada por su caracter refractario (Dutrizac, 1981; Rivadeneira, 2006). La galena (PbS) es un mineral de gran importancia desde dos puntos de vista, 1) como fuente primaria de plomo, y 2) como material semiconductor, con un bandgap aproximado de 0,4 eV (Muscat y Gale, 2003). Ademas, este mineral es importante desde el punto de vista ambiental ya que a menudo es responsable de aumentar la acidificacion de las aguas luego de la explotacion minera (Muscat y Gale, 2003).

La adaptacion de animales, plantas y microorganismos al ambiente es un fenomeno natural. Los organismos adaptados a ambientes especificos por largos periodos de tiempo presentan mejores resultados (Elzeky y Attia, 1995). En los procesos de lixiviacion se realizan generalmente varias etapas de adaptacion del microorganismo con el fin de obtener una mejor velocidad de disolucion del metal de interes (Shahverdi et al., 2001; Shi y Fang, 2004; Xia et al., 2008). En los procesos biohidrometalurgicos, la adaptacion a iones metalicos realizada en cultivos selectivos es el metodo mas popular para lograr una buena actividad de las cepas (Haghshenas et al., 2009).

Los microorganismos comunmente usados en la lixiviacion de sulfuros, Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans metalicos son mesofilos, se presentan en intervalos de temperatura entre los 20 y 45[grados]C; los acidofilos viven en ambientes cuya acidez puede bajar hasta pH < 1, y los quimiolitotrofos, que derivan la energia para llevar a cabo sus procesos metabolicos de compuestos inorganicos (Bozdemir et al., 1996; Rawling et al., 1999; Daoud y Karamanev, 2005), los cuales obtienen la energia necesaria de la oxidacion de compuestos reducidos del azufre y del [Fe.sup.2+] a [Fe.sup.3+]. La diferencia entre estos dos microorganismos es que Acidithiobacillus thiooxidans no es capaz de utilizar la oxidacion del ion ferroso como fuente de energia (Bozdemir et al., 1996; Rawling et al., 1999; Cabrera et al., 2005; Daoud y Karamanev, 2006).

La exposicion de cultivos mesofilos a concentrados de sulfuros metalicos genera inhibicion o disminucion en su actividad, especialmente a altas densidades de pulpa. Este fenomeno se debe a varios factores: 1) menor cantidad de oxigeno disuelto, 2) dano a la pared celular como resultado de la friccion entre las particulas minerales y los microorganismos, y 3) efecto nocivo de los iones metalicos como [Pb.sup.2+] [Cu.sup.2+] y [Zn.sup.2+] (Cabrera et al., 2004; Akcil et al., 2007). Sin embargo, estas bacterias pueden ser adaptadas para tolerar estos factores inhibitorios (Cabrera et al., 2004; Xia et al., 2008). El metodo generalmente usado para adaptar los microorganismos al mineral, en estos proceso, consiste en una serie de cultivos sucesivos en los cuales se incrementa la densidad de pulpa y se disminuye la fuente de energia principal, obligando a los microorganismos a crecer a expensas de la disolucion del mineral (Haghs henas et al., 2009).

En la biolixiviacion de concentrados de esfalerita, calcopirita y galena, un factor que retarda e inhibe la actividad bacteriana es la toxicidad de altas concentraciones de [Zn.sup.2+], [Cu.sup.2+] y [Pb.sup.2+] que se encuentran en la solucion (Rawling et al., 1999; Dopson et al., 2003; Xia et al., 2008). Gentina y Acevedo (2005) encontraron niveles inhibitorios para Acidithiobacillus ferrooxidans. Para el caso del [Cu.sup.2+] y [Zn.sup.2+], una concentracion mayor a 10000 mg/L genero efectos inhibitorios. Aston et al. (2010) observaron que, para el caso del plomo, solo 0,036 mg/L generaban inhibicion. Xia et al. (2008) y Haghshenas et al. (2009 a y b) encontraron que se daba una mejor lixiviacion del [Cu.sup.2+] en las cepas adaptadas de Acidithiobacillus ferrooxidans. Li y Jun-Ke (2000) encontraron resultados similares para la disolucion de [Zn.sup.2+]. Por tanto, una buena adaptacion de los microorganismos al mineral aumenta la tasa de disolucion de los metales de interes.

El proposito de este trabajo fue comparar la adaptacion de una cepa compatible con Acidithiobacillus ferrooxidans a altas densidades de pulpa de calcopirita, esfalerita y galena, aumentando gradualmente el porcentaje de pulpa y disminuyendo la fuente de energia -sulfato ferroso-, y trabajando con dos distribuciones de tamano de particula.

Materiales y metodos

Obtencion y caracterizacion inicial del mineral

Los experimentos se realizaron usando muestras naturales de mineral tomadas en varias minas del departamento de Antioquia. La esfalerita se tomo de la mina El Centeno (Buritica), la galena fue provista por la empresa minera Frontino Gold Mine (Segovia), y la calcopirita fue tomada de la mina La Chorrera (Cisneros). Los minerales fueron sometidos, individualmente, a un proceso de conminucion y concentracion gravimetrica en mesa Wilfley, con el fin de concentrar la fase de interes. Para el caso de la esfalerita, fue necesario realizar un proceso de flotacion espumante. Los concentrados fueron molidos en mortero de agata y tamizado con el fin de asegurar dos distribuciones de tamanos de particula: -200 y -325 de acuerdo con la serie Tyler de tamices. El mineral se esterilizo en autoclave a 18 psi y 120[grados]C por 20 min. Mediante el uso del microscopio optico de luz plana polarizada, modo luz reflejada, marca Leitz Laborolux 11POL, con objetivos de aumento de 10X y 20X en aire y 32X y 50X de inmersion en aceite, se estimo por conteo de puntos, segun norma ASTM D 2799 de 2009, la composicion mineralogica resultante.

Microorganismos empleados

Se utilizo una cepa compatible con Acidithiobacillus ferrooxidans, cedida por el laboratorio de biomineralogia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin. La cepa es proveniente de la mina de carbon "La Angostura" manto "El Vampiro II" ubicada en el municipio de Morales, Cauca. En el estudio hecho por Cardona (2007) se verifico la compatibilidad de dichos microorganismos con Acidithiobacillus ferrooxidans por medio de pruebas bioquimicas. Los microorganismos fueron crecidos previamente en medio T&K con una composicion quimica de 0,5% de (N[H.sub.4])S[O.sub.4]; 0,5% de MgS[O.sub.4]x7[H.sub.2]O; 0,5% de [K.sub.2]HP[O.sub.4] y 33,33 g/L de sulfato ferroso. Durante este proceso se logro aumentar la concentracion celular y obtener una poblacion idonea para inocular los ensayos ~[10.sup.8] celulas/ml, estimada a partir de conteo en camara de Newbauer.

Ensayos de adaptacion

Los microorganismos fueron adaptados independientemente a concentrados de calcopirita, esfalerita y galena, en medio T&K, con reemplazo sucesivo de sulfato ferroso por concentrado de mineral. La primera etapa consistio en 2,5% (p/v) de mineral y 10% (v/v) de sulfato ferroso, el segundo subcultivo 5% (p/v) de mineral y 7,5% (v/v) de sulfato ferroso, el tercer subcultivo 7,5% (p/v) de mineral y 5% (v/v) de sulfato ferroso, el penultimo subcultivo consto de 10% (p/v) de mineral y 2,5% (v/v) de sulfato ferroso, y el ultimo periodo de adaptacion se hizo con 10% (p/v) de mineral y fue inoculado sin adicion externa de sulfato ferroso. Los medios fueron acidificados a pH 1,8 con acido sulfurico ([H.sub.2]S[O.sub.4]) al 98%; esta solucion fue esterilizada en autoclave a 120[grados]C por 20 min. Los experimentos se inocularon con 10% (v/v) y una poblacion de [10.sup.8] celulas/ml, la cual fue determinada por conteo en camara de Newbauer. Los ensayos de biolixiviacion se llevaron a cabo por 14 dias en erlenmeyers de 250 ml, utilizando un volumen de trabajo de 100 ml. Se hizo control de evaporacion, diariamente, por perdida de peso. Los ensayos fueron incubados con agitacion de 180 rpm [+ o -] 2 rpm y 30[grados]C [+ o -] 1[grados]C. Todas las condiciones fueron replicadas y se incluyo el respectivo control abiotico.

Medidas de Eh y pH

Cada dos dias se hizo un seguimiento de la cinetica del proceso mediante medidas de pH (HACH HQ40d multi PHC30103) con electrolito KCl y potenciales de oxido reduccion (Shot Handylab 1 Pt 6880) in situ (electrodo de referencia [Ag.sup.0]/AgCl). Las medidas se hicieron en camara de flujo laminar horizontal para garantizar las condiciones de esterilidad en los electrodos empleados y en el sistema. En los ensayos con concentrado de galena (tanto para los ensayos inoculados como los controles abioticos), fue necesario acidificar el sistema con acido sulfurico ([H.sub.2]S[O.sub.4]) con el fin de evitar efectos nocivos en los microorganismos ya que la galena consume protones, aumentando el pH hasta valores superiores a 5,0 como ha sido reportado por Bhatti et al. (1993) y Garcia et al. (1995).

Resultados

Caracterizacion inicial de los minerales

Los analisis al optico mostraron que para la esfalerita la fase mineral principal fue esfalerita (ZnS) 80% con cantidades menores de pirita (Fe[S.sub.2]) 4%, calcopirita (CuFe[S.sub.2]) 10% y cuarzo (Si[O.sub.2]) 6%; la composicion de la calcopirita fue 88% de calcopirita (CuFe[S.sub.2]), 9% de ganga (Si[O.sub.2]), 1% de covelita (CuS) y 2% de molibdenita (Mo[S.sub.2]), para el caso de la galena la concentracion fue 93,3% de galena (PbS), 6,2% de esfalerita (ZnS) y 0,5% de calcopirita (CuFe[S.sub.2]).

Calcopirita (CuFe[S.sub.2]). Potencial de oxido-reduccion (Eh) y pH

En general, todos los subcultivos presentaron una fase de adaptacion seguida de una fase estacionaria para finalmente estabilizarse hacia el final de proceso (figura 1 a, c, e y g). Sin embargo, se presentaron pequenas variaciones en los subcultivos. En la primera etapa la fase de adaptacion o fase lag duro 6 dias para el tamano de particula mas grueso, mientras que para el tamano de particula mas fino duro solo 2 dias (figura 1a). En la segunda etapa el tamano de particula mas fino presento un comportamiento similar que en la etapa anterior, siendo un poco mas larga la fase lag (alrededor de 8 dias), mientras que la malla mas gruesa mostro un crecimiento exponencial desde el inicio del proceso (figura 1 c). En el tercer subcultivo, los dos tamanos de particula presentaron fase lag hasta el dia 4, seguido de una fase exponencial para finalmente estabilizarse. El ensayo realizado con tamano de particula mas fino presento un mayor Eh (620 mV) (figura 1 e).

En el ultimo periodo de adaptacion el comportamiento fue similar. Sin embargo, la fase de adaptacion fue mayor para el tamano de particula mas fino, mientras que el tamano mas grueso duro 2 dias (figura 1g). Es importante anotar que los ensayos no inoculados no presentan cambios aparentes en ninguno de los subcultivos (figura 1 a, c, e y g). En todos los subcultivos se observo que al aumentar el contendido de pulpa se presento un leve incremento en el pH (figura 1b, d, f y h). En el caso del segundo y cuarto subcultivo el pH disminuye y se estabiliza al final de proceso, siendo mas rapido este descenso para el mayor porcentaje de pulpa (figura 1 d y h). El pH en los ensayos no inoculados fue estable solo en el primer subcultivo (figura 1 b). El segundo y tercer subcultivo exhibieron un incremento progresivo del pH en el tiempo (alrededor de 2,8) (figura 1 d y f). En el ultimo subcultivo el tamano de particula mas grueso presento un incremento a lo largo del proceso, mientras que el tamano mas fino no mostro cambios aparentes (figura 1 h).

Esfalerita (ZnxFe1xS). Potencial de oxido-reduccion (Eh) y pH

En general, todos los subcultivos presentaron un comportamiento similar al concentrado de calcopirita, mostrando una fase de adaptacion seguida de una fase de crecimiento exponencial y finalmente una fase estacionaria (figura 2 a, c, e y g). Sin embargo, al igual que para el concentrado de calcopirita, se presentaron pequenas variaciones en los subcultivos. En la primera etapa, la fase lag duro 4 dias para ambos tamanos de particula, seguido de un incremento exponencial hasta el final de proceso (figura 2 a). En el segundo subcultivo se observo un crecimiento exponencial desde el inicio del proceso para ambos tamanos de particula (figura 2 c). El tercer subcultivo presento una fase de adaptacion de cuatro dias para ambos tamanos de particula, seguida de un crecimiento exponencial para finalmente estabilizarse en el tiempo (figura 2 e). El cuarto subcultivo evidencio una fase lag mayor para el tamano de particula mas fino (6 dias), seguida de un crecimiento exponencial hasta el final de proceso. Mientras que el tamano de particula mas grueso mostro una fase lag de dos dias seguida de un crecimiento exponencial para finalmente estabilizarse (figura 2 g). Los ensayos no inoculados no presentaron cambios aparentes en ninguno de los subcultivos de adaptacion (figura 2 a, b, e y g). El comportamiento del pH en general para todos los subcultivos presento un incremento en los primeros dias del proceso para finalmente descender y estabilizarse (figura 2 b, d, f y h). Este aumento inicial en el pH fue mas marcado en el ultimo subcultivo (figura 2 g). Los ensayos no inoculados mostraron un aumento progresivo del pH hasta estabilizase 199 en todos los 200 subcultivos, alcanzando mayor acidez a mayor porcentaje de pulpa (figura 2 b, d, f y h).

Galena (PbS). Potencial de oxido-reduccion (Eh) y pH

Al igual que para el concentrado de calcopirita y esfalerita, se observo la presencia de tres fases caracteristicas en la curvas de Eh: fase de adaptacion o fase lag, fase de crecimiento exponencial y fase estacionaria (figura 3 a, c, e y g). Para los dos primeros subcultivos el comportamiento es muy similar, presentando una fase de adaptacion de 4 dias para el primero y de 2 dias para el segundo, seguido de una fase de crecimiento exponencial hasta el final de proceso (alcanzando valores alrededor de 600 mV) (figura 3 a y c). Los dos ultimos subcultivos presentaron fases de adaptacion mas largas (6 y 8 dias respectivamente), seguidas de una fase de crecimiento exponencial. Los valores de Eh alcanzados son menores, alrededor de 550 mV (figura 3 e y g). En general, se observo un aumento generalizado del pH en todas las etapas de adaptacion, a pesar de la acidificacion del sistema con acido sulfurico (hasta el dia 6), pero a partir del dia sexto el pH decae y se estabiliza en el tiempo (figura 3 b, d, f y h). Los ensayos no inoculados presentaron un comportamiento creciente para todos los subcultivos (figura 3 b, d, f y h). Sin embargo, en el tercer y el cuarto subcultivos se observa un descenso a partir del dia 8 (figura 3 f y h). Cabe anotar que en todos los subcultivos los valores de Eh y pH son similares durante todo el proceso para los dos tamanos de particula.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Discusion

La importancia del pH

A continuacion se discuten los comportamientos obtenidos para los concentrados de esfalerita, calcopirita y galena durante el periodo de adaptacion. El pH es un factor determinante en el proceso de adaptacion de los microorganismos a los diferentes minerales e influye de forma significativa en la velocidad de crecimiento de los mismos, debido a que afecta a los grupos ionizables presentes en las enzimas, situadas en el citoplasma y periplasma de la celula (Das et al., 1999; Gomez y Cantero, 2005).

El aumento inicial en el pH puede deberse a varios factores: 1) La presencia de carbonatos y fases silicatadas en contacto con la solucion lixiviante genera consumo de acido (Sampson et al., 2005; Arroyave, 2007); 2) el consumo de protones generado principalmente en los monosulfuros como calcopirita, esfalerita y galena siendo mayor en este ultimo (Garcia et al., 1995; Da Silva, 2004; Ballester, 2005), y 3) a la oxidacion del [Fe.sup.2+] (Bevilaqua et al., 2002; Meruane y Vargas, 2003).

El aumento inicial de pH en todos los subcultivos de adaptacion para el caso de la esfalerita se debe aparentemente a la presencia de carbonatos en el concentrado, ya que este contenia gran cantidad de ganga (alrededor del 6%). El aumento pudo inhibir el adecuado crecimiento de los microorganismos y por tanto retardar la adaptacion (Das et al., 1999). Sin embargo, en todos los subcultivos se observa estabilidad en el pH hacia el final de proceso (figura 2 b, d, f y h), lo cual sugiere una neutralizacion de los carbonatos, ya que este mineral en presencia de acido sulfurico se neutraliza formando yeso y otro tipo de sulfatos dependiendo de la composicion quimica del carbonato (Marquez, 1999). En general, el incremento en el pH fue mayor para las muestras mas finas, lo cual pudo deberse a que un menor tamano de particula se traduce en mayor area superficial y, por tanto, una mayor reactividad, generando un consumo de protones mas elevado. Ademas, a menor tamano de particula se aumenta el estres hidrodinamico para los microorganismos, lo cual pudo evitar que estos favorecieran la neutralizacion de carbonatos mas rapidamente como ocurrio para el mayor tamano de particula (figura 2 b, d, f y h). Estos resultados estan de acuerdo con lo observado por Silverman (1961), Deveci (2004) y Haghshenas et al. (2009 a y b). Por otra parte, Deveci (2002) encontro que a menor tamano de particula hay mayor posibilidad de colisiones, las cuales son las responsables del dano celular o incluso de la muerte de los microorganismos. El consumo de acido tambien puede ser atribuido a la oxidacion del [Fe.sup.2+]; no obstante, este proceso genera un aumento menor en el pH (~3), segun lo reportado por Bevilaqua et al. (2002) y Meruane y Vargas (2003).

El aumento generalizado del pH inicial en todas las etapas de adaptacion para el caso de la galena es interpretado como consumo de protones debido a su caracter de monosulfuro. El consumo de protones para este mineral es mucho mayor que para la calcopirita y esfalerita como ha sido reportado por varios autores (Garcia et al., 1995; Da Silva, 2004; Mejia et al., 2007), lo que hizo necesario acidificar el sistema hasta agotar la demanda de protones, la cual se dio aproximadamente el dia sexto, a partir del cual se observo una paulatina disminucion en los valores de pH. Esto es debido a que la disolucion de galena en ambientes acidos ocurre como resultado de la protonacion en la superficie del mineral, donde el unico mecanismo de protonacion en solucion acuosa energeticamente favorable se genera por la union de tres [H.sup.+] en los tres atomos superficiales de azufre, los cuales rodean un atomo de plomo sustituido por un cuarto ion [H.sup.+] (Gerson y O'Dea, 2003; Acero et al., 2007). Estas teorias explican el decrecimiento en el valor del pH alrededor del sexto dia para estabilizarse alrededor de 2,0 y mas bajos en la ultima etapa de adaptacion, con 1,8 (figura 3 b, d, f y h), indicando de este modo un incremento en la concentracion de [H.sup.+] producido por la actividad bacteriana. En este caso, al igual que en la esfalerita, el aumento del pH fue mayor para el tamano de particula -325 serie Tyler de tamices confirmando el efecto adverso del menor tamano de particula sobre los microorganismos, debido posiblemente a mayores colisiones entre las particulas.

Para el caso de la calcopirita, el comportamiento en el pH fue muy estable en todo el proceso de adaptacion, presentando un ligero incremento al inicio de todas las etapas, explicado como la adaptacion de los microorganismo al mineral, el cual se estabiliza rapidamente (Bevilaqua et al., 2002; Meruane y Vargas 2003). Este comportamiento da indicios de una buena adaptacion y actividad bacteriana (Cox et al., 1977; Tekeuchi y Susuki, 1994).

La importancia del potencial de oxido-reduccion (Eh)

El potencial de oxido-reduccion puede relacionarse con el crecimiento y la actividad bacteriana. Un rapido incremento en este se puede deber a una buena adaptacion de los microorganismos al mineral, indicando indirectamente que los iones solubilizados aparentemente no inhiben la capacidad bacteriana de oxidar el ion ferroso (Xia et al., 2008). Ademas, todos los concentrados de minerales empleados presentaron tres fases caracteristicas en las curvas de crecimiento bacteriano: fase de adaptacion o fase lag (los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales), fase de crecimiento exponencial (las bacterias consumen los nutrientes del medio a velocidad maxima, y su velocidad de crecimiento es la maxima) y fase estacionaria (no se incrementa el numero de bacterias, los microorganismos entran en fase estacionaria bien porque se agota algun nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea inhospito) (Madigan et al., 2003). Cabe mencionar que aunque las concentraciones de los iones metalicos no fueron medidas al inicio y final del proceso, fue posible observar turbidez, cambio de color y olor en los medios de cultivo a medida que avanzaba el desarrollo para todos los ensayos, lo que da indicios de cambios en el sistema; ademas, al final del proceso fue posible observar una buena poblacion bacteriana indicando que los iones solubilizados no generaron alta toxicidad en los medios de cultivo.

A continuacion se discuten los comportamientos obtenidos por la esfalerita, calcopirita y galena en todos los periodos de adaptacion.

El tamano de particula mas fino presento un mejor desempeno del Eh para todos los subcultivos debido a que a menor tamano de particula el mineral posee un area superficial mayor y su reactividad aumenta. Al haber una mayor fuente de [Fe.sup.2+] para los microorganismos, se da una rapida transformacion de [Fe.sup.2+] a [Fe.sup.3+] obteniendose de este modo altos valores de potencial. Ademas, a bajas concentraciones de pulpa los danos debidos a las colisiones en las particulas son menores (Deveci, 2002). Sin embargo, para el caso del concentrado de esfalerita, aunque el ion [Zn.sup.2+] es menos toxico que el [Cu.sup.2+] en solucion, la presencia de carbonatos aparentemente afecto el buen desarrollo de los microorganismos, siendo menos evidente para el tamano de particula -200 serie Tyler de tamices. Ademas, esto tambien podria estar relacionado con la reactividad del mineral en funcion del tamano de particula. Por otra parte, el comportamiento del Eh para el concentrado de galena se debe a la gran toxicidad del plomo para los microorganismos, donde el tamano de particula juega un papel fundamental -a menor tamano de particula se tiene mayor concentracion de [Pb.sup.2+] en solucion-.

En el subcultivo realizado para 5% (p/v) de mineral y 7,5% (v/v) de sulfato ferroso, la fase lag fue menor, alrededor de 2 dias, mostrando de forma indirecta una buena adaptacion de los microorganismos al mineral. El crecimiento del potencial de oxido-reduccion es mejor, al igual que en la etapa anterior, para el tamano de particula mas grueso en el caso de la esfalerita y la galena. En esta etapa la calcopirita mostro un mejor comportamiento para el tamano de particula mas grueso, lo cual da indicios que a mayor concentracion de [Cu.sup.2+] los microorganismos son afectados por la toxicidad de este ion, lo cual dificulta su etapa de adaptacion (Rawling et al., 1999; Rawling, 2005). Para el ensayo de adaptacion realizado con 7,5% (p/v) y 5% (v/v) de sulfato ferroso -datos no mostrados-, el comportamiento fue muy similar al obtenido en la segunda etapa de adaptacion.

Para el caso de 10% (p/v) de pulpa y 2,5% (v/v) de sulfato ferroso (figura 1e, 2e y 3e), el crecimiento del potencial redox fue muy similar para todos los minerales. No se observo fase estacionaria. Sin embargo el crecimiento, aunque constante, es lento hasta aproximadamente el dia sexto del proceso. Este comportamiento indica que los microorganismos se van adaptando a las condiciones del sistema paulatinamente, usando su energia para tolerar las condiciones adversas y no para generar una rapida oxidacion del [Fe.sup.2+] a [Fe.sup.3+]; ademas, pueden toman la fuente de energia de las trazas de [Fe.sup.2+] provenientes del inoculo bacteriano, la cual es de mas facil acceso. Finalmente, se logro una buena adaptacion luego del dia sexto, donde se presenta un fuerte incremento en el Eh, indicando que los iones dejados en solucion no afectaron aparentemente la actividad oxidativa de los microorganismos, lo que esta de acuerdo con lo observado por Xia et al. (2008).

Al disminuir totalmente la fuente de energia (figura 1g, 2g y 3g) el crecimiento del Eh fue constante pero mas lento que en la etapa anterior, indicando que aunque los microorganismos se adaptaron al sistema, les costo mas tiempo tolerar las condiciones adversas. Ademas, como los microorganismos no contaban con fuente de energia extra, y como se agotan las trazas de [Fe.sup.2+] provenientes del inoculo, se vieron obligados a tomar la fuente de energia de los iones de [Fe.sup.2+] provenientes de la disolucion en medio acido de los minerales, proceso que tiene una cinetica mas lenta (Zapata et al., 2007). Alrededor del dia 8 se dio un marcado incremento indicando, en principio, una buena actividad bacteriana para la oxidacion del ion ferroso.

De acuerdo con Touvinen et al. (1971), la tolerancia del microorganismo al mineral es adquirida durante la fase lag, lo cual puede ser observado en la fase estacionaria de crecimiento del Eh y en el aumento inicial del pH.

La evolucion del potencial de oxido-reduccion se relaciona con la tasa de crecimiento bacteriano y su capacidad de oxidar el [Fe.sup.2+] (Gentina y Acevedo, 2005). Esta capacidad oxidativa aumento a traves del tiempo en las cuatro etapas de adaptacion, donde las bacterias alcanzaron valores de Eh alrededor de 600 mV en corto tiempo y los mantuvieron hasta el final de proceso, especialmente en las primeras etapas de adaptacion, en las que aun tenian fuente de energia adicional. En la ultima fase de adaptacion, sin adicion de fuente de energia, el crecimiento de la curva de Eh para los sulfuros es mas lento, aunque el valor aumenta paulatinamente, lo que sugiere que los microorganismos toman la fuente de energia necesaria para su crecimiento de la oxidacion del [Fe.sup.2+] proveniente del mineral (Prayuenyong, 2002). Esto da indicios de una buena actividad oxidativa y de que las bacterias respondieron favorablemente a las etapas de adaptacion, llevandose a cabo el mecanismos indirecto (Prayuenyong, 2002; Ballester, 2005). El aumento del Eh sugiere que en presencia de bacterias hay un transporte constante de electrones en el sistema, como la trasformacion de [Fe.sup.2+] a [Fe.sup.3+], funcion principal de A. ferrooxidans (Rossi, 1990; Kodali et al., 2004).

Ademas de los ensayos de adaptacion para una cepa compatible con A. ferrooxidans se realizaron ensayos alternos de adaptacion para una cepa compatible con A. thiooxidans (datos no mostrados). Cuando se adiciono azufre elemental como fuente de energia extra, los ensayos mostraron produccion de acido, evidenciado por la disminucion del pH (0,6), y los valores de potencial aumentaron hasta aproximadamente 460 mV para todos los ensayos. Sin embargo, al ir disminuyendo la fuente externa de energia, este microorganismo fue perdiendo la habilidad de producir acido. Al suprimir totalmente la fuente de energia los valores de pH obtenidos fueron similares a los controles abioticos lo cual da indicios de que este microorganismo no fue capaz de obtener energia del mineral (Bevilaqua et al., 2002).

Conclusiones

La adaptacion de una cepa compatible con Acidithiobacillus ferrooxidans en etapas sucesivas mediante la disminucion gradual de fuente de energia y aumento en el contenido del mineral (calcopirita, esfalerita y galena respectivamente), resulto ser un metodo eficaz para este tipo de procesos. Esta metodologia provee una adecuada adaptacion de los microorganismos al mineral.

La metodologia empleada permitio observar que la presencia de iones metalicos afecta la evolucion del crecimiento bacteriano y la oxidacion del ion ferroso. La cepa compatible con A. ferrooxidans mostro mas tolerancia a los iones de zinc, cobre y plomo para el tamano de particula -200 serie Tyler de tamices. Para el tamano de particula -325 serie Tyler de tamices el microorganismo presento mas tolerancia al [Cu.sup.2+], seguido por el [Zn.sup.2+] y finalmente al [Pb.sup.2+], esto debido al efecto del tamano de la particula y a la presencia de carbonatos en el concentrado de esfalerita. Como recomendacion, es necesario complementar este estudio con tecnicas moleculares que permitan verificar la presencia de A. ferrooxidans y su viabilidad en este tipo de procesos. Ademas, hacer medidas de hierro, sulfatos, cobre, plomo y zinc que permitan verificar el aumento de dichos iones a traves del proceso.

Agradecimientos

Los autores agradecen al programa de biotecnologia de Colciencias; a los laboratorios de biomineralogia, Cimex, preparacion de rocas y carbones de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin: al laboratorio de Ingeominas, Medellin; a I. C. Cardona de la Universidad de West Virgina, USA, por sus comentarios. ALM agradece al CODI de la Universidad de Antioquia.

Recibido: julio 30 de 2010 Aprobado: mayo 25 de 2011

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Title Annotation:ARTICULO CORTO
Author:Mejia, E.; Ospina, J.D.; Osorno, B.L.; Marquez, M.A.; Morales, A.L.
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2011
Words:6784
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