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ASPECTOS MORFOLOGICOS DE BIOPSIAS MUSCULARES EN EQUINOS CON DEFORMACION DEL BORDE DORSAL DEL CUELLO.

Morphological features of muscle biopsies from equines with cresty neck

INTRODUCCION

En los equinos se describen habitualmente tres amplias regiones cervicales, dorsal, lateral y ventral, asi como en otras tres circunscritas, de las que dos (parotidea y laringea) corresponden a la extremidad cefalica y la tercera a la base del cuello (prescapular); no obstante bajo el punto de vista practico, se alude a menudo a regiones mas concretas, como la braquiocefalica, esternocefalica, retro-auricular, faringea y traqueal [20]. La region dorsal del cuello (RDC) se prolonga desde la region de la nuca hasta las estribaciones del torax y la espalda (Regiones interescapulares y prescapular adyacente). En el caballo (Equus caballus), se hace progresivamente mas extensa a medida que se acerca a la base del cuello, de manera que en el caballo comprende toda la superficie que viene designandose en el exterior como "tablas del cuello", tambien destaca el borde dorsal del cuello que da implantacion a las cerdas del cuello o "crinera", el cual esta determinado por el cordon de la nuca (ligamento cervical). Dicho cordon ligamentoso y los musculos adyacentes constituyen la base anatomica de la region [11, 12, 20]. La RDC es uno de los lugares anatomicos para la deposicion de grasa en el caballo. El acumulo de grasa en esta region se considera como un signo de obesidad en el caballo [15]. Esta representa una caracteristica fisica prominente y asociada al sindrome metabolico de la adquisicion de tejido adiposo en el cuello [3,8]. Las deformaciones del cuello han sido descritas inicialmente como defectos en la cual se han empleado nombres coloquiales [10,11]. Se distingue el cuello recto o piramidal, las deformaciones del borde superior que se puede observar suavemente arqueado (coloquialmente lo denominan cuello de gato o de pichon), asi como el defecto del borde superior del cuello de ser muy grueso/engrosado por el abundante deposito de grasa provisto de una crinera abundante, y por efecto de la debilidad de la region se muestra algo caido en alguno de sus lados (gato o gatillo vencido hacia la derecha o hacia la izquierda), los cambios en la convexidad del borde superior del cuello y que se acentua en su punto de union con la cabeza (coloquialmente denominado cuello de cisne), cuando su borde superior es ligeramente concavo y el inferior convexo (coloquialmente nombrado como cuello al reves o de ciervo) [22]. La deformacion del borde dorsal del cuello (DBDC), es una condicion que tiene gran repercusion clinica y economica [19], que se presenta en caballos de Pura Raza Espanola y en otras razas como la Lusitana. Un reporte preliminar describe la DBDC en burros (Equus africanus asinus), de raza Andaluza [10]. Recientemente, un estudio describe la cresta del cuello como un defecto en caballos de Pura Raza Espanola, que afecta a un 8,89% de la poblacion en todo el mundo, con una heredabilidad moderada de aproximadamente 0, 37%. [21]. Este defecto es inhabilitado y descalificado del libro genealogico de la raza [21]. En relacion al Reglamento de Concursos Morfologicos-Funcionales de Caballos y Yeguas de Pura Raza Espanola Ano, 2013 (Asociacion Nacional de Criadores de Caballo de Pura Raza Espanola) [16]. A continuacion se describen las caracteristicas generales del caballo de Pura Raza Espanola: Eurimetrico mesolineo y de perfil convexo a recto, de conformacion proporcionada, notable armonia y de gran belleza con apreciable dimorfismo sexual. El cuello: debe ser de tamano y longitud medios, ligeramente arqueado y musculado (manos, en las yeguas). Bien insertado en la cabeza y tronco. Crin abundante y sedosa. Este Reglamento recientemente ha sido actualizado en 2016 [17]. A pesar de los avances de investigacion geneticos de esta condicion, son requeridos estudios que permitan comprender del desarrollo de la DBDC (Cresty Neck: CN), en equidos. Los aspectos morfologicos en la DBDC no han sido descritos en su totalidad y la biopsia muscular en dicha region puede jugar un importante papel en el desarrollo de esta condicion en caballos, con miras a establecer un metodo diagnostico predictivo. El objetivo de este estudio fue describir los cambios morfologicos, histologicos e inmunohistoquimicos de biopsias de musculo de equidos con DBDC.

MATERIALES Y METODOS

Poblacion: Fueron estudiados 150 caballos (Eqqus caballus), 90 caballos (78 castrados y 12 enteros) y 60 yeguas, de las razas Pura Raza Espanola (84/150), Hispano Arabe (33/150), Lusitano (19/150), Cruzados (14/150), con edades comprendidas entre 5-15 anos, todos los caballos fueron seleccionados con DBDC, con grados variables de severidad [1], en las Comunidades Autonomas de Andalucia y Extremadura, Espana, durante el periodo Enero-Marzo 2016.

Estudio clinico-morfologico: A cada equino se le realizo un examen clinico mediante la inspeccion detallada y la palpacion siguiendo el protocolo descrito para equinos [1]. Se realizo un estudio morfologico considerando la condicion corporal (puntas oseas: espina de la escapula, costillas, tuberosidad coxal y tuberosidad isquiatica, asi como especificamente el peso, mediante una balanza digital para equinos (marca Jack Modelo Mann Scales Inc, EUA), siguiendo el protocolo de adiposidad para la evaluacion del borde dorsal del cuello (BDC) descrito para equinos [1]. Se categorizo la variable deformacion mediante la siguiente clasificacion: Grado de deformacion 0: No hay apariencia visual de cresta (Tejido sobre el ligamento cervical). No hay cresta palpable. Grado de deformacion 1.--No hay apariencia visual de cresta pero se puede palpar un ligero acumulo adiposo. Grado de deformacion 2.--Cresta apreciable visualmente, pero el acumulo de grasa se deposita equitativamente desde la nuca a la cruz. La cresta se puede palpar y se inclina de un lado a otro. Grado de deformacion 3.--Cresta engrosada y mas grande. La grasa se deposita mayoritariamente en el medio del cuello dando una apariencia del monticulo. La cresta se palpa en una mano y empieza a perder flexibilidad hacia los lados. Grado de deformacion 4.--Cresta muy grande y engrosada que no es posible palpar con una mano por su gran tamano, se mueve facilmente de un lado a otro. La cresta puede tener arrugas o pliegues perpendiculares a la linea superior. Grado de deformacion 5.La cresta es tan grande que se cae permanentemente hacia un lado. Se midio la distancia de una linea recta desde la nuca a su borde craneal de la cruz. La circunferencia del cuello se midio con una cinta metrica perpendicularmente a esta linea al 25; 50 y 75% de la distancia entre estas dos estructuras, las cuales se les ha designado como D1, D2, y D3, respectivamente. La circunferencia media del cuello se calculo mediante la media de estas tres medidas [3.4].

Biopsia: La tecnica de biopsia de la RDC en equinos basicamente consistio en la toma de muestras mediante un sistema de biopsia ajustable, se colectaron seis muestras (punch), en la RDC (craneal, media y caudal) del musculo esplenio, del lado derecho e izquierdo, con una profundidad de 2-3cm. [13]. La tecnica se describe detalladamente a continuacion: 1.Una vez realizada la exploracion clinica, palpacion y medidas morfologicas del diametro y largo del cuello. 2.--Delimitacion del area para la toma de muestra (RDC derecha e izquierda: craneal, media y caudal) 3.--Toma de muestras mediante la tecnica de biopsia (sistema de biopsia ajustable) las cuales se toman un numero de seis muestras (punch), en la region dorsal del cuello (RDC) (craneal, media y caudal), especificamente el musculo esplenio, del lado derecho e izquierdo. Aproximadamente de 2-3cm. de profundidad. Los planos anatomicos dorso-laterales de la region del cuello se describen a continuacion: Primer Plano: piel y subcutis en el borde dorsal, la cresta adiposa de la nuca. Segundo Plano: ramos dorsales cutaneos de los nervios cervicales y la fascia cervical superficial englobando a la porcion cervical del musculo trapecio. Tercer Plano: cordon de la nuca, musculos romboides y omotransverso y la rama dorsal del nervio accesorio. Cuarto Plano: musculo esplenio y serrato ventral del cuello. Quinto Plano: Fascia profunda del cuello, musculos semiespinal de la cabeza y longisimos de la cabeza, atlas y cuello. Sexto Plano: lamina de la nuca (porcion laminar del ligamento cervical) y los musculos espinal, multifido e intertransverso del cuello. Desinfeccion de los puntos de toma de muestra para biopsia. 4.--Las muestras una vez obtenidas se Ajaron en un recolector identificado, con medio de fijacion formol al 10% y/o glurataldehido [13,14].

Analisis histopatologico e inmunohistoquimico: los fragmentos de tejido fueron procesados por los metodos histologicos convencionales y tenidos con la coloracion de rutina hematoxilina y eosina. Las biopsias fueron clasificadas por los patrones de reconocimiento descritos en la literatura [12]. Adicionalmente fue empleada la tincion de Tricromico de Masson con el objetivo de delimitar la Abra de colageno y elasticas, tejido conjuntivo, muscular y fibras musculares. Las preparaciones histologicas fueron observadas al microscopio optico (Olimpus, CX23, Japon). Se empleo el anticuerpo Desmina (abcam, AntiDesmin antibody ab8592, EUA), (dilucion 1:100), para el estudio inmunohistoquimico, dado que es un filamento intermedio se encuentra en las celulas del musculo liso, esqueletico y cardiaco [5,18].

Analisis morfometrico: se empleo el programa Imagen Tools (http://compdent.uthscsa.edu/dig/itdesc.html), con imagenes digitalizadas de biopsias de musculo en sus respectivos grados del 0-5. El procedimiento consiste en trazar una linea sobre la graticula, se selecciono la unidad de medida (pm) y se registro la longitud de linea. Una vez calibrado el programa, se maximizo la imagen de interes y se selecciono el icono, para medir las variables (superficie y profundidad). En cada medicion se registraron los datos morfometricos correspondientes a las variables en una hoja de resultados del programa y automaticamente se obtuvieron la media y la desviacion estandar de las mediciones realizadas. Se realizo un analisis estadistico ANOVA de las variables raza, medidas del cuello. Adicionalmente un analisis de covarianza de las variables estudiadas (grado de deformidad, medidas morfometricas, edad, raza y el sexo).

RESULTADOS Y DISCUSION

Los resultados obtenidos evidencian deformacion del BDC Cresty Neck (CN) en todos los equinos estudiados, con predominio del grado 3 (67%) (FIG. 1), grado 4 (25%) (FIG. 2) y grado 5 (8%).

No se observaron equinos con los grados 0-2. Los resultados se presentan en detalle en la siguiente (TABLA I).

El analisis histopatologico evidencia los siguientes patrones: Grado 3.--caracterizado por vacuolas de grasa abundantes coalescentes en el espacio intermiofibrilar y con infiltracion grasa moderada en tejido muscular (lipomatosis moderada) (67%) (FIG. 3).

Grado 4.--Se observaron vacuolas de grasa abundantes en el espacio intermiofibrilar con tendencia a la coalescencia y con infiltracion grasa en tejido muscular (lipomatosis marcada) (25%). Grado 5.--caracterizado solo por vacuolas de grasa, no se evidencia tejido muscular (lipomatosis severa) (8%). La coloracion Tricromico Masson fue positiva (+++), en todos los casos evidenciando la tincion de las fibras de colageno, y el conectivo en general y fibras musculares. Se observo con mayor intensidad en los grados 3-4 y menor intensidad en el grado 5. El anticuerpo Desmina fue negativo para los grados 3, 4 y 5 (Desmina Negativo--). No se observaron diferencias significativas (P) morfologicas, histologicas, inmunohistoquimicas entre las razas estudiadas. Se observo el mismo patron histologico para cada grado. Los resultados estadisticos muestran una correlacion negativa entre el grado de deformidad y las medidas morfometricas de la biopsia (-0,71), asi como en el resto de las variables estudiadas. En referencia al ANOVA, se muestra en la (TABLA II).

Los resultados obtenidos evidencian un importante numero de casos de DBDC en equinos Pura Raza Espanola, Hispano-Arabe, Lusitanos y en razas Cruzadas. La mayor severidad de deformacion (Grado 5), se presento en caballos de raza Lusitano (15%) y Cruzados (14%), de Pura Raza Espanola (10%), considerando el sexo en machos castrados y en un solo caballo entero, sin embargo, en caballos Hispano-Arabe no fueron observados caballos con Grado 5 de deformacion. En hembras presentaron menor severidad de deformacion comparativamente con los machos. Estadisticamente no presentaron correlacion entre la deformidad del cuello y el sexo, solo se considero la raza para este reporte y no otras variables. Estudios geneticos recientes sugieren que la heredabilidad estimada para la puntuacion CN, en caballos de Pura Raza Espanola, es bien moderada y de magnitud similar a la estimada por otros rasgos morfologicos lineales es esta raza aproximadamente 0,37 [21]. En general, las correlaciones geneticas entre la puntuacion de la cresta del cuello y otros rasgos conformacionales fueron bajos [21]. En relacion a la edad se observo la deformacion del BDC a partir de los 5 anos, el coeficiente de correlacion entre edad y grado de deformacion fue de 0,941, esto parece indicar una correlacion entre a edad y la severidad de la deformacion del cuello. A mayor edad mayor grado de deformacion en ambos sexos. Estos resultados parecen coincidir con otros estudios en caballos de Pura Raza Espanola, que sugieren que la cresta del cuello esta asociada a factores sistematicos, tales como la edad, el sexo, el color del pelaje y la conformacion de los miembros [21]. Otros estudios que asocian la obesidad con la cresta del cuello, reportan una prevalencia del grado de adiposidad del cuello > 3/5, mayor al final del invierno, que al final del verano [7]. Este estudio fue realizado a finales del invierno, por lo tanto se puede asociar a la epoca al incremento del grado de deformidad, aunque los equinos estudiados no han sido evaluados en otra epoca del ano para su respectiva comparacion. Se requieren mas estudios para dilucidar la influencia potencial de la epoca del ano sobre la interpretacion e investigacion de la cresta dorsal del cuello, y la variabilidad estacional de la adiposidad en la cresta de la nuca [7]. Los aspectos morfologicos (diametro del cuello), evidencian una media de 105,78, SD (desviacion estandar) 15,55, V (Varianza) 241,92. El coeficiente de correlacion entre deformidad y medidas morfologicas evidencia que fue negativo, asi como para medidas del cuello y medidas morfometricas -0,172, tambien fue negativo. Estudios en el BDC relacionados con ligamento cervical y adiposidad, no muestran diferencias significativas (P) relacionadas con la raza, la edad y el sexo [6]. En relacion a la tecnica de biopsia, muchos estudios han intentado dilucidar la causa de esta condicion, sin embargo ha sido limitado obtener muestras de las estructuras anatomicas de la RDC, es por ello la necesidad de crear esta tecnica de biopsia que permita el abordaje para la toma de muestras de la RDC y por ende el estudio morfologico descriptivo que permita valorar el estado del componente anatomico (piel, tejido graso y musculo) de esta region en caballos [13]. No se evidenciaron complicaciones asociadas a la toma de muestra en los equinos estudiados. El analisis histopatologico caracterizado por lo patrones descritos en la literatura [14], mostro los siguientes grados: Grado 3, Grado 4 y Grado 5, los Grados 0-2, que corresponden a caballos normales, sin CN, no fueron observados. Estas observaciones microscopicas permiten describir procesos metabolicos degenerativos asociados a infiltracion grasa (lipomatosis), progresiva en el tejido muscular de la RDC que se incrementa proporcionalmente al grado de infiltracion grasa. Estos cambios metabolicos degenerativos se corroboran desde el punto de vista inmunohistoquimico que, describen el proceso degenerativo que desarrolla la miofibrilla muscular, caracterizada por aumento del espacio intercelular, perdida del citoesqueleto celular y perdida de las bandas Z, asociada a la infiltracion grasa (lipomatosis), en los equinos estudiados. Existen severas controversias entre clinicos, genetistas y productores que consideran a la DBDC-CN como un defecto. Las observaciones clinicas-histopatologicas-inmunohistoquimica permiten confirmar que la DBDC-CN es una condicion patologica especificamente, un trastorno metabolico degenerativo caracterizado por acumulo de los lipidos que puede presentarse en equinos. Son necesarios estudios complementarios: bioquimicos, inmunohistoquimicos, ultraestructurales y moleculares con el objeto de estandarizar la biopsia de la RDC, consensuado con un sistema de gradacion de la celularidad como patron predictivo en equinos que a futuro pueda emplearse como examen pre-compra. La obesidad parece estar relacionada con el desarrollo de la DBDC [2], sin embargo es posible observar esta condicion en caballos que no presentan obesidad [13]. Observaciones reportadas por veterinarios especialistas en equinos sugieren que la obesidad es un problema creciente en la poblacion equina de compania [1]. La resistencia a la insulina (IR), el sindrome metabolico equino (EMS) y la disfuncion de la parte intermedia de la glandula pituitaria (PPID), son trastornos que tienen en comun una alteracion del metabolismo de cortisol [9], laminitis y muchos de estos trastornos posiblemente puedan estar relacionados con la DBDC. Clinicamente no se observaron otras patologias subyacentes como IR, EMS, PPID, mielopatia estenotica cervical (MEC), osteoartrosis cervical (OA), en los caballos estudiados.

CONCLUSION

Los cambios morfologicos, histologicos e inmunohistoquimicos de biopsias de musculo de equinos con DBDC observados fueron procesos metabolicos degenerativos asociados a infiltracion grasa (lipomatosis), progresiva en el tejido muscular de la RDC que se incrementa proporcionalmente al grado de infiltracion grasa. Estos cambios metabolicos degenerativos se observaron en la miofibrilla muscular, caracterizada por aumento del espacio intercelular, perdida del citoesqueleto celular y perdida de las bandas Z, asociada a la infiltracion grasa (lipomatosis), en los equinos estudiados. En hembras se observo menor severidad de deformacion comparativamente con los machos. En relacion a la edad se observo la deformacion del BDC a partir de los 5 anos, el coeficiente de correlacion entre edad y grado de deformacion fue de 0,941, esto parece indicar una correlacion entre a edad y la severidad de la deformacion del cuello. Las observaciones clinicas-histopatologicas-inmunohistoquimica permiten confirmar que la DBDC-CN, es una condicion patologica especificamente, un trastorno metabolico degenerativo caracterizado por acumulo de los lipidos que puede presentarse en equinos.

Recibido: 18/01/2017

Aceptado: 13/10/2017

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen el invaluable aporte del Departamento de Anatomia y Anatomia Patologica Comparadas de la Universidad de Cordoba, Espana y a la colaboracion de la Asociacion de Veterinarios Especialistas de Equidos de Espana (AVEEE).

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Abelardo Morales-Briceno (1), Aniceto Mendez-Sanchez (1), Jose Mendez-Angulo (2), Alejandro Escamilla-Sanchez (1) y Jose Perez-Arevalo (1)

(1) Departamento de Anatomia y Anatomia Patologica Comparadas, Edificio de Sanidad Animal, Campus de Rabanales Ctra. de Madrid km 396, 14071, Cordoba Universidad de Cordoba, Espana.

(2) Hospital Equino de Aznalcollar, Sevilla, Espana. Email: aamorales13@gmail.com

Leyenda: FIGURA 1. CABALLO DE PURA RAZA ESPANOLA CON GRADO 3 DE DEFORMIDAD DE LA REGION DORSAL DEL CUELLO CARACTERIZADO POR ENGROSAMIENTO DEL CUELLO CRESTA ENGROSADA Y MAS GRANDE. LA GRASA SE DEPOSITA MAYORITARIAMENTE EN EL MEDIO DEL CUELLO DANDO UNA APARIENCIA DEL MONTICULO.

Leyenda: FIGURA 2. CABALLO DE PURA RAZA ESPANOLA CON GRADO 4 DE DEFORMIDAD DE LA REGION DORSAL DEL CUELLO CARACTERIZADO POR UNA CRESTA MUY GRANDE Y ENGROSADA. LA CRESTA PUEDE TENER ARRUGAS O PLIEGUES PERPENDICULARES A LA LINEA SUPERIOR.

Leyenda: FIGURA 3. MICROFOTOGRAFIA DE BIOPSIA DE LA REGION DORSAL DEL CUELLO GRADO 4 CARACTERIZADO SOLO POR VACUOLAS DE GRASA, NO SE EVIDENCIA TEJIDO MUSCULAR (LIPOMATOSIS SEVERA) (LIPOMATOSIS MARCADA) (H&E 20X).
TABLA I
NUMERO DE EQUINOS, RAZA, GRADO Y PORCENTAJE DE DEFORMIDAD,
SEXO, EDAD, MEDIDAS DEL CUELLO, PESO Y MORFOMETRIA DE LA
BIOPSIA DEL CUELLO

Equinos           Grado       Porcentaje    Sexo        Edad
                Deformidad    Deformidad     M     H     Anos

                    3        67% (57/84)    39    18     5-7
Pura Raza           4        23% (19/84)     4    15     8-12
Espanola            5         10% (8/84)     6     2    13-15

                    3        76% (25/33)    19     6     5-10
Hispano-Arabe       4         24% (8/33)     4     4    11-15

                    3        53% (10/19)     2     8     5-7
Lusitano            4         32% (6/19)     2     4     8-10
                    5         15% (3/19)     2     1    11-15

                    3         57% (8/14)     7     1     5-8
Cruzados            4         29% (4/14)     3     1     9-12
                    5         14% (2/14)     2     0    13-15

Equinos         Medidas   Peso       Morfometria
                Cuello     kg         Biopsia
                  cm                  muscular

                  120     510        M 1584,36
                                     SD 124,74

Pura Raza         123     490        M 523,68
Espanola                             SD 9,12
                  133     520        M 193,33
                                     SD 50,51

                 88.6     295        M 823,57
Hispano-Arabe                        SD 14,98
                  122     410        M 578,02
                                     SD 76,40

                  95      395        M 1012,24
Lusitano                             SD 18,03
                  99      410        M 779,67
                                     SD 72,20
                  102     510        M 626,49
                                     SD 40,13

                  95      405        M 808,89
Cruzados                             SD 34,66
                  94      380        M 538,57
                                     SD 36,22
                  92      390        M 572,56
                                     SD 89,72

M: media, SD: Desviacion Estandar ([micron]m).

TABLA II
RESULTADOS DEL ANOVA DE LA RAZA Y MEDIDAS
MORFOMETRICAS DEL CUELLO

          SS            dF     MS           F        P

Entre     23.437,576    3      7.812,525    52,018   0,000
Dentro    21.927,544    146    150,189
Total     45.365,120    149

TABLA III
RESULTADOS DEL ANOVA DE LA RAZA Y MEDIDAS
morfomEtricas DE LA BIOPSIA DEL CUELLO

                 SS           dF         MS          F        P

Entre      330.881,153       3      110.293,718    0,352    0,788
Dentro     45.765.289,139    146    313460,885
Total      46,096,170,293    149
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Author:Morales-Briceno, Abelardo; Mendez-Sanchez, Aniceto; Mendez-Angulo, Jose; Escamilla-Sanchez, Alejandr
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Jan 1, 2018
Words:4548
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