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Actividades farmacologicas de la fosfolipasa [A.sub.2] Ba SpII RP4 del veneno de Bothrops alternatus.

Resumen

El objetivo del trabajo fue evaluar actividades farmacologicas (citotoxica, bactericida, agregante plaquetaria) y factores que afectan la actividad/ estabilidad de la fosfolipasa [A.sub.2] (PL[A.sub.2]) aislada del veneno de Bothrops alternatus. Se utilizaron mioblastos/miotubulos murinos (C2C12) y cepas bacterianas de Staphylococcus aureus (cepa ATCC 25923) y Escherichia coli (cepa ATCC 25922) para valorar respectivamente su accion miotoxica (in vitro) y bactericida, como asi tambien lineas celulares epiteliales mamarias normales (NMuMG) y tumorales (LM3) para detectar su posible aplicacion en terapia oncologica. Con el fin de evaluar la accion inhibitoria de la PL[A.sub.2] aislada sobre la agregacion plaquetaria se empleo plasma rico en plaquetas y trombina como inductor fisiologico. Por ultimo, se registraron los cambios en la actividad y estabilidad de la PL[A.sub.2] a diferentes temperaturas (4-90[grados]C) mediante ensayo cinetico, en tanto que, por hemolisis radial indirecta se hizo lo mismo para evaluar efecto del pH (2,5-10). La PL[A.sub.2] mostro una accion inhibitoria sobre la agregacion plaquetaria dosis-dependiente. Presento una alta estabilidad estructural al ser sometida a condiciones extremas de pH y temperatura durante varias horas, conservando la actividad catalitica practicamente invariable. En cambio, cuando PL[A.sub.2] fue evaluada sobre las diferentes lineas celulares, no produjo citotoxicidad (auna dosis elevadas) ni efecto bactericida sobre las cepas utilizadas. Estos hallazgos amplian la caracterizacion de la enzima, una de las mas abundantes del paquete proteico del veneno total de B. alternatus del nordeste argentino. A la vez, la inocuidad y estabilidad detectadas, permiten proponer a esta enzima como un inmunogeno alternativo en la produccion de sueros antiofidicos.

Palabras clave: Bothrops alternatus, fosfolipasa [A.sub.2], actividad bactericida, citotoxicidad, agregacion plaquetaria, inmunogenicidad.

Abstract

Rev. The aim of this work was to evaluate the pharmacological activities (citotoxicity, bactericidal, platelet aggregation) and the changes in the activity/stability of the isolated phospholipase [A.sub.2] (PL[A.sub.2]) from Bothrops alternatus venom. In order to elucidate myotoxic and bactericidal activities, murine mioblast/miotubules (C2C12) and strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922) were used, respectively. Also, normal mammary epithelial cell culture (NMuMG) and tumoral type (LM3) were tested for a possible role in oncological therapy. With the purpose of studying the inhibitory effect of the PL[A.sub.2] on platelet aggregation, washed human platelet and thrombin as physiological inductor, were used. Finally, changes in the activity and stability of the isolated PL[A.sub.2] at different temperatures (4-90[degrees]C) by kinetic assays were recorded; while the enzyme was subjected to radial indirect hemolysis to evaluate the effect of different pH (2.5-10). The PL[A.sub.2] presented dose-dependent inhibitory effect on thrombin-induced platelet aggregation. Also, it showed high structural stability when exposed to extreme conditions of temperature and pH during several hours, and catalytic activity remained almost unchanged. Nevertheless, this enzyme tested on different cells cultures did not induce cytotoxic (even at high doses) or bactericidal activities. These findings have a scientific value for toxicology since they expand the knowledge of the characterization (biological, biochemical and structural aspects) of one of the most abundant enzyme (PL[A.sub.2] Ba SpII RP4) from the protein package of B. alternatus snake venom from the northeast of Argentina. Likewise, the confirmed safety and stability of this PL[A.sub.2] strongly suggest that it could be proposed as an alternative immunogen for the antiserum production against Bothrops snake venom.

Key words: Bothrops alternatus, phospholipase [A.sub.2], bactericidal activity, citotoxicity, platelet aggregation, immunogenicity.

Pharmacological activities of Ba SpII RP4 PL[A.sub.2] from Bothrops alternatus snake venom.

INTRODUCCION

En Argentina se registran alrededor de 850 casos de accidentes ofidicos anuales, siendo en su gran mayoria producidos por serpientes del genero Bothrops (Viperidae) (9). Los accidentes se producen en el campo o en el peridomicilio, donde se acercan en busca de roedores o batracios que les sirven de alimento. La ocurrencia de intoxicacion por estos ofidios es mayor en los meses mas calurosos, debido a varias circunstancias entre las cuales se puede destacar el mayor numero de horas/luz, lo que redunda en una mayor oportunidad de interaccion ofidio/hombre.

Las serpientes pertenecientes al genero Bothrops son denominadas comunmente "yarara", y comprenden especies como Bothrops alternatus (yarara grande) y Bothrops diporus (yarara chica) (9), distribuidas en gran parte del pais. Estudios epidemiologicos demostraron que Bothrops alternatus es la especie que produce el mayor porcentaje de accidentes ofidicos (63,08%) en la Provincia de Corrientes, con un claro predominio en los meses de enero y marzo, coincidentes con la estacion de verano (21).

La mordedura por esta serpiente puede inducir una serie de efectos locales complejos incluyendo hemorragia, mionecrosis y edema, en adicion a efectos sistemicos (1-3). Los venenos de estos viperidos poseen un arsenal de proteinas capaces de degradar la matriz extracelular e interferir con la cascada de coagulacion, el sistema hemostatico y la reparacion de tejidos (10,14). Se deben a una variedad de componentes del veneno, como fosfolipasas [A.sub.2] (PL[A.sub.2]), enzimas similares a trombina (trombine-like) (23) y metaloproteasas (12) entre otros.

Las toxinas presentes en el veneno botropico han sido ampliamente estudiadas mediante ensayos quimicos y biologicos, tanto in vitro como en animales de experimentacion. Asi, se encontro que una metaloproteasa (baltergina) de B. alternatus (12) es capaz de desencadenar la apoptosis de celulas normales (7) o cancerigenas como en el caso de una toxina aislada de Vipera lebetina turanica (24) o bien de exhibir actividad citotoxica sobre una amplia gama de bacterias (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes), como una PL[A.sub.2] de B. neuwiedi pauloensis (20) por lo que se evidencia que ciertos componentes del veneno botropico son capaces de afectar no solo celulas eucariotas sino tambien procariotas.

En particular, las PL[A.sub.2] de Bothrops alternatus, que constituyen el 7,8% del veneno total (16), son de relevancia ya que ademas de cumplir su rol, probablemente en la digestion de la presa, exhiben numerosas actividades fisiopatologicas como neurotoxicidad, miotoxicidad, cardiotoxicidad, efectos anticoagulantes, pro-agregante plaquetario, inhibidor de la agregacion plaquetaria y actividad hemolitica (indirecta), entre otras (14, 18). Si bien en los ultimos tiempos se ha incrementado la purificacion y caracterizacion de fosfolipasas [A.sub.2] de los venenos de serpientes (4,19) muy poco se conoce acerca de fosfolipasas [A.sub.2] del veneno de Bothrops alternatus. Asi, genero especial interes un estudio exhaustivo, con la tecnologia y conocimientos actuales, de las actividades biologicas y fisiopatologicas de la PL[A.sub.2] mas abundante aislada del veneno de Bothrops alternatus. La enzima fue previamente purificada y caracterizada en sus aspectos estructurales, biologicos y, parcialmente bioquimicos (11).

El objetivo del trabajo fue investigar, a traves de ensayos in vitro, el comportamiento de PL[A.sub.2] previamente purificada, frente a determinadas actividades farmacologicas (citotoxica, bactericida y agregante plaquetaria), asi como evaluar eventuales cambios sobre su actividad y estabilidad ante condiciones extremas de temperatura y pH.

MATERIAL Y METODOS

Veneno y toxina. Se trabajo con mezclas de venenos desecados de especimenes adultos de Bothrops alternatus del nordeste argentino mantenidos en cautiverio en el Serpentario de la ciudad de Corrientes, Argentina. Las mismas fueron homogeneizadas y conservadas a -20[grados]C. La fosfolipasa [A.sub.2] (Ba SpII RP4) fue aislada segun tecnica previamente descripta (11).

Ensayos de citotoxicidad sobre cultivo de lineas celulares. Ensayos realizados sobre linea C2C12. Para los ensayos de citotoxicidad se utilizaron mioblastos indiferenciados obtenidos de monocapas subconfluentes. Las celulas resuspendidas se sembraron en placas de 96 pocillos, 1,5-2,5 x 104 celulas por pocillo, en el mismo medio de crecimiento (DMEM-SFB 5%). En los ensayos realizados con mioblastos, al alcanzar la monocapa un 80% de confluencia, se retiro el medio de cultivo y diferentes concentraciones de la enzima Ba SpII RP4 (20-200 [micron]g) aislada de B. alternatus, diluida en el medio de cultivo suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB) fueron adicionados a las celulas en cultivo (200 [micron]l/pocillo). En tanto, para los ensayos con miotubulos se procedio a la diferenciacion de los mismos previo a la adicion de la enzima. Luego de tres horas de incubacion a 37[grados]C y 5% de C[O.sub.2] en atmosfera humeda, la viabilidad celular fue cuantificada por tincion con cristal violeta. Las celulas no adheridas fueron removidas por lavado con PBS y las celulas que permanecieron adheridas fueron fijadas con 100 [micron]l de metanol:acido acetico glacial (3:1) y posteriormente tenidas con 100 [micron]l de cristal violeta 0,5% en metanol 20% (v/v). El colorante fue removido de las celulas por adicion de 100 [micron]l de una solucion reveladora de etanol:acido acetico glacial (3:1). La densidad optica de la solucion coloreada se determino a 620 nm en lector de microplacas (Thermo Multiskan Ex). La citotoxicidad se evaluo por comparacion de las absorbancias resultantes de los pocillos con la enzima, con la absorbancia promedio de los pocillos utilizados como control (sin enzima, considerados como 100% de viabilidad) y fueron expresados como porcentaje de viabilidad celular. Estos valores se graficaron versus las concentraciones de enzima ensayadas. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Para analizar cualitativamente la presencia de alteraciones morfologicas de las celulas por el tratamiento con la enzima, se utilizo un microscopio de contraste de fases Axiovert 40[R], Carl Zeiss Argentina, y se tomaron fotografias con camara digital Canon 4 mega pixeles CCD 2272x1704 pixeles efectivos.

Ensayos realizados sobre lineas LM3 y NMuMG. Para los ensayos de citotoxicidad de la fosfolipasa [A.sub.2] aislada (concentracion de 1-80 [micron]g/ml), se utilizaron las celulas epiteliales normales mamarias murinas (NMuMG) o las celulas epiteliales tumorales mamarias murinas (LM3) obtenidas de monocapas subconfluentes y se realizaron los ensayos como se describe en las pruebas con la linea celular C2C12.

Evaluacion de la actividad bactericida. Metodo de McGeachie. Se utilizaron placas de Petri de 9 cm de diametro, conteniendo agar tripticasa de soya (TSA). Se adicionaron 50 [micron]l de cada suspension bacteriana de S. aureus (cepa ATCC 25923) y E. coli (cepa ATCC 25922), correspondiente al tubo No. 2 de la escala McFarland (6 x [10.sup.8] UFC/ml), uniformemente en el medio de cultivo. Luego, se realizaron orificios de 2 mm en el gel utilizando un sacabocados previamente esterilizado. En cada placa los orificios se distribuyeron equidistantemente. Posteriormente, se agrego a cada orificio 10 [micron]l de la dilucion correspondiente de Ba SpII RP4 a ensayar (6; 3; 1,5 y 0,75 [micron]g/ml). Uno de los orificios se utilizo como control negativo, en el que se sembro solamente solucion fisiologica esteril y en otro pocillo se sembro solo veneno (10 mg/ml) como control positivo de inhibicion de crecimiento bacteriano. Despues de la distribucion de las diluciones de la PL[A.sub.2], las placas se incubaron en estufa a 37[micron]C durante 24 h. La lectura se realizo por la medicion del diametro del halo de la zona de inhibicion, considerando inclusive el diametro del orificio (6). Las pruebas se realizaron por cuadruplicado para cada cepa y enzima ensayada. La presencia de un halo de inhibicion definido alrededor del pocillo indico actividad antibacteriana positiva.

Test de microdilucion en caldo. Esta prueba fue realizada en placas de ELISA con fondo plano de 96 pocillos (17). Brevemente, las suspensiones bacterianas utilizadas en el metodo anterior se ajustaron al tubo No 1 de la escala McFarland (3 x 108 ufc/ml) y se preincubaron con igual volumen de la enzima a ensayar (6; 3; 1,5 y 0,75 mg/ml). Luego de 7 h de incubacion a 37[grados]C, a la densidad optica a 620 nm fue leida en un lector de microplacas (Termo Multiskan Ex). Se realizaron controles utilizando caldo TSA en lugar de enzima. La actividad antibacteriana fue medida como una disminucion en la absorbancia.

Actividad sobre la agregacion plaquetaria. Se evaluo el erecto de la enzima PL[A.sub.2] sobre la agregacion de plasma rico en plaquetas (PRP) humano. Se preparo una suspension de plaquetas 300.000/[micron]L y se llevo a cabo la agregacion plaquetaria en un agregometro PA-04 (Qualiterm Electronica) de acuerdo al procedimiento usual 5. Como agonista plaquetario (control de 100% de agregacion) se utilizo trombina bovina (Sigma-Aldrich, USA) en una dosis de 1,04 [micron]g/10 [micron]l. Previamente, unos 500 [micron]l de PRP fueron pre-incubados por 2 minutos antes de llevar a cabo este test. Despues de la preincubacion del PRP, este fue incubado con 5 y 10 [micron]l de la enzima PL[A.sub.2] (1 mg/ml) aislada durante 5 min. Se midio el tiempo de agregacion luego de adicionar el agonista (trombina).

Factores que afectan la estabilidad de la enzima. Efecto de la temperatura. Se evaluo el efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la PL[A.sub.2] aislada mediante test cinetico. Para ello, las soluciones de enzima (1 mg/ml) fueron preincubadas a diferentes temperaturas (4, 25, 37, 50, 60, 80 y 90[grados]C) por 30 minutos. Finalizado el tiempo de exposicion, se sometio la enzima a las condiciones estandares del ensayo cinetico (15). El sustrato consistio de una solucion de fosfatidilcolina de soja (0,265%), Ca[Cl.sub.2]10 mM, NaC1 100 mM, rojo fenol 100 mM y Triton X-100 7 mM (pH 7,6). En este ensayo enzimatico el sustrato se encuentra bajo la forma fisicoquimica de micela mixta PC-Triton X-100 en una relacion molar 1:2. La actividad de fosfolipasa [A.sub.2] (basada en el cambio de pH por la liberacion de acidos grasos) se expreso como la pendiente maxima de disminucion de absorbancia/minuto utilizando un espectrofotometro UV/visible CamSpec M 330 (a 30[grados]C, [lambda] 558 nm). Una unidad (U) corresponde al cambio de 1 unidad de absorbancia. La actividad especifica se expreso en U/min/mg (enzima). Las lecturas se realizaron en intervalos de 60 segundos durante 5 minutos. Una variante que resulto apropiada en este ensayo fue la medicion directa del pH con un peachimetro (Lab pHmeter Adwa AD-1000). En este caso la actividad se calculo como la pendiente maxima de disminucion de pH/minuto. La temperatura optima fue aquella que provoco el mayor cambio de pH por minuto.

Efecto del pH. Se evaluo el efecto del pH sobre la estabilidad de la enzima aislada mediante el ensayo de hemolisis radial indirecta a traves de una tecnica ya descrita (13). Para ello se incubaron soluciones de la enzima (1 mg/ml) en diferentes buffers en un rango de 2,5-10 por 19 h a 25[grados]C, para luego someterla al ensayo bajo las condiciones habituales del mismo. En placas plasticas (135 x 80 mm) se depositaron 25 ml de agar al 1% en PBS (previamente fundido y enfriado a 50[grados]C), 0,3 ml de suspension de yema de huevo 1:3 en PBS, 0,3 mi de paquete de globulos rojos lavados, 0,25 mi de Ca[Cl.sub.2] 0,01 M y 5 [micron]g de azida sodica. Se dejo solidificar y se confeccionaron orificios de 3 mm de diametro con sacabocados, aplicandose posteriormente 15 [micron]l de solucion de la PL[A.sub.2] purificada a diferentes concentraciones (desde 0,0312 a 2,00 mg/ml). Uno de los orificios se utilizo como control negativo sembrandose 15 [micron]l de PBS, mientras que otro se utilizo como control positivo sembrandose 15 [micron]l de solucion de veneno de Bothrops alternatus (1 mg/ml). Las placas se incubaron en camara humeda durante 20 h a 37[grados]C, midiendose luego los diametros de los halos de hemolisis.

[FIGURA 1 OMITIR]

Factores que afectan la actividad de la enzima (Ba SpII RP4). Efecto de la temperatura. Este efecto se evaluo mediante test cinetico. Para ello las cineticas se llevaron a cabo, tal como se describio previamente (ver Factores que afectan la estabilidad) incubando las mezclas de reaccion a distintas temperaturas (5, 15, 22, 30, 50 y 60[grados]C), midiendose la actividad a traves de la disminucion del pH de la mezecla de reaccion. Asi, la temperatura optima fue aquella que provoco el mayor cambio de pH por minuto.

Efecto del pH. El efecto del pH sobre la actividad de la enzima aislada se evaluo mediante el ensayo de hemolisis radial indirecta, dado que el principio en el cual se basa el metodo cinetico (disminucion de pH inducido por la liberacion de acidos grasos o de la absorbancia, en el caso de incluir un colorante) es incompatible con el efecto que aqui fue de interes evaluar. Para ello, se prepararon soluciones de la enzima en diferentes buffers fosfatos (que abarcaron rangos de pH de 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12). Luego se sembraron en pocillos de agar-sangre tal como se describio anteriormente. El pH optimo fue aquel que genero el halo hemolitico de mayor diametro.

Analisis estadistico. Todos los experimentos fueron repetidos al menos cuatro veces. La significancia de las diferencias entre las medias fue evaluada mediante ANOVA siguiendo el test de Dunnet para comparaciones multiples entre grupos. Los valores de p menores a 0,05 fueron considerados significativos estadisticamente. El efecto del pH sobre la actividad enzimatica fue estimado mediante regresion lineal ajustada al metodo de los minimos cuadrados.

RESULTADOS

La fosfolipasa [A.sub.2] aislada del veneno de B. alternatus (Ba SpII RP4) no presento actividad citotoxica sobre los mioblastos/miotubulos murinos, como tampoco lo hizo sobre la estirpe de celulas epiteliales mamarias murinas normales y tumorales a las dosis y tiempos de exposicion ensayados. (Figura 1A). Al microscopio se observo que las celulas C2C12 no tratadas (control) y tratadas se encontraron distribuidas homogeneamente en el cultivo, exhibiendo una forma fina y alargada. Las celulas NMuMG y LM3 tratadas con la PL[A.sub.2] y aquellas no tratadas (controles), mostraron crecimiento homogeneo en el cultivo, exhibiendo una forma poligonal con bordes definidos (Figuras 1B y C). Por otra parte, se constato ausencia de actividad bactericida sobre las cepas de S. aureus (cepa ATCC 25923) y E. coli (cepa ATCC 25922) detectable por el metodo de McGeachie y por el metodo de mayor sensibilidad de microdilucion en caldo a las dosis ensayadas (6; 3; 1,5 y 0,75 [micron]g/ml) de la PL[A.sub.2] aislada.

[FIGURA 2 OMITIR]

Sin embargo, la PL[A.sub.2] mostro capacidad para inhibir la agregacion plaquetaria. Como se observa en la Figura 2, la trombina que se utilizo como agonista plaquetario (1,04 [micron]g/10 [micron]l) y por lo tanto control positivo de la reaccion, fue capaz de inducir el 100% de agregacion plaquetaria (A). En tanto, cuando el PRP fue preincubado con 5 [micron]l de la PL[A.sub.2] aislada (1 mg/ml), en presencia de la trombina (5 [micron]L) y habiendo pasado 2 minutos, la mezcla inhibio la agregacion en una magnitud del 20% (B). Al aumentar la cantidad de enzima (10 [micron]g) en la mezcla (10 [micron]L), esta causo un 90% de la inhibicion de la agregacion plaquetaria inducida por trombina (C). Se comprueba asi una actividad inhibitoria sobre la agregacion plaquetaria dosis-dependiente de la concentracion de la enzima PL[A.sub.2] utilizada en este ensayo.

Ademas, la fosfolipasa Ba SpII RP4 exhibio alta estabilidad frente a su pre-incubacion en un amplio rango de temperaturas (4 a 90[grados]C) y de pH (3-12) (Figura 3). La PL[A.sub.2] se mantuvo cataliticamente activa sin mostrar variaciones significativas, aunque a pH 3,5 y 4,5 la actividad enzimatica disminuyo por encontrarse cercanos al punto isoelectrico (pI) de la enzima (4,88) (Figura 4). Luego, la actividad enzimatica mostro una dependencia directa con el aumento de la temperatura aunque por encima de los 50[grados]C se observo una ligera turbidez en la emulsion del test, que se incremento aun mas a los 70[grados]C. Es probable que debido a las elevadas temperaturas, la emulsion se haya visto afectada en su estabilidad (Tabla 1) y ello no permitiera registrar cambios en la reaccion por la enzima.

[FIGURA 3 OMITIR]

DISCUSION

El presente trabajo amplia la caracterizacion bioquimica de la PL[A.sub.2] mas abundante (Ba SpII RP4) del veneno de Bothrops alternatus que habita el nordeste argentino. Trabajos previos realizados por este grupo de investigacion mostraron que la enzima, cataliticamente activa y de naturaleza acidica, exhibe actividades farmacologicas de leves a nulas, e.g. es poco edematogenica, no es letal ni anticoagulante, solo alarga el tiempo de coagulacion, y carece de actividad miotoxica (11).

Los resultados aqui descriptos demuestran que ademas es capaz de inhibir la agregacion plaquetaria, actividad que juega un rol importante en la retraccion y cicatrizacion de heridas. El efecto inhibitorio de esta enzima sobre la agregacion del PRP humano fue dosis-dependiente. Estas evidencias son coincidentes con las encontradas por otros investigadores (4), quienes ademas indicaron que los fosfolipidos presentes en el plasma son el sustrato necesario para la expresion de dicho efecto sobre las plaquetas.

[FIGURA 4 OMITIR]

Al estudiar la accion toxica de la enzima sobre cultivos celulares y cepas bacterianas se demostro que la PL[A.sub.2] de B. alternatus carece de actividades citotoxica y bactericida a las dosis y tiempos de exposicion ensayados. Contrariamente, el veneno entero de B. alternatus de Argentina produjo una disminucion en la viabilidad celular de mioblastos murino de musculo esqueletico (CC50:5,8 [micron]g/ml) como tambien mostro un efecto apoptotico (8). Al respecto, otras investigaciones avalan la accion sinergica de la PL[A.sub.2] aislada (7) y de una metaloproteinasa (12) del mismo veneno, ya que la primera (no miotoxica) es capaz de provocar un efecto toxico despues de la citotoxicidad causada por la metaloproteinasa (baltergina) antes mencionada. Asimismo, este veneno (10 mg/ml) posee accion bactericida indicando la presencia de otras enzimas capaces de afectar estas celulas procariotas del tipo Gram-positivas y Grato-negativas, que podrian proteger a las serpientes durante su alimentacion.

Los estudios de estabilidad muestran una resistencia estructural de la fosfolipasa a los cambios de temperatura y pH, manifiesta por una actividad catalitica practicamente invariable. Este comportamiento es comun entre las PL[A.sub.2] como aquella Asp49 aislada de B. moojeni (22) tambien de naturaleza acida. Esta efectiva estabilidad frente a los cambios de temperatura y pH la tornan apta para su manipulacion y conservacion sin riesgo a perdida de actividad biologica.

Las evidencias reunidas en este ensayo demuestran los escasos efectos lesivos que produce la Ba SpII RP4 PL[A.sub.2] y su gran estabilidad quimica y estructural. Estos resultados la tornan un atractivo inmunogeno para la produccion de antiveneno especifico a traves del desarrollo de planes de inmunizacion de elevada carga antigenica, sin compromiso del estado general del animal productor. Futuros estudios deberan confirmar/descartar su empleo en el desarrollo de inmunobiologicos alternativos mas especificos, que neutralicen la letalidad del veneno con menores complicaciones en el accidentado.

Agradecimientos. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (CONICET) y por la Secretaria General de Ciencia y Tecnica (PI B013/2010) de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), Argentina.

Recibido: 23 abril 2012 / Aceptado: 22 mayo 2012

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(24.) Son DJ, Park MH, Chae SJ, Moon SO, Lee JW, Song HS, Moon DC, Kang SS, Kwon YE, Hong JT. 2007. Inhibitory effect of snake venom toxin from Vipera lebetina turanica on hormone-refractory human prostate cancer cell growth: induction of apoptosis through inactivation of nuclear factor kappaB. Mol Cancer Ther 6: 675-683

Garcia Denegri, M.E. [1]; Bustillo, S. [2]; Romero-Vargas, F. [3]; Leiva, L.C. [2]; Acosta, O.C. [1]

[1] Catedra Farmacologia, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), Sargento Cabral 2139, Corrientes (3400), Argentina. E-mail: patmed@vet.unne.edu.ar. [2] Catedra de Quimica Biologica I, FACENA, UNNE. [3] Laboratorio de Quimica de Proteinas, Instituto de Biologia, UNICAMP, Brasil.
Tabla 1. Valores de actividad enzimatica
a diferentes temperaturas de reaccion.

temperatura        actividad       r
([grados]C)     ([DELTA]pH/min)

5,6                   0,058         9,96
15                    0,091         9,93
22                    0,110         9,96
31                    0,176         9,99
50                    0,164         9,99
60                    0,101         9,96
70                no medible          --

r = coeficiente de correlacion lineal.
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Author:Garcia Denegri, M.E.; Bustillo, S.; Romero-Vargas, F.; Leiva, L.C.; Acosta, O.C.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jul 1, 2012
Words:5135
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