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Actividad enzimatica de proteasas de Cyprinus carpio (Cypriniformes: Cyprinidae) extraidas de una laguna contaminada en Mexico.

Enzymatic activity of proteases from Cyprinus carpio (Cypriniformes: Cyprinidae) captured in a polluted lagoon in Mexico.

La carpa comun (Cyprinus carpio) pertenece a la familia Cyprinidae. Dichos organismos habitan principalmente en corrientes medias y bajas de los rios, en areas inundadas y en aguas confinadas poco profundas como lagos y lagunas (Peteri, 2004). La carpa es una de las especies de agua dulce mas cultivadas en el mundo, reportandose un 10% del total de la produccion global de acuicultura de agua dulce en 2014; Mexico se encuentra entre los paises productores de C. carpio mas importantes de America con 8 001 toneladas (FAO, 2015). La carpa esta ampliamente distribuida en el territorio mexicano, dada su gran adaptabilidad y capacidad reproductiva. En la laguna de Zumpango (19[grados]47'25" N-99[grados]7'51" W) ubicada al norte de la Cuenca del Valle de Mexico (municipio de Zumpango, Estado de Mexico), tradicionalmente se han obtenido carpas para consumo local. Sin embargo, en la actualidad existe una fuerte problematica ambiental por la descarga de aguas residuales. A pesar de las condiciones ambientales, dicha laguna funciona como vaso regulador y de almacenamiento de agua pluvial. La Comision Nacional del Agua en Mexico (CONAGUA) no ha detectado la presencia de metales pesados cancerigenos en este cuerpo de agua, aunque establecio que no era apta para consumo humano, con base en la deteccion de coliformes, de acuerdo con los limites maximos permisibles por la norma mexicana NOM-127-SSA1-1994 (IMTA, 2012).

Por otra parte, se ha enfocado el interes de grupos de investigacion e industriales en las proteasas de organismos acuaticos (enzimas que catalizan la rotura de enlaces peptidicos con la participacion de moleculas de agua como reactivos), dado que poseen caracteristicas proteoliticas particulares, como mayor eficiencia catalitica y estabilidad a bajas temperaturas de reaccion, entre otras (Haard & Simpson, 2000). En terminos de aplicaciones industriales, las proteasas son de las enzimas mas ampliamente utilizadas, por ejemplo, en la industria de alimentos para la produccion de hidrolizados de proteinas, reduccion de viscosidad, fabricacion de quesos, en la industria de detergentes y piel, asi como en aplicaciones farmaceuticas tales como medicamentos digestivos y anti-inflamatorios (Zhang & Kim, 2010). Adicionalmente, el conocimiento de proteasas de especies acuaticas es util en acuicultura para el entendimiento de la fisiologia, bioquimica y alimentacion del organismo. En condiciones in vivo, la capacidad de los peces para digerir proteina, asi como su absorcion o asimilacion, depende de la presencia y la calidad de las enzimas proteoliticas (Gonzalez-Zamorano, Navarrete, & Garcia-Carreno, 2013). Ademas, las proteasas influyen en la textura del pescado durante su manipulacion y almacenamiento postmortem. Este deterioro limita la vida util del producto (Sriket, 2014), motivo de estudio en varias especies como C. carpio (Haard & Simpson, 2000; Kumar, Garcia-Carreno, Chakrabarti, Toro, & Cordova-Murueta, 2007; Klomklao, 2008). La actividad de las proteasas puede afectarse por el habitat donde se desarrollan los organismos acuaticos (Fu et al., 2006). Una de las caracteristicas importantes que presentan los lagos y lagunas contaminados es la elevacion del pH del agua (Aguilar-Ibarra, 2010), por lo que el objetivo del presente estudio fue purificar parcialmente y determinar la actividad proteolitica a diferente pH de proteasas de C. carpio capturadas en la laguna contaminada de Zumpango (Mexico), que determinarian una posible adaptacion de los organismos a este medio en el que se desarrollan, y visualizar un posible uso de estas enzimas en algunas industrias.

MATERIALES Y METODOS

Reactivos: Los siguientes reactivos se obtuvieron de Sigma Chemicals (San Luis, Misuri, Estados Unidos): caseina, hemoglobina, albumina serica bovina y sulfato de amonio; los marcadores de proteinas de alto peso molecular se compraron a Bio-Rad (Richmond, California, Estados Unidos). Todos los otros reactivos empleados fueron de grado analitico.

Captura de los especimenes y preparacion de muestras: Se capturaron tres carpas (Cyprinus carpio) de 32.2 cm de longitud (Desviacion estandar, SD = 2.3 cm, n = 3) y 1 kg de peso (SD = 0.1 kg, n = 3) durante marzo 2013. La temperatura promedio fue de 25.6[grados]C, en diferentes zonas hacia el sur de la laguna de Zumpango (19[grados]47'25" N-99[grados]7'51" W), a una profundidad maxima de 1 m. Las carpas fueron sacrificadas por ahogamiento fuera del agua en hielo, e inmediatamente transportadas en hielo por 2 h, se diseccionaron muestras del musculo dorsal del tronco (de los laterales o filetes) y se conservaron a -25[grados]C hasta su utilizacion en el mismo ano de captura de los organismos.

Obtencion de extracto proteolitico crudo: Se homogeneizaron 60 g de musculo dorsal de carpa con 120 mL de amortiguador de fosfatos 20 mM, pH 7. El homogeneizado se centrifugo a 10 000 xg por 30 min, a 4[grados]C (Hemandez-Samano et al., 2015). Se separo el sobrenadante para los analisis de actividad proteolitica.

Obtencion de fracciones proteoliticas: Las proteinas del extracto crudo obtenido se precipitaron con sulfato de amonio [[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]] saturado a 20%, 50% y 80%. Se saturo el extracto proteolitico crudo con las siguientes cantidades de [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]: 113 g para saturar a 20%, 188 g para 50%, y 210 g para 80% (Scopes, 1994). Esta adicion se llevo a cabo en forma gradual hasta disolverse, dejandose en agitacion lenta por 12 h a 4[grados]C. Posteriormente, las fracciones obtenidas se centrifugaron a 10 000 xg por 20 min a 4[grados]C. El precipitado obtenido de cada fraccion se disolvio en amortiguador de fosfatos 20 mM, pH 7 (1:2, precipitado:amortiguador) y se dializo contra agua desionizada durante 48 h a 4 [grados]C, con recambios de agua cada 8 h. El analisis de actividad proteolitica se llevo a cabo con las fracciones obtenidas.

Obtencion de fracciones parcialmente purificadas: Las fracciones obtenidas con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] saturado a 50% y 80% fueron seleccionadas debido a su alta actividad proteolitica y se ultrafiltraron en tubos Amicon Ultra-15 con membranas de corte molecular (MWC) de 100 kDa Ultracel-100 (Millipore, Cork, Irlanda), centrifugando a 10 000 xg por 30 min a 4[grados]C. Las fracciones parcialmente purificadas (subfracciones con peso molecular mayor y menor a 100 kDa) fueron utilizadas para los analisis de actividad proteolitica.

Determinacion de concentracion de proteina: La cantidad de proteina en el extracto proteolitico crudo y las fracciones obtenidas, se determino por el metodo colorimetrico de biuret (Robinson & Hogden, 1940). Un mililitro del extracto proteolitico o fracciones parcialmente purificadas se mezclo con 3 mL de reactivo de biuret y se dejo reaccionar por 20 min en oscuridad. Posteriormente, se midio la absorbancia a 540 nm y se calculo la concentracion de proteina utilizando una curva estandar de albumina serica bovina obtenida con el mismo metodo (Robinson & Hogden, 1940).

Analisis de actividad proteolitica a diferente pH: Se determino la actividad proteolitica a diferente valor de pH, de pH 2 hasta pH 10. La actividad proteolitica a pH de 2 a 5 se determino mediante hidrolisis de hemoglobina al 1% (p/v) en solucion de acido borico 0.025 M, acido fosforico 0.025 M, y acido acetico 0.25 M, mientras que la actividad proteolitica a pH de 6 a 10 se determino mediante hidrolisis de caseina al 1% (p/v) en amortiguador de fosfatos 20 mM, pH 7. Para la reaccion enzimatica se colocaron 250 [micron]L de extracto proteolitico crudo o fracciones parcialmente purificadas y 1 mL de sustrato (caseina para ensayos a pH 2-5 y hemoglobina para ensayos a pH 6-10) al pH correspondiente, la mezcla se incubo por 15 min a 37[grados]C; la reaccion se detuvo con 0.5 mL de acido tricloroacetico al 25% (p/v). Las muestras fueron centrifugadas a 10 000 xg por 10 min y se midio la absorbancia del sobrenadante a 280 nm. Los resultados se reportaron como actividad especifica (U/mg proteina) utilizando los valores de concentracion de proteina obtenidos anteriormente. Una unidad de actividad proteolitica (U) se definio como la cantidad de enzima necesaria para cambiar la absorbancia 0.001 unidad/min a 280 nm en las condiciones experimentales definidas, por lo tanto: U = ([Abs.sub.280nm])*(factor dilucion) / (0.001)*(tiempo de reaccion en minutos) (Hernandez-Samano et al., 2015).

Analisis electroforetico: La presencia de proteinas en los extractos proteoliticos se analizo por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) de acuerdo al metodo reportado por Laemmli (1970). Se utilizaron geles de separacion de poliacrilamida al 10-12% y geles de concentracion al 4-5%, llevandose a cabo en celdas de electroforesis Mini-Protean II de Bio-Rad (Hercules, California, Estados Unidos). Las proteinas del extracto proteolitico o fracciones parcialmente purificadas se desnaturalizaron mediante ebullicion por 1 min. Se aplicaron 5 mg/mL de la muestra desnaturalizada y un marcador de peso molecular de 200 a 45 kDa [miosina (200 kDa), [beta]-galactosidasa (116.2 kDa), fosforilasa b (97.4 kDa), albumina serica bovina (66.2 kDa), y ovoalbumina (45 kDa)] (Bio-Rad). El analisis se llevo a cabo a voltaje constante de 150 V, 30 mA, y 4[grados]C. Los geles se tineron con azul de Coomasie R-250 al 0.1% (p/v) en una solucion 40% (v/v) metanol y 10% (v/v) acido acetico. El analisis de imagenes se llevo a cabo con el sistema de documentacion Gel-Doc 2000 (Bio-Rad) y el software Quantity One (version 4).

Los resultados se sometieron a analisis de varianza (ANOVA) y comparacion multiple de medias por la prueba de Tukey, y se empleo el paquete estadistico SPSS para Windows (Version 15). El numero de muestras fue de 3 (n = 3). Todos los analisis se llevaron a cabo por triplicado reportandose los valores medios. El nivel de significancia fue P < 0.05.

RESULTADOS

La concentracion de proteina del extracto crudo obtenido del musculo dorsal de C. carpio fue de 15.8 mg/mL (Cuadro 1), y la actividad proteolitica maxima (p < 0.001) se obtuvo a pH 2, 5, y 7 con valores de actividad de 19.7-20.3 U/mg (Fig. 1).

La fraccion obtenida por precipitacion con sulfato de amonio saturado a 20% presento una actividad proteolitica optima (p < 0.001) a pH 5 (2.8 U/mg) y a pH 6 (2.2 U/mg) (Fig. 1); mientras que la fraccion saturada a 50% tuvo una actividad proteolitica maxima (p < 0.001) a pH 6 (4.3 U/mg) y a pH 3-4 (3.6-3.7 U / mg) (Fig. 1). La fraccion saturada a 80% tuvo una concentracion de proteina de 11.9 mg/mL (Cuadro 1) y actividad maxima (p < 0.001) a pH 3 y pH 10 con valores de actividad de 10.8 y 10.6 U/mg, respectivamente (Fig. 1).

La fraccion proteolitica obtenida con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] saturado a 80% tuvo la mayor actividad proteolitica en el intervalo de pH 3-10, con actividad especifica de 5.1 a 10.8 U/mg (Fig. 1), comparado con la actividad proteolitica de las otras fracciones estudiadas, pero menor a la actividad proteolitica del extracto crudo.

La actividad proteolitica de las subfracciones menores a 100 kDa obtenidas por ultrafiltracion a partir de las fracciones precipitadas con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] saturado a 50% y 80% tuvieron maximos a pH 6-10 y pH 8-10, respectivamente (Fig. 2). La subfraccion menor a 100 kDa de la fraccion precipitada con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] saturado a 80% tuvo la mayor actividad proteolitica, incluidas todas las subfracciones y el extracto crudo; esta actividad fue a pH 3-10 (23.9-43.7 U/mg) (Fig. 2), y actividad optima (p < 0.001) a pH 8-10 (37.3 - 43.7 U/mg), con una concentracion de proteina de 1 mg/mL, un factor de purificacion de 3 y 19.1% de recuperacion (Cuadro 1).

El analisis electroforetico (SDS-PAGE) del extracto proteolitico crudo identifico 13 proteinas entre 9.8-104.8 kDa, de las cuales las proteinas de 29.5 y 35.6 kDa se encontraron en mayor concentracion (Fig. 3). De forma similar al extracto proteolitico crudo, las tres fracciones precipitadas con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] presentaron mayor concentracion de las proteinas de 31-33 y 39-41 kDa (Fig. 3). Sin embargo, la fraccion precipitada con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] saturado a 50% tuvo alta concentracion de proteinas de 91.2 y 142.9 kDa. Ademas, se observo que proteinas de 10.7 kDa presentes en el extracto proteolitico crudo no precipitaron con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] saturado a 20%, mientras que las proteinas de 9.8 kDa del extracto crudo no precipitaron a 20% y 50% de saturacion.

DISCUSION

Las enzimas proteoliticas o proteasas de C. carpio han sido caracterizadas por diferentes autores debido a que es una especie de importancia comercial (Haard & Simpson, 2000). Se han reportado estudios proteoliticos en carpa donde se determinaron optimos de actividad proteolitica a pH 2.7-3.7 para aspartil proteasas del musculo (Goldman-Levkovitz, Rimon, & Rimon, 1995), a pH 2.5 para catepsinas D (Liu, Wang, & Zhang, 2008), y actividad proteolitica maxima a pH de 5.5 a 6.5 para cistein proteasas del hepatopancreas (Aranishi, Hara, Osatomi, & Ishihara, 1997), que concuerdan con lo obtenido en este estudio para proteasas con actividad a pH acido. Ademas, la actividad proteolitica a pH ligeramente basico (pH 8) coincidio con lo reportado por Osatomi, Sasai, Cao, Hara y Ishihara (1997) quienes encontraron serin proteasas del musculo de C. carpio con actividad optima a pH 8. Sin embargo, los extractos estudiados presentaron actividad proteolitica a pH mas alcalino (pH 9-10) difiriendo con la bibliografia para proteasas de C. carpio, donde se reporto un decremento significativo de la actividad proteolitica a partir de pH 6.5-7 (Goldman-Levkovitz et al., 1995; Aranishi et al., 1997). No es de nuestro conocimiento que se haya reportado alta actividad proteolitica de las proteasas de carpa comun a pH mayor a ocho, por lo que en el presente estudio se sugirio una adaptacion de las proteasas de C. carpio al alto pH alcalino del agua contaminada de la laguna de Zumpango. De acuerdo con estudios realizados en este cuerpo de agua por el Comite de Sanidad Acuicola del Estado de Mexico A.C. se detectaron niveles de riesgo de pH, determinando un pH de 9.7 (IMTA, 2012); el intervalo normal de pH del agua es de 6.5 a 8.4, valores de pH fuera de este intervalo son una advertencia de que la calidad del agua es anormal. Regularmente, el pH es una medida de rutina en la evaluacion de la calidad del agua (Pescod, 1992). Sin embargo, y a pesar del grado de contaminacion del agua, en la actualidad existen proyectos de recuperacion de la laguna de Zumpango para recreacion y pesca (IMTA, 2012). Por otra parte, existen diversos estudios acerca de proteasas adaptadas a pH alcalino (Siddiqui & Torsten, 2008), ademas se ha demostrado que algunas proteasas acuaticas tienen caracteristicas especificas como actividad catalitica significativa y estabilidad a pH alcalino, entre otras (Haard & Simpson, 2000).

Las proteinas identificadas por SDS-PAGE coincidieron con lo reportado para serin proteasas de 30 kDa (Goldman-Levkovitz et al., 1995) y aspartil proteasas de 36 kDa (Osatomi et al., 1997), asi mismo fue similar a lo encontrado para cistein proteasas (catepsinas) de C. carpio descritas como 2 bandas de 23-26 y 27-30 kDa (Aranishi et al., 1997). Por lo tanto, se sugirio la posible predominancia de serin y aspartil proteasas en el musculo dorsal de los especimenes de C. carpio de la laguna de Zumpango y especificamente, serin proteasas con alta actividad a pH alcalino, concordando con el ensayo de actividad proteolitica. Las proteasas con alta actividad a pH basico destacan por su importancia en la industria, en acuicultura (Cordova-Murueta, Navarrete del Toro, & Garcia-Carreno, 2016), e incluso para el tratamiento de aguas residuales (Facchin et al., 2013). Sobre esta ultima aplicacion, se ha reportado que las proteinas son de los principales contaminantes organicos en el agua residual, ademas de polisacaridos y lipidos, por lo que una propuesta es el uso de enzimas proteoliticas exogenas para hidrolizar dichas proteinas contaminantes a unidades mas pequenas. Proteasas microbianas se han utilizado en el tratamiento de residuos de varias industrias de elaboracion de alimentos para solubilizar los residuos proteicos y reducir la demanda biologica de oxigeno de los sistemas acuaticos (Gupta, Beg, & Lorenz, 2002). Una caracteristica importante, es que las enzimas para el tratamiento de aguas residuales no requieren de una purificacion alta y por lo tanto presentan un bajo costo de produccion (Facchin et al., 2013).

Se obtuvo una fraccion proteolitica parcialmente purificada a partir del musculo dorsal de C. carpio con maxima actividad proteolitica a pH alcalino, lo que hasta el momento no se ha reportado en esta especie acuatica, por lo tanto, nosotros sugerimos que la presencia de dichas proteasas alcalinas esta relacionada con la adaptacion de la carpa al agua contaminada de la laguna de Zumpango. Aunque estos peces son inadecuados para el consumo humano, pueden ser empleados como materia prima para la produccion de proteasas destinadas a varias industrias, incluido el tratamiento de aguas residuales.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia de Mexico (CONACYT) por una beca de posgrado otorgada a la primera autora en la Universidad Autonoma Metropolitana-Iztapalapa.

REFERENCIAS

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Arisai C. Hemandez-Samano (1), Xochitl Guzman-Garcia (1), Raquel Garcia-Barrientos (2) & Isabel Guerrero-Legarreta (1) *

(1.) Universidad Autonoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa, San Rafael Atlixco 186, Ciudad de Mexico, 09340, Mexico; arizai5@hotmail.com, xochitlguga@gmail.com, isabel_guerrero_legarreta@yahoo.com

(2.) Universidad Politecnica de Tlaxcala, Avenida Universidad Politecnica 1, Tlaxcala, 90180, Mexico; raquelgaba@hotmail.com

Recibido 24-V-2016. Corregido 10-I-2017. Aceptado 26-I-2017.

Leyenda: Fig. 1. Actividad proteolitica a diferente pH (a 37[grados]C) del extracto proteolitico crudo y de fracciones obtenidas por fraccionamiento con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] (20%, 50% y 80% de saturacion) a partir del musculo dorsal de C. carpio. Los resultados son valores medios de tres determinaciones llevadas a cabo por triplicado (n = 3). Fig. 1. Proteolytic activity versus pH (at 37[grados]C) of crude extracts and fractions obtained with 20%, 50% and 80% -saturated [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] from C. carpio dorsal muscle. The data represent mean values.

Leyenda: Fig. 2. Actividad proteolitica a diferente pH (37[grados]C) del extracto proteolitico crudo y de fracciones parcialmente purificadas (subfracciones obtenidas por ultrafiltracion con membranas de 100 kDa a partir de fracciones precipitadas con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] saturado a 50% y 80%) del musculo dorsal de C. carpio. Los resultados son valores medios de tres determinaciones llevadas a cabo por triplicado (n = 3). Fig. 2. Proteolytic activity at different pH (37[grados]C) of crude extract and partially purified from C. carpio dorsal muscle fractions (subfractions obtained by 20%, 50% and 80%-saturated [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] fractions ultrafiltered through 100 kDa membranes). The data represent mean values.

Leyenda: Fig. 3. Perfil electroforetico (SDS-PAGE) del extracto proteolitico crudo y de fracciones obtenidas por precipitacion con [(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4] a partir del musculo dorsal de C. carpio. 1. Marcador estandar molecular; 2. Fraccion precipitada con 20% de saturacion; 3. Fraccion precipitada con 50% de saturacion; 4. Fraccion precipitada con 80% de saturacion; 5. Extracto proteolitico crudo. Fig. 3. SDS-PAGE of crude proteolytic extract and 20%, 50% and 80%-saturated (N[H.sub.4])S[O.sub.4] fractions from C. carpio dorsal muscle. 1. Molecular weight marker; 2. 20%-saturated fraction; 3. 50%-saturated fraction; 4. 80%-saturated fraction; 5. Crude extract.
CUADRO 1
Purificacion parcial de proteasas del musculo dorsal de C. carpio

TABLE 1 Purification of proteases obtained from C. carpio
dorsal muscle

Paso de purificacion             Concentracion   Actividad
                                    (mg/mL)      (U), pH 9

Extracto crudo                       15.8          57.9

Fraccion precipitada con             11.9          29.3
[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]
saturado a 80%

Subfraccion < 100 kDa de la           1.0          11.1
fraccion precipitada con
[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]
saturado a 80%

Paso de purificacion             Actividad    Porcentaje de
                                 especifica   recuperacion
                                  (U/mg),          (%)
                                    pH 9

Extracto crudo                      14.6          100.0

Fraccion precipitada con            9.9           50.6
[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]
saturado a 80%

Subfraccion < 100 kDa de la         43.7          19.1
fraccion precipitada con
[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]
saturado a 80%

Paso de purificacion              Factor de
                                 purificacion

Extracto crudo                       1.0

Fraccion precipitada con             0.7
[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]
saturado a 80%

Subfraccion < 100 kDa de la          3.0
fraccion precipitada con
[(N[H.sub.4]).sub.2]S[O.sub.4]
saturado a 80%
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Author:Hernandez-Samano, Arisai C.; Guzman-Garcia, Xochitl; Garcia-Barrientos, Raquel; Guerrero-Legarreta,
Publication:Revista de Biologia Tropical
Date:Jun 1, 2017
Words:4505
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