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Acute phase proteins in female dogs with mammary tumors/Proteinas de fase aguda em cadelas com neoplasia mamaria.

INTRODUCAO

Os tumores mamarios sao as neoplasias mais frequentes em cadelas com idade superior a cinco anos que nao foram submetidas a castracao antes do primeiro cio. Aproximadamente 50 a 70% das neoplasias mamarias apresentam classificacao histologica maligna, contudo, a evolucao clinica e a ocorrencia de metastase regional e/ou distante podem variar drasticamente entre os individuos (FONSECA & DALECK, 2000; ZUCCARI et al., 2001). Marcadores tumorais vem sendo utilizados para auxiliar no diagnostico precoce e no prognostico de diferentes neoplasias. Muitos desses marcadores sao substancias detectadas e quantificadas no sangue, fluidos e/ou tecidos corporais, dentre os quais se destacam as proteinas de fase aguda (PFA).

As PFA sao classificadas em positivas e negativas, sendo positivas aquelas cuja concentracao serica eleva-se nos processos infecciosos, inflamatorios ou neoplasicos e, por sua vez, as negativas sao aquelas na qual a concentracao serica reduz em resposta a algum desses processos. As PFA positivas sao subdividas em PFA positivas maiores (quando a concentracao serica se eleva rapidamente, retornando aos valores basais tambem de forma rapida) e PFA positivas moderadas (quando a concentracao serica aumenta lentamente e permanece elevada por mais tempo). No cao, as principais PFA positivas maiores sao a proteina C reativa (PCR) e o amiloide serico A (ASA), e a principal PFA positiva moderada e representada pela Haptoglobina (Hp). As principais PFA negativas sao a albumina e a transferrina (CERON et al., 2005).

As PFA participam da resposta inflamatoria inicial e sao mediadas por citocinas pro-inflamatorias como a interleucina-1 (I[L.sup.-1]), fator de necrose tumoral a (FNTa) e interleucina-6 (IL-6). Possuem diversas funcoes que incluem o auxilio da homeostase corporal pelo controle da infeccao e inflamacao que se estabelece logo apos o dano celular, inibicao da quimiotaxia e modulacao dos neutrofilos, inducao de citocinas e formacao de anticorpos (MURATA et al., 2004; CERON, et al., 2005; THEILGAARDMONCH, et al., 2006).

As PFA tambem sofrem alteracoes frente a processos neoplasicos (CERON, et al., 2005; CALAZANS et al., 2009; MYLONAKIS et al., 2011). Estudos recentes demonstraram variacoes nas PFA em caes portadores de tumores mamarios, pancreaticos, carcinoma de celulas escamosas e linfoma (CALAZANS et al., 2009; GALEZOWSKI et al., 2010; MUKORERA et al., 2011), e em seres humanos no cancer de prostata e mama (STARK et al., 2009). Nas neoplasias mamarias, as variacoes dos valores sericos das PFA podem ocorrer em funcao da inflamacao tecidual cronica, do tamanho do tumor primario e da presenca de metastases (TECLES et al., 2009; CROSSLEY et al., 2010). Nao ha consenso em relacao as alteracoes sericas das PFA em cadelas com neoplasia mamaria e o perfil analitico dessas, associadas a classificacao histopatologica e ao leucograma dos pacientes, e desconhecido. Objetivou-se com este trabalho avaliar as alteracoes nas concentracoes sericas das principais PFA positivas (PCR, Hp, ceruloplasmina, alfa-1antitripsina, alfa-1-glicoproteina acida) e negativas (albumina e transferrina) e comparar os achados ao leucograma e a analise histopatologica, em cadelas com neoplasia mamaria.

MATERIAL E METODOS

Foram selecionadas 45 cadelas de idades e racas variadas, diagnosticadas com neoplasia mamaria, atendidas no Hospital Veterinario da Universidade

Federal do Parana--Curitiba (HV-UFPR), no periodo entre marco e dezembro de 2011. Foram excluidas do estudo cadelas com doencas concomitantes a neoplasia e/ou submetidas a tratamento oral, injetavel ou topico (anti-inflamatorios, antiparasitarios, antibioticos e antifungicos) ou vacinadas em periodo inferior a quatro meses da data da consulta.

O sangue colhido das pacientes durante o diagnostico clinico foi armazenado em tubos de ensaio com anticoagulante acido etilenodiaminotetracetico (EDTA) para realizacao do leucograma e sem anticoagulante para realizacao do proteinograma serico e analise da PCR. Apos centrifugacao a 2500 rotacoes por minuto, durante 5 minutos, o soro obtido foi armazenado em freezer comum a -20[degrees]C ate a realizacao do proteinograma.

A determinacao da concentracao da proteina serica total (PST) foi realizada pelo metodo de Biureto (Labtest[R], Belo Horizonte) com leitura em espectrofotometro semi-automatizado (Labquest[R], Sao Paulo). A determinacao das concentracoes das fracoes proteicas foi realizada por eletroforese em matriz gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), utilizando o sistema vertical para eletroforese (LAEMMLI, 1970). A placa gel foi colocada em cuba com solucao tampao de pH 8,5. As amostras para fracionamento das proteinas foram preparadas com 10pL de soro sanguineo diluido em 30pL de tampao fosfato (PBS) e 20pL de gel, e aquecidas sobre agua em ebulicao por 10 minutos. As aliquotas de 5pL foram depositadas nos fossos da placa gel para receber estimulo eletrico e iniciar a corrida. Terminada a separacao, o gel foi corado com Coomassie blue 0,2% e depois descorado ate que as bandas de proteinas estivessem nitidas. Os pesos moleculares e as concentracoes das proteinas foram obtidos por densitometria computadorizada (SHIMADZU CS-9301, Kyoto, Japao), atraves do escaneamento das amostras. O resultado final foi demonstrado em graficos com curvas que representaram as fracoes das proteinas e dados de percentual e peso molecular de cada proteina obtida na analise.

A concentracao serica da PCR foi obtida pelo teste turbidimetrico ultrassensivel com latex aprimorado (Biotecnica[R] Varginha, Minas Gerais). O metodo consiste na aglutinacao de particulas de latex recobertas com anticorpo que aglutinam quando entram em contato com a PCR presente na amostra, causando mudanca de absorbancia, proporcional a concentracao da PCR existente. A alteracao na absorbancia foi quantificada em analisador de quimica clinica automatizado (BS200 Mindray[R], China). A calibracao do equipamento foi realizada com calibrador para PCR (Biotecnica[R] Varginha, Minas Gerais), com cinco pontos de diferentes concentracoes de 0 a 8mg[L.sup.-1] em 546nm, de acordo com a programacao do equipamento (BS200 Mindray[R], China; 300pL de reagente e 3pL de amostra). Apos a calibracao do equipamento, antes da realizacao dos testes da PCR no soro dos pacientes, foi dosada a PCR em soro controle (Biotecnica[R] Varginha, Minas Gerais) para avaliar a precisao das determinacoes, e o resultado obtido encontrou-se dentro da faixa de referencia indicada na bula do controle.

A contagem de leucocitos foi realizada em hemocitometro e os esfregacos sanguineos foram utilizados para a contagem de diferencial.A presenca de inflamacao foi avaliada pelo leucograma (leucocitose, neutrofilia, monocitose, desvio nuclear a esquerda).

As pacientes com neoplasia mamaria foram submetidas a mastectomia e o tecido mamario encaminhado para analise histopatologica e classificacao, segundo criterios da Organizacao Mundial da Saude (MEUTEN, 2002). Apos a avaliacao histopatologica, as pacientes foram divididas em tres grupos: portadoras de neoplasia benigna, neoplasia maligna nao ulcerada e maligna ulcerada.

Para o grupo controle, foram selecionadas 20 cadelas clinicamente saudaveis com idade media de cinco anos (3 a 8 anos), encaminhadas ao HVUFPR para ovariohisterectomia eletiva ou vacinacao. Foram realizados exames clinicos, hematologicos e de imagem (ultrassonografia abdominal e radiografia toracica), a fim de atestar higidez das pacientes.

O teste de Kolmogorov-Smirnov foi empregado para verificar a normalidade dos resultados. As concentracoes sericas das PFA obtidas por eletroforese resultaram em dados nao parametricos, que foram avaliadas pelo teste de analise de variancia de Kruskal-Wallis e o teste Dunn para a comparacao dos grupos. A PCR e a idade das pacientes resultaram em dados parametricos, sendo empregado o teste de analise de variancia one-way ANOVA, seguido do teste de Tukey para comparacao entre os grupos. O teste exato de Fisher foi aplicado para verificar a correlacao entre as PFA e a presenca de inflamacao. Valores de P<0,05 foram considerados significativos.

RESULTADOS

As pacientes portadoras de neoplasia apresentaram media de idade semelhante entre os grupos (P>0,05). A media de idade para o grupo de pacientes com neoplasia benigna foi de 8,8 anos (3 a 16 anos), para as pacientes com neoplasia maligna nao ulcerada 9,8 anos (5 a 15 anos) e as com neoplasia maligna ulcerada 9,1 anos (5 a14 anos).

De acordo com o resultado da avaliacao histopatologica, 71,1% (32/45) das cadelas apresentaram tumores mamarios malignos e 28,9% (13/45) benignos. Nenhuma paciente com neoplasia mamaria benigna apresentou ulceracao tumoral e, no grupo de neoplasias mamarias malignas, 25%(8/32) estavam ulceradas e 75%(24/32) nao apresentaram ulceracao tumoral.

No grupo com neoplasia benigna 53,8% (7/13), foram classificadas como adenoma simples, 23,1% (3/13) adenoma complexo e 23,1% (3/13) tumor misto benigno. No grupo com neoplasia maligna, 59,4% (19/32) foram classificadas como carcinoma simples, 15,6% (5/32) carcinoma papilifero cistico, 12,5% (4/32) carcinoma papilifero simples a complexo, 9,4% (3/32) carcinoma complexo e 3,1% (1/32) carcinoma solido.

A eletroforese evidenciou seis PFA: ceruloplasmina, transferrina, albumina, alfa-1-antitripsina, haptoglobina (Hp) e alfa-1-glicoproteina acida. O resultado do proteinograma serico dos grupos controle, neoplasia benigna, neoplasia maligna nao ulcerada e neoplasia maligna ulcerada estao na tabela 1.

A unica alteracao proteica observada nas pacientes com neoplasia benigna (n=13) foi a elevacao da Hp (21,94 [+ or -] 6,65mg[L.sup.-1]; P=0,0016, Teste de Dunn), quando comparado ao controle (12,52 [+ or -] 4,64mg[L.sup.-1]). A media da PCR para o grupo neoplasia benigna (0,49 [+ or -] 0,45mgd[L.sup.-1]; P=0,09, OneWay ANOVA, post hoc Tukey) foi semelhante ao grupo controle (0,35 [+ or -] 0,41mg[L.sup.-1]). O leucograma nao apresentou alteracoes nas pacientes portadoras de tumores benignos.

O valor serico medio da Hp elevou-se nas pacientes com neoplasia de mama maligna nao ulcerada (22,81 [+ or -] 10,79mg[L.sup.-1]; P=0,0003, Teste de Dunn) e ulcerada (34,71 [+ or -] 21,34mg[L.sup.-1]; P=0,0002, Teste de Dunn), quando comparados ao grupo controle (12,52 [+ or -] 4,64mg [L.sup.-1]). A PCR apresentou concentracao serica elevada nos grupos neoplasia mamaria nao ulcerada (0,53 [+ or -] 0,71mg[L.sup.-1]; P=0,0097, One-Way ANOVA, post hoc Tukey) e neoplasia mamaria ulcerada (2,32 [+ or -] 1,63mg[L.sup.-1]; P=0,0012, One-Way ANOVA, post hoc Tukey), quando comparados ao grupo controle (0,35 [+ or -] 0,41mg[L.sup.-1]) e entre os grupos malignos (P=0,002, One-Way ANOVA, post hoc Tukey). A albumina teve a media diminuida apenas para o grupo neoplasia maligna ulcerada (2959 [+ or -] 305,1mgd[L.sup.-1]; P=0,007, Teste de Dunn), quando comparada ao grupo controle (3713 [+ or -] 689,3mgd[L.sup.-1]).

O leucograma revelou inflamacao em 50% das pacientes com neoplasia mamaria maligna nao ulcerada (12/24) e 87,5% (7/8) das ulceradas. O grupo neoplasia mamaria maligna ulcerada apresentou correlacao positiva entre as alteracoes nas PFA (PCR, Hp e albumina) e a presenca de leucograma inflamatorio (P=0,002, Teste de Fisher). Nao foi observada correlacao entre as alteracoes nas PFA (PCR, Hp e albumina) e a presenca de leucograma inflamatorio para os grupos neoplasia benigna e maligna nao ulcerada (P>0,05, Teste de Fisher).

DISCUSSAO

O presente trabalho revelou que a PCR e a Hp estao positivamente associadas a neoplasia mamaria, estando ou nao relacionadas ao leucograma inflamatorio. No entanto, conforme verificado neste estudo, a avaliacao em conjunto de uma PFA positiva maior como a PCR, com uma moderada (Hp), apresenta vantagens quanto a avaliacao individual dessas proteinas (TECLES et al., 2009). Desse modo, este estudo observou aumento na PCR e na Hp em todas as pacientes com neoplasia mamaria maligna, ulcerada ou nao. As pacientes com neoplasia mamaria benigna apresentaram aumento apenas da Hp e nao da PCR, confirmando que a neoplasia mamaria maligna e uma doenca que promove inflamacao cronica, maior lesao tecidual e necrose tumoral, quando comparada a neoplasia mamaria benigna (PLANELLAS et al., 2009; TECLES et al., 2009).

A presenca de ulceracao e caracteristica de um estadio mais avancado da neoplasia mamaria e, nessas pacientes, a inflamacao tecidual da massa tumoral e evidente. No presente estudo, o leucograma inflamatorio associado ao aumento expressivo da PCR e da Hp e reducao na albumina foram observados nas pacientes com neoplasia ulcerada. Esse resultado indica que o aumento das PFA em cadelas com neoplasia mamaria maligna ulcerada ocorre pela maior inflamacao tecidual (CERON et al., 2005; GRIEBSCH et al., 2009; GALEZOWSKI, et al., 2010). A inflamacao peritumoral leva a ativacao de macrofagos e a liberacao de citocinas, que sao importantes na ativacao da resposta de fase aguda, com consequentes alteracoes das PFA (BALKWILLet al., 2005; ROXBURGH & McMILLAN, 2010). Outro fator a ser considerado e a maior expressao de ciclooxigenase 2(COX2) no carcinoma mamario, o que leva a maior liberacao das PFA atraves da estimulacao desses receptores (HELLER et al., 2005; PLANELLAS et al., 2009). A avaliacao individual do leucograma das pacientes com neoplasia mamaria nao revelou um padrao no perfil inflamatorio, apesar do aumento da PCR e da Hp serica, revelando que as PFA podem estar aumentadas, mesmo em pacientes sem alteracoes no hemograma.

Alteracao individual de PFA em caes com neoplasia foi demonstrada em pesquisas recentes, apesar do nao estabelecimento de um padrao dessas alteracoes (PLANELLAS et al., 2009; TECLES et al., 2009; CROSSLEY et al., 2010; GALEZOWSKI et al., 2010; MUKORERA et al., 2011). O aumento da PCR foi demonstrado em caes com neoplasia mamaria e correlacionado com pior prognostico (CROSSLEY et al., 2010; MUKORERA et al., 2011). Contraditoriamente, a avaliacao serica em conjunto da Hp e da PCR nao apresentou valor diagnostico ou prognostico em cadelas com tumor de mama (PLANELLAS et al., 2009), apesar de observacoes na elevacao da Hp em seres humanos com cancer de ovario (YE et al., 2003), pancreas (OKUYAMA et al., 2006) e adenocarcinoma uterino (NABLI et al., 2009).

A albumina e uma proteina de fase aguda negativa e a reducao observada apenas nas pacientes com neoplasia maligna ulcerada pode ser devido ao aumento expressivo da PCR e da Hp neste grupo, obedecendo um mecanismo de compensacao. As atocinas pro-inflamatorias diminuem a sintese da albumina, uma vez que promovem a sintese de outras PFA (CALAZANS et al., 2009).

CONCLUSAO

A PCR e a Hp sao proteinas inespecificas, porem, altamente sensiveis, podendo ser usadas como ferramentas auxiliares no diagnostico e prognostico de neoplasia mamaria em cadelas. A avaliacao combinada da PCR e Hp e mais vantajosa que a individual e pode sugerir malignidade, nao havendo aparente relacao com o tipo histologico ou leucograma inflamatorio, que esta mais associado ao padrao ulcerativo do tumor.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a BioTecnica, pela doacao do teste ultrassensivel para PCR, e a Fundacao Araucaria pelo financiamento da bolsa de Mestrado de Michelly Battisti.

COMITE DE ETICA E BIOSSEGURANCA

O presente trabalho foi aprovado pelo comite de etica no uso de animais (CEUA), sob protocolo n.058/2011.

REFERENCIAS

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Michelly Kheidy Borges Battisti (I) Daniella Matos da Silva (I) Mhayara Samile de Oliveira Reusing (I) Olair Carlos Beltrame (I) Elizabeth Moreira dos Santos Schmidt (II) Jose Jurandir Fagliari (III) Rosangela Locatelli Dittrich (I) Simone Domit Guerios (I) *

(I) Departamento de Medicina Veterinaria, Universidade Federal do Parana (UFPR), 80035-050, Curitiba, PR, Brasil. E- mail: sdguerios@ufpr.br. * Autor para correspondencia.

(II) Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia de Botucatu (FMVZ), Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho (UNESP), Botucatu, SP, Brasil.

(III) Departamento de Clinica e Cirurgia Veterinaria, Faculdade de Ciencias Agrarias e Veterinarias de Jaboticabal (FCAV), UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil.

Recebido 28.08.12

Aprovado 26.11.12

Devolvido pelo autor 20.02.13

CR-2012-0761.R2
Tabela 1-Valores sericos da proteina total, proteina C reativa (PCR)
e das demais proteinas de fase aguda (PFA) em cadelas com neoplasia
mamaria e controle.

Proteinas                   Controle              Neoplasia benigna
(Peso molecular              (n=20)                    (n=13)
kDa)

Proteina total          6,8 [+ or -] 0,4          6,4 [+ or -] 1,1
  (gd[L.sup.-1])
PCR (25)              0,35 [+ or -] 0,4 (a)     0,49 [+ or -] 0,4 (a)
Ceruloplasmina           29 [+ or -] 8,1         27,9 [+ or -] 11,9
  (125)
T ransferrina          77,2 [+ or -] 48,4        74,6 [+ or -] 89,4
  (85)
Albumina (65)        3713 (a) [+ or -] 689,3   3640 (a) [+ or -] 740,3
Alfal-antitripsina       350 [+ or -] 56         297,4 [+ or -] 75,2
  (60)
Haptoglobina(39)      12,5 (a) [+ or -] 4,6     21,9 (b) [+ or -] 6,6
Alfa-l-                 11,2 [+ or -] 6,1         19,6 [+ or -] 8,1
  glicoproteina
  acida (37)

Proteinas              Neoplasia maligna         Neoplasia maligna
(Peso molecular           nao ulcerada               ulcerada
kDa)                         (n=24)                    (n=8)

Proteina total          7,1 [+ or -] 1,6         6,3 [+ or -] 0,9
  (gd[L.sup.-1])
PCR (25)             0,53 [+ or -] 0,7 (b)    2,32 [+ or -] l,6 (bc)
Ceruloplasmina         26,7 [+ or -] 10,7       39,1 [+ or -] 10,3
  (125)
T ransferrina          54,7 [+ or -] 36,9       80,5 [+ or -] 24,1
  (85)
Albumina (65)        3555 (a) [+ or -] 1230   2959 (b) [+ or -] 305,l
Alfal-antitripsina     348 [+ or -] 25,5        307,6 [+ or -] 95,9
  (60)
Haptoglobina(39)     22,8 (b) [+ or -] 10,7   34,7 (b) [+ or -] 21,3
Alfa-l-                22,9 [+ or -] 24,9        22,9 [+ or -] 18
  glicoproteina
  acida (37)

Os valores sao apresentados como media [+ or -] desvio padrao. Medias
seguidas por letras diferentes na mesma linha diferem entre si, One/way
ANOVA post hocTukey para a PCR e teste multiplo de comparacao de Dunn
para as outras proteinas (P<0,05). * Valor zero atribuido a proteina
nao mensurada em uma amostra.
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Author:Battisti, Michelly Kheidy Borges; da Silva, Daniella Matos; Reusing, Mhayara Samile de Oliveira; Bel
Publication:Ciencia Rural
Date:May 1, 2013
Words:3851
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