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Actividad inhibitoria de plantas in vitro de Drosera capillaris sobre Mycobacterium tuberculosis.

Inhibitory activity of in vitro plants from Drosera capillaris against Mycobacterium tuberculosis

Introduccion

La tuberculosis (TBC) es una enfermedad infecto-contagiosa causada por Mycobacterium tuberculosis, tambien conocido como bacilo de Koch. Es considerada la enfermedad mas prevalente en el mundo y solo en el 2006 se estimo en 9,2 millones (139 por 100 000 habitantes) los nuevos casos de infectados con TBC, de los cuales 500 000 fueron multidrogo resistentes (resistentes a isoniacida y rifampicina); el numero de muertes fue de 1,7 millones o 200 fallecidos por hora (WHO, 2006). Alrededor del 95% de los casos y 98% de muertes por TBC ocurren en los paises en vias de desarrollo, en tanto que el 75% de los casos que se presentan en estos paises estan en el grupo de edad economicamente activa (de 15 a 50 anos); en el Peru la tasa de morbilidad en el ano 2007 alcanzo la cifra de 125,1 por 100 000 habitantes (Bonilla 2008).

Precisamente, la resistencia a drogas antituberculosas y la co-infeccion TB-VIH constituyen una seria amenaza para los programas nacionales de control de TB en el mundo y en especial en los paises en desarrollo (Aziz et al. 2006, Asencios et al. 2009), de alli la necesidad de formular nuevas y variadas estrategias en el control de la enfermedad donde no solamente se considere el aspecto biomedico sino tambien el aspecto social (Jave 2009, Ticona 2009).

La familia Droseraceae, conocidas como plantas carnivoras, comprende 4 generos entre los que se encuentra Drosera con 125 especies distribuidas en todo el mundo incluyendo regiones tropicales y tundras, excepto en desiertos y la Antartida (Culham & Gornall 1994). Drosera capillaris Poir. ("atrapainsectos") se distribuye desde America del Norte hasta Venezuela y Brasil (Silva & Giulietti 1997) pero no ha sido reportada para la flora del Peru (Brako & Zarucchi 1993).

Drosera capillaris, al igual que otras especies "carnivoras", presenta diversas adaptaciones morfologicas y anatomicas para nutrirse de insectos que caen en sus trampas; estas se encuentran provistas de glandulas pedunculadas con exudados pegajosos que atraen y digieren a los insectos gracias a sus enzimas proteoliticas, lo que constituye una respuesta evolutiva a su crecimiento en habitats deficientes en nitrogeno (Cronquist 1988).

En cultivo de tejidos, desde los primeros trabajos realizados en D. rotundifolia (Simola 1978), diversos protocolos en micro-propagacion, organogenesis directa e indirecta y embriogenesis somatica, han sido desarrollados hasta en 12 especies de Drosera (Samaj et al. 1999); sin embargo, en D. capillaris no ha sido realizado trabajo alguno en cultivo de tejidos. Por otro lado, numerosas especies de Drosera son usadas tradicionalmente para varios propositos medicinales, como agentes antitusigenos y antiespasmodicos y antiasmaticos; en infecciones bronquiales y afecciones pulmonares (Samaj et al. 1999). Todo ello debido a la presencia de las naftoquinonas, metabolitos secundarios normalmente sintetizados y acumulados en varias especies de Drosera (Culham & Gornall 1994, Zenk et al. 1969). Entre las naftoquinonas mas importantes tenemos la plumbagina y la 7-metiljuglona (Finnie & van Staden 1993), las que fueron estudiadas en diferentes especies de Drosera como marcadores quimiotaxonomicos (Culham & Gornall 1994, Zenk et al. 1969). Estas naftoquinonas, ademas, tienen propiedades antivirales, antibacterianas, antifungicas, anticancerigenas, antileprosicas y antiescleroticas (Samaj et al. 1999).

Por estas razones en el presente trabajo se ha estudiado la actividad inhibitoria del extracto crudo metanolico de plantas micropropagadas in vitro de D. capillaris sobre Mycobacterium tuberculosis causante de la tuberculosis.

Material y metodos

Material biologico.- El material vegetal fue colectado en setiembre de 1988 en el Valle del Cauca, Cali (Colombia) e introducido en condicion in vitro en la Unidad de Recursos Geneticos del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali. En tal condicion fue transferido por el Dr. Guillermo E. Delgado Paredes al Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Recursos Geneticos de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo (UNPRG), Lambayeque (Peru), donde se conserva por subcultivos anuales. La especie fue identificada como Drosera capillaris Poir. consultando el trabajo sobre Droseraceae del Brasil (Silva & Giulietti 1997) y verificado por la especialista en Droseraceae, Dra. Tania R.S. Silva, del Instituto de Biociencias de la Universidad de Sao Paulo (Brasil). Muestras herborizadas han sido depositadas en el Herbario Pedro Ruiz Gallo de la Facultad de Ciencias Biologicas de la UNPRG.

El material microbiologico estuvo constituido por cinco cepas de Mycobacterium tuberculosis, aisladas, identificadas y codificadas (C1, C2, C3, C4 y C5) en el Area de TBC del Laboratorio de Micobacterias (Laboratorio de Referencia Regional en Salud Publica, Lambayeque, Peru).

Micropropagacion.- Plantas adultas in vitro de D. capillaris, de 10-12 meses de edad, fueron utilizadas en el proceso de micropropagacion. Los explantes estuvieron constituidos por pequenas plantulas con 5-10 hojas y hojas adultas individuales de 15 mm de longitud; y fueron cultivados, en condiciones asepticas, en frascos de vidrio transparentes conteniendo el medio de cultivo conformado por las sales minerales MS (Murashige & Skoog, 1962), las vitaminas tiamina.HCl 1 mg/L y m-inositol 100 mg/L, los reguladores de crecimiento acido naftalenacetico (ANA) y acido giberelico (A[G.sub.3]) 0,02 mg/L, respectivamente, y sacarosa 2%. El pH del medio de cultivo fue ajustado en 5,8 [+ o -] 0,1 con NaOH y HCl 0,5N, respectivamente, antes de la gelificacion con phytagel 0,3%. La esterilizacion se realizo en autoclave a 120 oC de temperatura y 15 lbs/[pulg.sup.2] de presion durante 20 minutos.

Obtencion del extracto.- Plantas in vitro de 10-12 meses de edad fueron deshidratadas a temperatura ambiente bajo sombra durante 24 h y luego secadas a estufa a 40[grados]C por 48 h; posteriormente, fueron molidas en mortero de porcelana hasta constituir un polvo fino; 54 g de esta masa fue sometida a extraccion con metanol (MeOH) por dos veces consecutivas con permanencia del solvente por 48 h; despues del filtrado y evaporado el solven te, el extracto crudo metanolico fue recuperado con cloroformo ante las dificultad de su recuperacion con MeOH.

Analisis por cromatografia a gas.- El extracto crudo metanolico fue analizado en el Laboratorio de Quimica de la Universidad Estadual de Londrina, Parana (Brasil), utilizando el sistema de cromatografia a gas (Budzianowsky 1995). El equipo utilizado fue un cromatografo a gas detector FID-SHIMADZU modelo GC. 17-D; columna HP-5, estableciendose las siguientes condiciones de corrida: Inyector: 300[grados]C, detector: 300[grados]C, columna: 200[grados]C/2 min, temperatura final: 320[grados]C - 10[grados]C/ min, volumen de corrida: 2,7 mL/min, solvente: hexano, gas de arrastre: helio, tiempo de corrida: 30 min y patrones utilizados: plumbagina (5-hidroxi-2-metil-1,4-naftoquinona) y algunos compuestos hidrocarbonados de cadena larga.

Determinacion de la actividad inhibitoria de la fraccion cloroformica del extracto crudo metanolico de D. capillaris.- Para la preparacion de la suspension Mycobacterium tuberculosis y diluciones con una espatula esterilizada se tomo el mayor numero de colonias de las cepas y se colocaron en la pared interna de tubos de ensayo que contenian 5 mL de agua destilada esterilizada; se trituraron y mezclaron las colonias con una bagueta esmerilada esterilizada hasta obtener una suspension homogenea; se dejo reposar durante 30 - 60 segundos hasta sedimentar y luego se tomo el sobrenadante y ajusto la turbidez de la suspension (suspension madre) comparando con el patron de turbidez que contiene 1 mg/mL de masa bacilar. Se prepararon diluciones al decimo de [10.sup.-1] a [10.sup.-6] seleccionandose las diluciones [10.sup.-3], [10.sup.-5] y [10.sup.-6].

Las soluciones de la fraccion cloroformica del extracto crudo metanolico de D. capillaris fueron preparadas tomando 312,5; 625 y 1 250 mg del extracto crudo metanolico y diluidos en 10 mL de cloroformo como volumen final; posteriormente, cada solucion fue agregada a 250 mL del medio de cultivo Lowenstein-Jensen (L-J), obteniendose las concentraciones de 1,25; 2,5 y 5 mg/mL, respectivamente; luego se dispenso en tubos de ensayo tapa rosca a razon de 6 mL por tubo de ensayo; se llevo al coagulador a 85[grados]C por 45 minutos y finalmente a control de esterilizacion con las tapas ligeramente flojas a 37[grados]C/24 h.

El proceso de siembra de M. tuberculosis se realizo en una camara de seguridad biologica tipo II clase A, estableciendose tres series de dilucion: [10.sup.-3], [10.sup.-5] y [10.sup.-6], eliminandose previamente el liquido condensado en el medio de cultivo. De cada una de las diluciones indicadas, se sembro 0,2 mL de la dilucion en las siguientes replicas: 2 tubos de ensayo con medio de cultivo L-J sin extracto crudo (control), 4 con medio de cultivo L-J con cloroformo (blanco), 5 con medio de cultivo L-J con extracto acuoso, 3 con medio de cultivo L-J con la fraccion cloroformica del extracto metanolico 1,25 mg/mL, 3 con medio de cultivo L-J con la fraccion cloroformica del extracto metanolico 2,5 mg/ mLy 3 con medio de cultivo L-J con la fraccion cloroformica del extracto metanolico 5 mg/mL. Estos tubos de ensayo fueron inicialmente mantenidos en posicion horizontal, con rotacion suave para distribuir homogeneamente la suspension en la superficie del medio de cultivo; luego se llevaron a estufa a 37[grados]C.

Lectura e interpretacion de resultados.- Las lecturas se realizaron a las 4 y 6 semanas de instalado el experimento. En el caso de los tubos de ensayo control la media de las colonias contadas indico el numero de bacilos sembrados. En el caso de los tubos de ensayo con extracto crudo se parte del hecho de que la suspension madre de la cepa en estudio contiene 1 mg/ mL de masa bacilar; sin embargo, la cantidad de bacilos en 1 mg de masa bacilar varia considerablemente de una cepa a otra, variacion que puede ser de uno -- cien millones de germenes/ mL, por lo que fue necesario sembrar las diluciones [10.sup.-3] y [10.sup.-5]. El procedimiento esta resumido en la figura 1.

[FIGURA 1 OMITIR]

Determinacion de la Concentracion minima inhibitoria (CMI) y [CMI.sub.90].- Se determinaron los valores CMI y [CMI.sub.90], teniendo en cuenta la concentracion mas baja del extracto crudo capaz de inhibir el crecimiento visible de M. tuberculosis despues del periodo de incubacion y la concentracion del extracto capaz de inhibir el 90% del crecimiento bacteriano, respectivamente (Andrews 2001).

Diseno experimental y analisis estadistico.- Se utilizo el diseno de contrastacion de hipotesis con estimulo creciente (Goode & Hatt 1986) donde las cepas de M. tuberculosis fueron los grupos experimentales a las que se enfrento diferentes concentraciones de la fraccion cloroformica del extracto crudo metanolico de D. capillaris. En el analisis estadistico de los datos se realizo el analisis de varianza asi como las pruebas de comparaciones multiples de Tukey con un nivel de significacion de 0,05%.

Resultados

La propagacion clonal in vitro de D. capillaris se realizo utilizando como explantes hoja y planta integra. En el primer caso se formaron 5-10 brotes por explante siguiendo el modelo de organogenesis directa, es decir, sin formacion de callo, que luego de 6 meses de cultivo las plantas alcanzaron una altura promedio de 3 cm, y en el segundo caso se formaron nuevas plantas a partir de las yemas axilares que alcanzaron una altura promedio de 4-5 cm en el lapso de 6 meses. En ambos casos las plantas formadas desarrollaron un optimo sistema radicular, quedando habilitadas para su eventual transferencia a condiciones de invernadero.

El analisis cromatografico mostro 8 picos claramente diferenciados, correspondiendo a diferentes sustancias, tal como lo indican sus particulares tiempos de retencion. El pico de interes fue el 2, correspondiendo a la plumbagina, con un tiempo de retencion de 3,76 min; los otros picos (3-8) correspondieron a otras sustancias hidrocarbonadas de cadena larga de 18, 20, 24, 26, 27 y 32 carbones (Figura 2).

Los resultados del efecto de la fraccion cloroformica del extracto crudo metanolico de D. capillaris sobre M. tuberculosis se muestra en la Tabla 1, observandose que la inhibicion en el crecimiento bacteriano fue modulada por el factor cepa y el factor concentracion. Las cepas C3 y C5 fueron excluidas en la evaluacion puesto que no desarrollaron el numero minimo de 200 colonias en el testigo, tal como lo recomienda la metodologia utilizada (OPS, 1986), por tanto, unicamente fueron evaluadas las cepas C1, C2 y C4. En estas cepas, conforme se incrementaba la concentracion del extracto (1,25; 2,5 y 5 mg/mL) el porcentaje de inhibicion tambien se incrementaba, desde 40% en la concentracion 1,25 mg/mL para la cepa C4 hasta 93,1% en la concentracion 5 mg/mL para la cepa C2. La prueba de Tukey, con 0,05 de significacion indico que las concentraciones 2,5 y 5 mg/mL fueron estadisticamente significativas y, asimismo, exhibieron la mayor capacidad de inhibicion en el crecimiento de M. tuberculosis (Tabla 2).

La CIM para las cepas C1 y C2 fue 1,25 mg/L en tanto que la [CIM.sub.90] para las cepas C2 y C4 fueron 5 y 2,5 mg/L, respectivamente (Tabla 3).

Discusion

Una de las aplicaciones mas importantes y practicas del cultivo de tejidos vegetales es la micropropagacion cuyos fundamentos fueron establecidos por Murashige (1974). En el caso de Drosera, varios autores han realizado trabajos en cultivo de tejidos utilizando como explantes semillas, hojas, apices, raices y flores, en medio de cultivo MS (Murashige & Shoog 1962) y en varias combinaciones de las auxinas acido indol-3-acetico (AIA) y ANA con la citocinina benziladenina (BA), en bajas concentraciones (Samaj et al. 1999); sin embargo, en nuestro trabajo, la auxina ANA 0,02 mg/mL no fue suplementada con citocinina alguna sino con [AG.sub.3] 0,02 mg/mL, alcanzando altos niveles de brotamiento y elongacion de brotes y hojas. Adicionalmente, a la micropropagacion, la utilizacion de otras tecnicas del cultivo de tejidos, como la induccion de callos y el establecimiento de suspensiones celulares (Danelutte et al. 2005), abren la posibilidad de inducir la produccion en gran escala de determinados metabolitos secundarios no solamente conocidos sino tambien ineditos en condiciones naturales, sin necesidad de depredar la especie en su ambiente natural y mas aun cuando se utilizan partes sensibles de la planta como en el caso raices.

Numerosos estudios fitoquimicos han demostrado que varias especies de Drosera sintetizan dos grupos principales de metabolitos secundarios: naftoquinonas y flavonoides, tanto en plantas de campo como en plantas micropropagadas in vitro (Culham & Gornall 1994, Zenk et al. 1969, Budzianowsky et al. 1993). Las naftoquinonas son compuestos que pertenecen a la familia quimica de los fenilpropanos de estructura C6 - C1 + C5. En Drosera destacan la plumbagina y la 7-metiljuglona, biosintetizadas a partir de la tirosina en la ruta del acetato-polimanolato (Durand & Zenk 1971, 1976); sin embargo, tambien han sido identificadas otras naftoquinonas consideradas menores como droserona, hidroxidroserona, droserona-5-glucosido, rosoloside e hidroxidroserona-5-glucosido y otras como biramentaceona y 2-metilnaftazarina-5-O-glucosido, consideradas artefactos producidos por extraccion con solventes organicos (Samaj et al. 1999). En nuestro trabajo, al igual que en plantas de campo de D. capillaris (Durand & Zenk 1976) y de D. natalensis (Crouch et al. 1990), solamente fue posible la identificacion de plumbagina pero no de 7-metiljuglona, en tanto que ambas sustancias fueron identificadas en D. capensis (Crouch et al. 1990, Wawrosch et al. 1996) y D. intermedia (Budzianowsky et al. 1993, Bonnet et al. 1984) y en el caso de D. hilaris (Wawrosch et al. 1996), D. rotundifolia (Wawrosch et al. 1996, Bonnet et al. 1984) y D. spathulata (Budzianowsky et al. 1993), unicamente se identifico 7-metiljuglona. Respecto a los flavonoides, si bien es cierto no se han reportado en nuestro trabajo, quercetina, hiperina, isoquercitrina, astragalina y miricetina-3-ramnosida (Budzianowsky et al. 1993) han sido identificados en D. spathulata y D. intermedia.

Mycobacterium tuberculosis es una bacteriana con la habilidad para adquirir resistencia a multiples antibioticos lo que conlleva a la ocurrencia de cepas multidrogoresistente (MDR-TB) como resultado de un tratamiento inconsistente o parcial a lo que se suma la escasa colaboracion del paciente; ello determina la necesaria utilizacion de drogas de segunda linea anti-TB, tales como aminoglicosidos, polipeptidos, fluoroquinolonas, etionamida y acido [rho]-aminosalicilico (Gibbons 2008). En efecto -y como es de deducir-, el tratamiento de la tuberculosis se basa en conceptos muy distintos a los de las demas infecciones bacterianas (Coll 2003). Mycobacterium tuberculosis tiene un tiempo de generacion prolongada y la capacidad para entrar en periodos de latencia con una actividad metabolica limitada, lo cual dificulta la accion de los antimicrobianos. La bacteria presenta una resistencia natural a numerosos antibacterianos, por el hecho de poseer una pared compleja, muy hidrofoba, con una permeabilidad reducida para un gran numero de compuestos (Jarlier & Nikaido 1994). Al respecto, estudios geneticos han demostrado que la resistencia a los farmacos antituberculosos se debe a mutaciones cromosomicas espontaneas en los genes que codifican la diana del farmaco o enzimas implicadas en la activacion del farmaco (Somoskovi et al. 2001). En tal sentido, se ha descrito la ocurrencia de enzimas modificantes como las betalactamasas (Kwon et al. 1995) o sistemas de eflujo (Cole et al. 1998), derivados de plantas, entre las que podemos contar a D. capillaris, que inhiben los mecanismos efluyentes de resistencia a los antibioticos bacterianos (Gibbons 2008).

Se considera que la accion del extracto crudo de D. capillaris sobre M. tuberculosis se realiza en la capa de lipidos de la pared celular, que es disuelta por la plumbagina, que ingresa al citoplasma por difusion a traves del peptidoglicano; asimismo, la eventual presencia de flavonoides (Budzianowsky et al. 1993, Scholly & Kapetanidis, 1989), contribuiria a degradar los lipidos de la pared celular bacteriana, propiciando la formacion de poros y alterando la permeabilidad de la misma, lo que facilitaria la entrada de la plumbagina al citoplasma produciendo un ingreso desordenado de sustancias toxicas y la salida de sustancias necesarias para la celula. Adicionalmente, una vez en el interior, la plumbagina seguiria actuando sobre las enzimas de la celula al reaccionar con los radicales SH y [NH.sub.2], causando su completa inactivacion y de esta manera obstaculizando su actividad enzimatica (Walker 2000).

La utilizacion del extracto crudo de la planta tendria ciertas ventajas sobre la utilizacion de metabolitos secundarios puros puesto que se minimizaria el riesgo de inducir resistencia, ademas, que el uso de extractos heterogeneos de toda la biomasa de la planta podria inducir un efecto sinergistico sobre algun organismo especifico (Leatemia & Isman 2004). Al respecto, estudios realizados sobre la actividad biocida de extractos crudos comparando con sustancias puras (piperamidas), obtenidas de Piper tuberculatum, han demostrado un efecto mas potente del extracto crudo sobre Aedes atropalpus (Scott et al. 2002) y Anticarsia gemmatalis (Navickiene et al. 2007), respectivamente, que cuando se utilizaron sustancias puras, aun en combinaciones binarias, terciarias y cuaternarias.

Agradecimiento

Al Br. Alexander Huaman Mera, por su asistencia tecnica en la preparacion del manuscrito.

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Jimmy Alvarado (1), Hilda Vasquez (1), Guillermo E. Delgado (1), Dalva Trevisan (2), Oscar Horna (3), Jurandir Pereira (2) y Consuelo Rojas (1) *

(1) Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Ciudad Universitaria, Juan XXIII No 391, Lambayeque - Peru.

* E-mail: crojasi2002@yahoo.es

(2) Departamento de Quimica Centro de Ciencias Exatas. Universidade Estadual de Londrina, Parana, Brasil.

(3) Direccion Regional de Salud. Laboratorio de Referencia Regional en Salud Publica -Lambayeque, Peru. Av. Salaverry No 1610 - Chiclayo.

* Autor para correspondencia

Presentado: 01/10/2010

Aceptado: 13/12/2010

Publicado online: 21/01/2011
Tabla 1. Efecto inhibitorio in vitro de la fraccion cloroformica del
extracto crudo metanolico de plantas in vitro de Drosera capillaris
(tratamiento) sobre Mycobacterium tuberculosis (Promedio de colonias).

                           Promedio           Porcentaje (%)
            Tratamiento   de colonias
Cepas *       (mg/mL)        (No)       Inhibicion   Resistencia

                0,0           240
C1             1,25          79,7          66,8         33,2
                2,5          56,0          76,7         23,3
                5,0          56,0          76,7         23,3

                0,0          252 5
C2             1,25          101,0         60,0         40,0
                2,5          30,0          88,1         11,9
                5,0          17,3          93,1          6,9

                0,0           325
C4             1,25          195,0         40,0         60,0
                2,5          35,5          89,1         10,9
                5,0          52,7          83,8         16,2

(a) Las cepas C3 y C5 fueron excluidas en la evaluacion puesto que no
desarrollaron  el numero minimo de 200 colonias.

Tabla 2. Prueba de significacion de Tukey (p<0,05) para tres cepas
de Mycobacterium tuberculosis frente a diferentes concentraciones
de la fraccion cloroformica del extracto crudo de plantas in vitro de
Drosera capillaris.

Orden de    Concentracion   Inhibicion en el    Significacion
Merito         (mg/mL)       crecimiento (%)       (0,05)

1               1,25              55,6                a
2                2,5              83,9                b
3                5,0              84,5                b

Tabla 3. Concentracion Inhibitoria Minima (CIM) y [CIM.sub.90] de la
fraccion cloroformica del extracto crudo metanolico de plantas in
vitro de Drosera capillaris sobre Mycobacterium tuberculosis. ND,
no determinado.

Cepas       CIM (mg/mL)   [CIM.sub.90] (mg/mL)

C1             1,25                ND
C2             1,25               5,0
C4              ND                2,5

Figura 2. Perfil fitoquimico del extracto crudo metanolico de plantas
de Drosera capillaris despues de 12 meses de cultivo in vitro.

PKNo       Time       Area     Height        Conc

1         1,063       9388       5009      6,0199
2         3,762      19228       6302     12,3301
3         6,353      19157       4614     12,2842
4         8,071      13459       2533      8,6304
5        11,868      32014       7074     20,5284
6        14,082       4452        987       2,855
7        14,510       5612       1061      3,5987
8        19,494      52637       5170     33,7533
                    155947      32750    100,0000
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Author:Alvarado, Jimmy; Vasquez, Hilda; Delgado, Guillermo E.; Trevisan, Dalva; Horna, Oscar; Pereira, Jura
Publication:Revista peruana de biologia
Article Type:Report
Date:Dec 1, 2010
Words:4760
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