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Actividad antifungica del quitosano y aceites esenciales sobre Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill., agente causal de la pudricion blanda del tomate.

Antifungal activity of chitosan and essential oils on Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill causal agent of soft rot of tomato

Introduccion

Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill causa la pudricion blanda en frutas y hortalizas, lo que ocasiona perdidas economicas importantes durante la fase de poscosecha, debido a que este hongo tiene un crecimiento rapido y es de facil transmision por heridas producidas durante la manipulacion de los frutos (Northover y Zhou, 2002; Velazquez-del Valle et al., 2008). La produccion y exportacion de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es muy importante en Mexico, al igual que en otros paises de America Latina como Brasil y Chile. No obstante, se han reportado perdidas significativas ocasionadas por Rhizopus stolonifer (Hahn, 2006). Para controlar las pudriciones se han utilizado fungicidas quimicos sinteticos, con los riesgos que implican su uso, aunque en algunos casos se ha buscado reducir los danos que ocasionan (Kanetis et al., 2007). En particular, se ha reportado que el fungicida sintetico dicloran es muy activo en contra de Rhizopus stolonifer (Adaskaveg et al., 2002), sin embargo, este fungicida puede tener efectos carcinogenicos en el ser humano. Por ello es necesario buscar alternativas naturales que controlen las pudriciones y que no afecten al ambiente y a la salud humana, entre las alternativas se destaca el uso del quitosano y de aceites esenciales (Tripathi y Dubey, 2004).

El quitosano es un derivado desacetilado de la quitina, polimero constituido fundamentalmente por unidades de [beta]- (1, 4)-2 acetamido-2-desoxi-D-glucosa y [beta]- (1, 4)-amino-2-desoxi-D-glucosa, que tiene propiedades policationicas y potencial para controlar pudriciones poscosecha (Bautista-Banos et al., 2006). Este polimero se ha empleado como pelicula para cubrir y conservar algunos frutos (fresas, tomate, longan, etc.), y se ha conseguido controlar pudriciones y mejorar la calidad de los mismos (Jiang y Li, 2001; Devlieghere et al., 2004; Hernandez-Munoz et al., 2008).

Los aceites esenciales son liquidos oleosos, aromaticos y volatiles constituidos por una mezcla compleja de compuestos, principalmente terpenos y alcoholes fenolicos que han sido reportados como inhibidores de hongos poscosecha (Botrytis cinerea y Monilinia fructicola) en condiciones in vitro (Tripathi y Dubey, 2004). Recientemente se informo que la actividad antimicrobiana de las peliculas de quitosano se mejora cuando se les incorpora aceites esenciales de clavo y tomillo ((Hosseini et al., 2008) aunque no se ha reportado la eficacia in situ de estos aceites ni el potencial que pudieran tener las mezclas de los aceites con quitosano para controlar mas eficientemente la pudricion blanda en frutos. El objetivo de este trabajo fue determinar in vitro e in situ la actividad antifungica del quitosano, de los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo aplicados de manera individual y mezclados en comparacion con dicloran sobre Rhizopus stolonifer.

Materiales y metodos

Material biologico. Se empleo la cepa R3 de Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill aislada mediante camara humeda de frutos de tomate (Licopersicon esculentum Mill.) "Saladette" provenientes de Yautepec, en el estado de Morelos, en Mexico (Hernandez-Lauzardo et al., 2006). La cepa R3 de Rhizopus stolonifer pertenece al Laboratorio de fitopatologia del Centro de desarrollo de productos bioticos del Instituto Politecnico Nacional y se mantiene en refrigeracion con resiembras periodicas.

En los ensayos in situ se utilizaron frutos de tomate "Saladette" de tamano uniforme, estado rojo maduro y sin lesiones cosechados en Tlayacapan, en el estado de Morelos, en Mexico.

Soluciones de quitosano, aceites esenciales y dicloran. Se preparo una solucion concentrada de quitosano (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) de bajo peso molecular (20 mg [mL.sup.-1]). Se pesaron 2 g de quitosano y se disolvieron en 2 ml de acido acetico glacial y 50 ml con agua destilada, se agito durante 24 h y se ajusto el pH a 5,6 con NaOH 0.1 N (El Ghaouth et al., 1991), la solucion se aforo a 100 ml con agua destilada y se esterilizo por autoclave a 121[grados]C durante 15 min. Se tomaron las alicuotas correspondientes para adicionarse a los recipientes que contenian los medios de cultivo esteriles de Agar Papa Dextrosa (PDA, Bioxon) y Caldo de Papa Dextrosa (PDB, Bioxon) y obtener las concentraciones de 2 y 10 mg [mL.sup.-1].

Se emplearon los aceites esenciales comerciales de clavo (Syzygium aromaticum L.), canela (Cinnamomum zeylanicum Brine) y tomillo (Thymus vulgaris L.) (Compania de Aceites y Esencias S. A. de C. V., Mexico D. F., Mexico). Los aceites se pesaron, se diluyeron y dispersaron en agua destilada esteril y contenian tween 80 (0,06 mg [mL.sup.-1]), se agregaron a los recipientes que contenian el medio de cultivo las cantidades necesarias para tener las concentraciones finales de 0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1] (Barrera-Necha, et al., 2009).

Se utilizo el fungicida agricola comercial dicloran, 2,6-dicloro-4-nitroanilina (Compania Gowan de Mexico), el cual se diluyo en agua destilada esteril para preparar una solucion a concentracion de 10 mg [mL.sup.-1] y se adiciono a los recipientes que contenian los medios de cultivo para obtener una concentracion final de 1 mg [mL.sup.-1].

Evaluaciones in vitro. Los tratamientos individuales consistieron en: cajas de Petri con PDA (testigo), cajas de Petri con PDA y quitosano en concentraciones de 2 y 10 mg [mL.sup.-1], cajas con cada uno de los tres aceites esenciales en concentraciones de 0.1 y 0.3 mg [mL.sup.-1] y dicloran a 1 mg [mL.sup.-1], tratamiento usado como control positivo. Los tratamientos combinados fueron: cajas con PDA con quitosano a 2 mg [mL.sup.-1] y cada uno de los tres aceites a 0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1], cajas con el polimero a 10 mg [mL.sup.-1] y los tres aceites esenciales a 0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1]. Fragmentos de 5 mm de un cultivo de Rhizopus stolonifer en condiciones de crecimiento de 25 [+ o -] 2[grados]C durante 72 h en PDA, fueron utilizados como inoculo. Los ensayos se incubaron a 25 [+ o -] 2[grados]C durante 48 h. Se realizaron 6 repeticiones por tratamiento y el experimento se repitio tres veces.

Crecimiento micelial. Cuando el tratamiento testigo cubrio totalmente la caja de Petri (48 h), se midio el diametro de las colonias con un Vernier digital (Cienceware). Con los datos obtenidos se calculo el indice antifungico para cada tratamiento (Guo et al., 2006).

IA = 1 - (Da/Db) x 100

Da: diametro de crecimiento de los tratamientos evaluados.

Db: diametro de crecimiento del testigo.

Esporulacion. La esporulacion de Rhizopus stolonifer en los diferentes tratamientos se evaluo a las 72 h de incubacion. Se adicionaron 10 ml de agua destilada esteril, con una varilla de vidrio se raspo la superficie de las cajas para arrastrar las esporas y luego estas fueron transferidas a un frasco. Para inhibir la germinacion a cada suspension de esporas se le agregaron siete gotas de lactofenol, se agitaron y se tomaron 20 [micron]l de las mismas y se colocaron en una camara de Neubauer para cuantificar las esporas en un microscopio optico (40X) (Nikon, Alphaphot-2YS2). Los datos se reportaron en numero de esporas [mL.sup.-1] (Hernandez-Lauzardo et al., 2008).

Germinacion de las esporas. Alicuotas de 50 [micron]l con los tratamientos descritos previamente se colocaron en tubos Eppendorf. Se incubaron durante 12 h a 25 [grados]C. Se tomaron 10 [micron]l de cada tubo Eppendorf, se colocaron en un portaobjetos, se les agrego una gota de lactofenol y se cubrieron con un cubreobjetos. El conteo de la germinacion de 100 esporas por muestra se realizo en un microscopio optico (40X) con un contador manual. Las esporas se consideraron germinadas cuando el largo del tubo germinal fue igual o excedio la longitud de la espora (El Ghaouth et al., 1992).

Ensayo antifungico in situ. Se emplearon frutos de tomate de la variedad "Saladette", estado rojo maduro, sin danos mecanicos o sintomas de enfermedad. Se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min, se lavaron tres veces con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente (25 [+ o -] 2[grados]C) sobre papel absorbente. Se establecieron los siguientes tratamientos: testigo negativo (agua destilada esteril sin inoculacion de esporas), testigo positivo (agua destilada esteril), quitosano a 10 mg [mL.sup.-1], los aceites esenciales a 0,3 mg [mL.sup.-1], las combinaciones de quitosano a 10 mg [mL.sup.-1] con cada aceite esencial a 0,3 mg [mL.sup.-1] y el dicloran a 1 mg [mL.sup.-1]. En condiciones de esterilidad a cada fruto se le realizo con un bisturi, heridas de 2 mm de profundidad por 2 mm de ancho. Posteriormente cada fruto se sumergio totalmente durante 5 segundos en un vaso de precipitado que contenia cada tratamiento. Luego se colocaron en la campana de flujo, se secaron durante 5 minutos y se asperjaron con la solucion de esporas de Rhizopus stolonifer mencionada anteriormente (excepto el testigo negativo). Los frutos tratados se incubaron en charolas de plastico organizadas horizontal y verticalmente para que los tratamientos tuvieran condiciones similares de iluminacion, y temperatura (25 [+ o -] 2[grados]C) durante las 96 h del ensayo. Se evaluo el porcentaje de infeccion y el indice de severidad.

Porcentaje de infeccion e indice de severidad. Al termino del periodo de almacenamiento, se cuantificaron los frutos que presentaban sintomas de pudricion blanda en cada tratamiento, el numero total de frutos se considero como el 100%. El indice de severidad se determino sobre la superficie de los frutos con grados de dano segun una escala establecida con las siguientes caracteristicas; 0 = 0; 1 = 1-5%; 2 = 6-15%; 3 = 16-45%; 4 = 46-75% y 5 = 76-100% de dano visual por fruto y se calculo el indice de severidad mediante la ecuacion descrita por Perez et al., (1995): Indice de severidad = Xi(0) + Xi(1) + Xi(2) + Xi(3) + Xi(4) + Xi(5) / N donde Xi = numero de frutos enfermos por cada grado de dano; 0, 1, 2, 3, 4, 5 = grado de dano en la escala utilizada y N = numero total de frutos por unidad experimental.

Perdida de peso. Los frutos de cada tratamiento se pesaron individualmente al inicio y al final del experimento. La perdida de peso se evaluo a partir de la siguiente formula: perdida de peso = (peso inicial - peso final) x 100.

Analisis estadisticos. Los experimentos se desarrollaron mediante un diseno experimental completamente al azar en arreglo simple. En los ensayos in vitro los datos obtenidos de crecimiento micelial y esporulacion se analizaron mediante un analisis de varianza (ANOVA) de una via y la comparacion de medias se hizo con la prueba de Tukey utilizando el programa Sigma Stat 3.5. Los datos obtenidos en los ensayos in situ se analizaron de acuerdo a un ANOVA con el programa Sigma Stat 3.5.

Resultados y discusion

Efecto de los tratamientos sobre el crecimiento micelial de Rhizopus stolonifer. En la tabla 1 se muestran los resultados del crecimiento micelial de Rhizopus stolonifer y del indice antifungico obtenido con las dos concentraciones de quitosano (2 y 10 mg [mL.sup.-1]) y los aceites esenciales de canela, clavo o tomillo (0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1]) y con dicloran (1 mg [mL.sup.-1]). El crecimiento micelial se redujo significativamente en comparacion con el testigo en todos los tratamientos probados excepto en el tratamiento con aceite de canela a 0,1 mg [mL.sup.-1]. Se observo la inhibicion total del crecimiento micelial con los aceites de canela, clavo y tomillo a 0,3 mg [mL.sup.-1] y con el dicloran, resultados que coinciden con los reportados por Barrera-Necha et al., (2009), quienes utilizaron los aceites esenciales de canela, clavo y tomillo (0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1]) y observaron una total inhibicion del crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli. Tambien se ha reportado una elevada actividad del fungicida dicloran en contra de Rhizopus stolonifer (Adaskaveg et al., 2002). De las dos concentraciones de quitosano evaluadas, la de 10 mg [mL.sup.-1] mostro mayor indice antifungico (77,4 %). Los resultados obtenidos con el quitosano son acordes con los reportados previamente donde se ha senalado que a mayores concentraciones de este polimero (0,5 a 2 mg [mL.sup.-1]) se observan mayores inhibiciones en el crecimiento micelial de Rhizopus stolonifer (Hernandez-Lauzardo et al., 2007). En la tabla 2 se presentan los resultados del crecimiento micelial y el indice antifungico obtenidos con las dos concentraciones de quitosano mezcladas con los aceites esenciales de canela, clavo o tomillo. El crecimiento de Rhizopus stolonifer se redujo significativamente en todos los tratamientos probados, observandose indices antifungicos del 100% en la mezcla de quitosano (10 mg [mL.sup.-1]) con tomillo (0,1 mg [mL.sup.-1]) y en todas las mezclas de quitosano (2 y 10 mg [mL.sup.-1]) con los tres aceites esenciales a 0,3 mg [mL.sup.-1]. En general se observo un mayor efecto inhibitorio en el crecimiento micelial de Rhizopus stolonifer cuando se mezclo el quitosano con los aceites esenciales que cuando se utilizo este polimero de manera individual.

Efecto sobre la esporulacion y germinacion de las esporas. La esporulacion fue cuantificada unicamente en los tratamientos con quitosano a 10 mg [mL.sup.-1] y con aceite de tomillo a 0,1 mg [mL.sup.-1], en los demas no hubo crecimiento micelial (tabla 3). Los resultados obtenidos en este trabajo con respecto al quitosano son similares a los obtenidos por Hernandez-Lauzardo et al., (2008) donde se reporto una tendencia similar que refleja que las mayores concentraciones de quitosano de bajo peso molecular generaron mayores reducciones en la produccion de esporas de Rhizopus stolonifer. En otro estudio se encontro que el quitosano a concentraciones menores del 1% afecta la esporulacion de Botritis cinerea y Penicillium expansum al punto de disminuir considerablemente la cantidad de conidios (Liu et al., 2007). Por otra parte, un estudio reciente demostro que el aceite esencial de mandarina tiene la capacidad de inhibir la esporulacion de los hongos fitopatogenos Alternaria alternata, Rhizoctonia solani, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum y Helminthosporium oryzae (Chutia et al., 2009), sin embargo, no se encontraron reportes sobre posibles efectos de aceites esenciales sobre la esporulacion de Rhizopus stolonifer. La germinacion de las esporas de Rhizopus stolonifer (tabla 3) se inhibio significativamente en todos los tratamientos probados. Se observo una total inhibicion de la germinacion en los tratamientos con los tres aceites esenciales a 0,3 mg [mL.sup.-1] y con el dicloran a 1 mg [mL.sup.-1]. La afectacion inducida por el quitosano sobre la germinacion de las esporas de Rhizopus stolonifer ha sido reportada previamente a diferentes concentraciones que oscilan desde 1 hasta 2 mg [mL.sup.-1] (Hernandez-Lauzardo et al., 2007 y 2008) y presentan patrones semejantes a los reportados en este trabajo, donde una mayor concentracion del polimero produce una mayor inhibicion en la germinacion de las esporas. Por otro lado, acorde con los resultados obtenidos en este trabajo, Barrera-Necha et al., (2008) reportaron que los aceites esenciales de clavo y canela (250 Mg [mL.sup.-1]) inhibieron en un 98% la germinacion de los conidios de Colletotrichum gloeosporioides, sin embargo, el aceite de tomillo no afecto la germinacion de los conidios de este hongo.

En la tabla 4 se presentan los resultados de la esporulacion y germinacion de las esporas de Rhizopus stolonifer tratadas con mezclas de quitosano y los tres aceites esenciales. Todos los tratamientos inhibieron significativamente la esporulacion con respecto al testigo. Las mezclas de quitosano (2 mg [mL.sup.-1]) con los tres aceites a 0,3 mg [mL.sup.-1] y las mezclas de quitosano (10 mg [mL.sup.-1]) con los tres aceites a 0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1] inhibieron totalmente la produccion de esporas. Por otro lado, la germinacion de las esporas se inhibio de manera significativa en todas las mezclas probadas, observandose una inhibicion absoluta en los tratamientos con cualquiera de los tres aceites probados a la concentracion de 0,3 mg [mL.sup.-1] mezclados con quitosano (2 y 10 mg [mL.sup.-1]). Este trabajo constituye el primer reporte del efecto de combinaciones de quitosano con aceites esenciales sobre la esporulacion y germinacion de esporas de Rhizopus stolonifer.

Evaluacion de la aplicacion de quitosano y de aceites esenciales en frutos de tomate. El estudio in situ se realizo utilizando los tratamientos que mostraron mayor efectividad para inhibir el desarrollo in vitro de Rhizopus stolonifer (quitosano a 10 mg [mL.sup.-1], los aceites esenciales a 0,3 mg [mL.sup.-1], las mezclas de quitosano a 10 mg [mL.sup.-1] con cada aceite esencial a 0,3 mg [mL.sup.-1] y el dicloran a 1 mg [mL.sup.-1]). En la tabla 5 se muestran los porcentajes de infeccion, indices de severidad y perdidas de peso inducidas por Rhizopus stolonifer en frutos de tomate. El unico tratamiento que logro inhibir significativamente la infeccion de Rhizopus stolonifer en los frutos de tomate fue el quitosano a 10 mg [mL.sup.-1], los frutos presentaron solamente un 23,3% de infeccion, mientras que en el testigo sin tratamiento se observo un 80%, dato que es consistente con los resultados reportados recientemente por Badawy y Rabea (2009) quienes demostraron que el quitosano aplicado en concentraciones de 2 a 4 mg [mL.sup.-1] puede controlar infecciones de Botritis cinerea en frutos de tomate. Los aceites esenciales no lograron disminuir significativamente el porcentaje de infeccion de los frutos, resultado que podria atribuirse a la naturaleza quimica de los aceites que contienen una amplia gama de compuestos volatiles, los cuales podrian disiparse de la superficie de los frutos y afectar la capacidad de inhibir la infeccion de Rhizopus stolonifer. (Guynot et al., 2003). Adicionalmente existen diversos factores tales como el pH y el contenido de azucares y proteinas que pueden afectar la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales (Gutierrez et al., 2009). A pesar de los reportes previos que destacan la actividad antifungica del dicloran contra Rhizopus stolonifer (Adaskaveg et al., 2002) e inclusive de la capacidad de este quimico para controlar la pudricion blanda en frutos de durazno (De Carvalho et al., 2009), en el presente trabajo el dicloran no logro inhibir significativamente el porcentaje de infeccion, comportamiento que podria atribuirse a caracteristicas intrinsecas de los frutos de tomate utilizados que interferirian con este compuesto.

Con relacion al indice de severidad, se observo que todos los tratamientos redujeron significativamente este parametro con excepcion de los tratamientos individuales con aceites esenciales de clavo y tomillo. El quitosano y el dicloran fueron los unicos tratamientos que inhibieron en un buen porcentaje la perdida de peso de los frutos, por encima de los aceites esenciales individuales y de las mezclas de estos con el quitosano. En investigaciones realizadas con Colletotrichum gloeosporioides en frutos de papaya, de manera analoga a estos resultados, se observo que el tratamiento individual con quitosano controlo la antracnosis en los frutos, sin mejorar este efecto la adicion de extractos vegetales (Bautista-Banos et al., 2003). El quitosano puede presentar interacciones con algunos componentes del agente antimicrobiano adicional. Recientemente se sugirio que el quitosano podria interactuar mediante puentes de hidrogeno con los terpenos de los aceites esenciales afectando la actividad antifungica de las mezclas (Mayachiew et al., 2010).

Conclusiones

El tratamiento individual con quitosano fue el mejor para reducir la infeccion de los frutos de tomate inoculados con Rhizopus stolonifer.

Las mezclas de quitosano con los aceites esenciales de canela, clavo o tomillo no mostraron una mejor actividad antifungica que el quitosano individual en los ensayos in situ.

El tratamiento individual con quitosano representa una alternativa natural para controlar la pudricion blanda en frutos de tomate.

Agradecimientos

Se agradece el apoyo financiero de la Secretaria de investigacion y posgrado del Instituto Politecnico Nacional.

Recibido: agosto 19 de 2010

Aprobado: noviembre 30 de 2011

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Alejandra Maria Alvarado Hernandez, Maestra en Ciencias

Laura Leticia Barrera Necha **, Ana Niurka Hernandez Lauzardo *** y Miguel Gerardo Velazquez del Valle ****

Doctor en Ciencias y Profesor- Investigador. Instituto Politecnico Nacional, Centro de Desarrollo de Productos Bioticos, Carretera Yautepec-Jojutla, Km 6, calle CEPROBI No. 8, Col. San Isidro, Yautepec, Morelos, Mexico CP 62731. Correspondencia: mdelvall@ipn.mx
Tabla 1. Crecimiento micelial e indice antifungico de Rhizopus
stolonifer en presencia de quitosano, aceites esenciales de
canela, clavo o tomillo y con dicloran

Tratamientos         Crecimiento          Indice
(mg [mL.sup.-1])    micelial (mm)    antifungico (%)

Testigo                 78,0 a              0,0
Quitosano 2             47,9 d             38,6
Quitosano 10            17,6 e             77,4
Canela 0,1              74,6 a              4,4
Canela 0,3                 (-)              100
Clavo 0,1               69,7 b             10,6
Clavo 0,3                  (-)              100
Tomillo 0,1             52,1 c             32,4
Tomillo 0,3                (-)              100
Dicloran 1                 (-)              100

(-) = Sin crecimiento. Los valores representan la media de 3 replicas
(n = 6). Las letras indican diferencias estadisticas significativas
(Tukey, P<0,001).

Tabla 2. Crecimiento micelial e indice antifungico de
Rhizopus stolonifer en presencia de quitosano (2 y 10 mg [mL.sup.-1])
mezclado con aceites esenciales de canela, clavo o tomillo
(0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1])

                                                   Indice
       Tratamientos             Crecimiento     antifungico
      (mg [mL.sup.1])          micelial (mm)        (%)

Testigo                            78,0 a              0
Quitosano 2 + Canela 0,1           23,2 b           70,3
Quitosano 2 + Canela 0,3              (-)            100
Quitosano 2 + Clavo 0,1            19,5 b           75,0
Quitosano 2 + Clavo 0,3               (-)            100
Quitosano 2 + Tomillo 0,1          23,7 b           69,7
Quitosano 2 + Tomillo 0,3             (-)            100
Quitosano 10 + Canela 0,1           2,9 d           96,5
Quitosano 10 + Canela 0,3             (-)            100
Quitosano 10 + Clavo 0,1            8,8 c           88,8
Quitosano 10 + Clavo 0,3              (-)            100
Quitosano 10 + Tomillo 0,1            (-)            100
Quitosano 10 + Tomillo 0,3            (-)            100

(-) = Sin crecimiento. Los valores representan la media de 3 replicas
(n = 6). Las letras indican diferencias estadisticas significativas
(Tukey, P<0,001).

Tabla 3. Esporulacion y porcentaje de germinacion de las esporas de
Rhizopus stolonifer en presencia de quitosano (2 y 10 mg [mL.sup.-1),
aceites esenciales de canela, clavo y tomillo (0,1 y 0,3 mg
[mL.sup.-1]) y con dicloran (1 mg [mL.sup.-1])

                    Esporulacion
                    (No. esporas
Tratamientos         [10.sup.4]     Germinacion
(mg mL-1)           [mL.sup.-1])        (%)

Testigo                 300 a          87,5 a
Quitosano 2              29 b          22,0 c
Quitosano 10            3,8 c           0,8 d
Canela 0,1              240 ab         26,0 b
Canela 0,3               (-)            0,0 d
Clavo 0,1              230 ab          34,2 b
Clavo 0,3                (-)            0,0 d
Tomillo 0,1            3,3 c           22,5 c
Tomillo 0,3              (-)            0,0 d
Dicloran 1               (-)            0,0 d

(-) Sin esporulacion. Las letras diferentes en la misma columna indi-
can diferencias estadisticas significativas (Tukey, P<0,001).

Tabla 4. Esporulacion y porcentaje de germinacion de las
esporas de Rhizopus stolonifer en presencia de quitosano (2 y
10 mg [mL.sup.-1]) mezclado con aceites esenciales de canela, clavo
y tomillo (0,1 y 0,3 mg [mL.sup.-1])

                                Esporulacion
                              (No. de esporas
Tratamientos                    x [10.sup.4]     Germinacion
(mg [mL.sup.-1])                [mL.sup.-1])         (%)

Testigo                            300 a           87,5 a
Quitosano 2 + Canela 0,1           0,3 c           21,8 b
Quitosano 2 + Canela 0,3            (-)             0,0 d
Quitosano 2 + Clavo 0,1            2,5 b           21,3 b
Quitosano 2 + Clavo 0,3             (-)             0,0 d
Quitosano 2 + Tomillo 0,1          0,2 c            6,8 c
Quitosano 2 + Tomillo 0,3           (-)             0,0 d
Quitosano 10 + Canela 0,1           (-)             2,0 d
Quitosano 10 + Canela 0,3           (-)             0,0 d
Quitosano 10 + Clavo 0,1            (-)             0,0 d
Quitosano 10 + Clavo 0,3            (-)             0,0 d
Quitosano 10 + Tomillo 0,1          (-)             0,0 d
Quitosano 10 + Tomillo 0,3          (-)             0,0 d

(-) Sin esporulacion. Las letras diferentes en la misma columna indi-
can diferencias estadisticas significativas (Tukey, P<0,001).

Tabla 5. Porcentajes de infeccion, indices de severidad y perdidas de
peso inducidas por Rhizopus stolonifer en frutos de tomate tratados
con quitosano y aceites esenciales, solos y en combinacion.

Tratamientos                 Porcentaje de    Indice de    Perdida de
(mg [mL.sup.-1])             infeccion (%)    severidad     peso (g)
                                  (Y)          (%) (Z)         (Z)

Testigo -                        0,0 a          0,0 a        1,9 abc
Testigo +                       80,0 c          3,5 c        3,6 c
Quitosano 10                    23,3 ab         0,7 ab       1,3 a
Canela 0,3                      43,3 abc        1,1 ab       2,0 abc
Clavo 0,3                       60,0 bc         1,8 bc       2,1 abc
Tomillo 0,3                     53,3 bc         1,8 bc       2,0 abc
Quitosano 10 + Canela 0,3       46,7 abc        1,3 ab       2,3 bc
Quitosano 10 + Clavo 0,3        33,3 abc        1,0 ab       2,2 abc
Quitosano 10 + Tomillo          50,0 bc         1,4 ab       2,1 abc
  0,3
Dicloran 1                     46,7 abc         1,3 ab       1,6 ab

Testigo - : frutos sin tratamiento y sin inoculacion. Testigo +: frutos
sin tratamiento e inoculados. (Y) : los valores representan la media
de 3 replicas (n = 10). (Z) : los valores representan la media de 3
replicas (n = 10). Las letras diferentes en cada columna indican
diferencias estadisticas significativas (Tukey, P<0,050).
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Alvarado Hernandez, Alejandra Maria; Barrera Necha, Laura Leticia; Hernandez Lauzardo, Ana Niurka; V
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2011
Words:5469
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