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ABSENCE OF HELICOBACTER SPP. IN GASTRIC LESIONS IN PIGS USING WARTHIN-STARRY STAINING METHOD/AUSENCIA DE HELICOBACTER SPP. EM LESOES GASTRICAS DE SUINOS PELO METODO WARTHIN-STARRY/AUSENCIA DE HELICOBACTER SPP. EN LESIONES GASTRICAS EN CERDOS UTILIZANDO EL METODO DE TINCION DE WARTHIN--STARRY.

INTRODUCAO

O Brasil e o quarto pais no ranking mundial de producao e exportacao de carne suina (1). De acordo com dados publicados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatistica (2), o total de cabecas abatidas no primeiro trimestre de 2015 foi 9.170.000 suinos, superando o numero de cabecas bovinas, que totalizou 7.732.000 animais. A producao brasileira de carne suina vem mantendo uma taxa de crescimento anual de cerca de 4% e tal producao e capaz de atender o amplamente as necessidades do mercado interno, gerando excedente que e destinado a exportacao (1).

Para suprir tamanha demanda, fez-se necessario modernizar e intensificar a criacao de suinos ao longo dos anos e isso levou a diminuicao da atencao individual aos animais, ao aumento dos problemas sanitarios no rebanho e a geracao de prejuizos economicos (3,4). O manejo coletivo e o confinamento, apesar de aumentar o aproveitamento, geram condicao favoravel para o estabelecimento de doencas, diminuindo o bem-estar animal. Associado a isso, sabe-se que fatores como doencas infecciosas, dietas inadequadas, estresse e ulceras gastricas geram um quadro de emagrecimento e baixo desenvolvimento, contribuindo significativamente para a reducao do lucro (4,5).

As ulceras, principalmente as gastroesofagicas, podem gerar queda de produtividade e morte (6). A lesao inicial e caracterizada por paraqueratose, evoluindo e aumentando a intensidade ate chegar a ulceracao propriamente dita. Em suinos de creche as ulceras sao infrequentes, mas as lesoes paraqueratoticas sao encontradas e, sendo estas pre-ulcerativas, considera-se grande a possibilidade desses animais desenvolverem ulceras na idade de recria e terminacao, contribuindo assim para atraso no ganho de peso e prejuizos economicos (7).

Esse tipo de lesao e de dificil diagnostico ante mortem e tem etiologia multifatorial (8). Jejum prolongado antes do abate (9), manejo dietetico (6) e infeccao por Helicobacter pylori (8) sao apontados como possiveis causas base para o desenvolvimento de ulceras. Apesar de amplamente relatada, a ulcera nao possui etiologia e fisiopatologia bem esclarecidas (10). Um melhor entendimento sobre a patogenese permitiria avancos na elaboracao de estrategias preventivas (6).

Considerando o impacto das ulceras na saude animal, as perdas economicas que podem ser geradas por elas, a falta de dados sobre a etiologia do processo e a possibilidade de estabelecer medidas preventivas, o objetivo desse estudo foi verificar lesoes gastricas em suinos em idade de abate e relacionar os resultados com infeccao por Helicobacter spp.

MATERIAL E METODOS

Foram analisados estomagos suinos que apresentaram, ao abate, lesoes em regiao de pars esophagea, conhecido tambem como quadrilatero esofagico. A coleta foi realizada no matadouro frigorifico localizado no municipio de Muniz Freire, Espirito Santo, sob Servico de Inspecao Estadual. A coleta teve autorizacao do Instituto de Defesa Agropecuaria e Florestal do Espirito Santo (IDAF-ES).

Ao verificar, na linha de abate, a existencia de lesoes gastricas, o orgao era separado, seccionado pela curvatura maior com auxilio de tesoura e lavado para remocao de conteudo. As alteracoes macroscopicas foram classificadas conforme proposto por Yamasaki et al. (10).

Apos avaliacao macroscopica e identificacao das regioes anatomicas, quatro fragmentos de cada estomago foram coletados: 1) regiao de pars esophagea; 2) regiao de corpo; 3) regiao de fundo e 4) regiao pilorica. O material obtido foi acondicionado em frascos contendo formalina 10% e encaminhado para o Laboratorio de Patologia Animal da Universidade Federal do Espirito Santo, onde foi submetido ao processamento de rotina para inclusao em parafina. Em seguida, foram realizados cortes histologicos de tres micrometros de espessura, acondicionados em laminas de vidro.

Para cada bloco de parafina foram confeccionadas duas laminas, sendo uma corada pelo metodo Hematoxilina-Eosina (HE) para avaliacao geral das alteracoes morfologicas e outra corada pelo metodo Wharthin-Starry para evidenciar bacilos helicoidais do genero Helicobacter.

As laminas coradas pelo metodo HE foram analisadas em microscopio optico com objetiva de 10x, utilizando adaptacao do metodo proposto por Szeredi et al. (11) para classificacao das lesoes microscopicas, conforme exposto na Tabela 1.

As laminas coradas pelo metodo Wharthin-Starry foram analisadas em microscopio optico com objetiva de 100x, para avaliar presenca ou ausencia de bacilos.

Apos obtencao dos dados, os resultados foram submetidos a analise descritiva, com os valores expressos em percentuais.

RESULTADOS

Durante exame macroscopico realizado no matadouro frigorifico, constatou-se que todos os estomagos analisados apresentavam, alem de alteracoes em regiao de pars esophagea, algum grau de lesao na porcao glandular (Figura 1). Apenas um estomago nao apresentou lesao nesta porcao (Tabelas 2 e 3).

Ao analisar a lesao microscopica de paraqueratose, verificou-se presenca dessa alteracao na regiao 1 de oito estomagos (8/10), todos classificados como grau 2 (Figura 2). Esta lesao nao foi observada apenas nas duas amostras que nao apresentavam epitelio devido a ulceracao da regiao 1. Nao houve paraqueratose em nenhuma regiao glandular.

Dentre as amostras que apresentaram ulceracao na microscopia, em dois casos a lesao encontrava-se na regiao 1 e em uma das amostras tambem foi observada concomitantemente na regiao 2. Ainda foi possivel constatar a presenca de ulceras exclusivamente em regiao 2 em dois estomagos avaliados.

Todos os estomagos apresentaram algum grau de infiltrado inflamatorio mononuclear, por outro lado, em nenhuma amostra foi possivel visualizar estruturas helicoidais que pudessem ser classificadas como pertencentes ao genero Helicobacter.

DISCUSSAO

O criterio utilizado para selecao dos estomagos no presente trabalho foi existencia de alguma alteracao macroscopica na porcao aglandular no momento do abate, independente do grau da lesao. De acordo com Silveira et al. (12), por se tratar de estudo com animais em idade de abate o ideal seria utilizar escala de classificacao com quatro graus de escore de lesao, conforme foi realizado, porque em animais dessa faixa etaria espera-se maior incidencia de lesoes graves do que em animais mais jovens, sendo neste ultimo caso preferivel uma escala com mais graus.

Apenas um estomago nao apresentou lesao macroscopica em regiao glandular. Interessante notar que, apesar dos varios estudos sobre alteracoes em regiao de pars esophagea, poucos sao os relatos sobre lesoes em regiao glandular (10). Estudo recente indica que essas lesoes sao bastante frequentes, mas geralmente apresentam-se em baixo grau (12). Tal situacao poderia ser a razao pela qual as lesoes em regiao glandular sao pouco citadas, pois baixo grau implica em menores prejuizos para a saude animal e consequentemente menor atencao por parte dos profissionais.

Na macroscopia as lesoes de grau 1 foram as mais frequentes tanto em regiao aglandular quanto em regiao glandular, enquanto que na microscopia houve prevalencia de lesoes paraqueratoticas grau 2 somente na regiao aglandular. Conforme elucidado por Bal e Ghoshal (13), a porcao aglandular do estomago suino e a mais suscetivel ao estabelecimento de paraqueratose porque possui epitelio estratificado queratinizado que predispoe a essa lesao. Yamasaki et al. (10) tambem verificaram maior numero de amostras classificadas como grau 1, sugerindo que essas lesoes pre-ulcerativas predominam nos suinos em idade de abate quando comparadas as lesoes mais graves.

Entre os fatores apontados como possiveis causas para o desenvolvimento de paraqueratose encontra-se o jejum pre-abate. Costa et al. (14) determinaram que menos 16 horas de jejum nao e suficiente para o suino apresentar paraqueratose, entretanto, de acordo com Costa et al. (4) jejum de 14 a 23 horas ja daria inicio ao processo. Outros autores sugerem ainda que, quando abatidos no dia seguinte a chegada ao matadouro frigorifico, e possivel observar maior ocorrencia de ulceras gastricas do que animais abatidos no dia da chegada (15), indicando que jejum e estresse podem atuar juntos agravando o quadro de paraqueratose e levar a progressao para ulceracao.

Neste estudo verificou-se que ulceras e paraqueratose aparecem acompanhadas de infiltrado inflamatorio, entretanto, a inflamacao nao apresentou o mesmo grau em todas as regioes analisadas de uma mesma amostra. Existem evidencias de que a gastrite microscopica esta presente mesmo em animais sem lesao macroscopica (16), e nos suinos a lesao parece ocorrer de forma esporadica sem haver associacao com alguma causa aparente (17).

A necropsia e uma das formas mais seguras para diagnostico da ulcera gastroesofagica por permitir observacao direta da lesao (12), mas esforcos tem sido empregados para tentar esclarecer os processos patologicos de modo a realizar diagnostico precoce e estabelecer medidas preventivas ou curativas. Nesse cenario, surgiu a ideia de que a infeccao por especies do genero Helicobacter seja responsavel pelo quadro clinico, tendo em vista que esse agente e importante na etiologia de ulceras gastricas em humanos (8).

Ate o presente momento nao ha teste de escolha para o diagnostico de helicobacteriose em suinos e a sensibilidade do resultado varia de acordo com a metodologia empregada. Neste estudo foi utilizada coloracao de Warthin-Starry objetivando-se visualizar bacterias espiraladas pela impregnacao com prata. Tal tecnica ja foi utilizada previamente por outros autores e demonstrou percentual de diagnostico positivo em aproximadamente metade dos animais avaliados (18,10).

A histopatologia, mesmo quando utilizada coloracao de Hematoxilina e Eosina, e apontada como um dos metodos mais utilizados para o diagnostico de helicobacteriose, apesar de ser pouco seguro para classificar qual a especie em questao (19). Hellemans et al. (20) verificaram que a bacteria acomete principalmente as regioes fundica e pilorica, sendo mais facil a observacao do agente em tais locais. Raramente encontra-se bacteria em regiao de pars esophagea, desta forma, as lesoes nesta porcao do estomago aparentemente nao possuem relacao com a presenca de Helicobacter spp.

No presente estudo nao foram observadas bacterias espiraladas caracteristicas do genero Helicobacter. Dados semelhantes foram descritos por Szeredi et al. (11) e Silveira et al. (12), nao tendo sido estabelecida relacao entre as lesoes em estomagos de suinos e a infeccao. Vale ressaltar que Silveira et al. (12) realizaram imuno-histoquimica e dentre todas as amostras positivas apenas um animal foi positivo em todas as porcoes do estomago avaliadas. Desta forma, pode-se concluir que a distribuicao da bacteria nao e regular em todas as porcoes do estomago e o local da coleta influencia diretamente no resultado do teste aplicado.

Estudos recentes sugerem que o agente envolvido na etiologia das ulceras em suinos pertence ao genero Helicobacter suis, e nao ao genero Helicobacter pylori como havia sido inicialmente proposto (21,22). Assim, ja foi constatado que Helicobacter suis tem potencial para gerar lesoes gastricas severas, inclusive gastrite (23). Mesmo com tantos estudos sobre o tema, nota-se que faltam dados certeiros sobre os agentes envolvidos. Este fato, associado ao possivel impacto da infeccao bacteriana na sanidade dos rebanhos, ao potencial para causar doenca no homem e a possibilidade de reducao nos lucros, justifica o interesse e os investimentos para continuar investigando o tema.

Observa-se assim que ainda nao foi possivel confirmar de forma definitiva o papel da bacteria na etiologia das lesoes gastricas em suinos, bem como nao foi possivel excluir definitivamente sua participacao no desenvolvimento do processo. Resta a duvida sobre a qual a agressao que esta de fato gerando lesoes nesta especie, abrindo espaco para a elaboracao de novas pesquisas sobre o assunto.

CONCLUSOES

As principais lesoes gastricas observadas em suinos em idade de abate foram paraqueratose, ulceracoes e infiltrado inflamatorio, sem relacao com a infeccao por bacterias do genero Helicobacter.

Recebido em: 04/08/2016

Aceito em: 30/03/2017

REFERENCIAS

(1.) Ministerio da Agricultura Pecuaria e Abastecimento. Suinos [Internet]. Brasilia: MAPA; 2015 [cited 2015 Jul 25]. Available from: www.agricultura.gov. br/animal/especies/suinos

(2.) Instituto Brasileiro de Geografia e Estatistica. Abate de animais, producao de leite, couro e ovos [Internet]. Rio de Janeiro: IBGE; 2015 [cited 2015 Jun 25]. Available from: http://www.ibge.gov. br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/producaoagropecuaria/a bate-leite-couro-ovos_201501_1.shtm

(3.) Porto RNG, Sobestiansky J, Matos MPC, Meirinhos MLG. Aspectos histopatologicos do sistema urinario de matrizes suinas descartadas. Cienc Anim Bras. 2004;5(2):109-12.

(4.) Costa OAD, Costa MJRP, Ludke JV, Coldebella A, Kich JD, Peloso JV, et al. Tempo de jejum dos suinos no manejo pre-abate sobre a perda de peso corporal, o peso do conteudo estomacal e a incidencia de ulcera esofagica-gastrica. Cienc Rural. 2008;38(1):199-205.

(5.) Lippke RT, Kummer R, Marques BMFPP, Mores TJ, Goncalves MAD, Barcellos DESN. Monitoria sanitaria em suinocultura. Acta Sci Vet. 2009;37(1):133-46.

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(7.) Oliveira SJ, Bernardi RT, Mottin VD, Hepp D, Passos DT. Observacao de diferentes graus de lesoes em estomagos e ulcera gastrica em leitoes de creche. Isolamento de Arcobacter cryaerophilus. Acta Sci Vet. 2009;37(2):119-23.

(8.) Kavanagh N. Gastric ulcers in pigs. In Pract. 1994;16:209-13.

(9.) Sant'ana DS, Oliveira MT, Alves LR, Reis SLB, Antunes RC, Carrazza LG, et al. Influencia do jejum na incidencia de lesao na mucosa esofagica-gastrica, peso de carcaca quente e peso de estomagos em suinos. Pubvet. 2011;5(10):1-11.

(10.) Yamasaki L, Assis FMS, Rosseto VJV, Bracarense APFRL. Lesoes gastricas em suinos: ocorrencia e relacao com o genero, peso ao abate e presenca de Helicobacter spp. Semina Cienc Agrar. 2006;27(3):463-70.

(11.) Szeredi L, Palkovics G, Solymosi N, Tekes L, Mehesfalvi J. Study on the role of gastric Helicobacter infection in gross pathological and histological lesions of the stomach in finishing pigs. Acta Vet Hung. 2005;53(3):371-83.

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(13.) Bal HS, Ghoshal NG. Histomorphology of the torus pyloricus of the domestic pig (Sus scrofa domestica). Zentralbl Veterinarmed C. 1972;1(4):289-98.

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(20.) Hellemans A, Decostere A, Duchateau L, De Bock M, Haesebrouck F, Ducatelle R. Protective immunization against "Candidatus Helicobacter suis" with heterologous antigens of H. pylori and H. felis. Vaccine. 2006;24(14):2469-76.

(21.) Baele M, Decostere A, Vandamme P, Ceelen L, Hellemans A, Mast J, et al. Isolation and characterization of Helicobacter suis sp. nov. from pig stomachs. Int J Syst Evol Microbiol. 2008;58(Pt6):1350-8.

(22.) Vermoote M, Vandekerckhove TTM, Flahou B, Pasmans F, Smet A, De Groote D, et al. Genome sequence of Helicobacter suis supports its role in gastric pathology. Vet Res. 2011;42(1):51.

(23.) Flahou B, Haesebrouck F, Pasmans F, D'Herde K, Driessen A, Van Deun K, et al. Helicobacter suis causes severe gastric pathology in mouse and Mongolian gerbil models of human gastric disease. PlosOne. 2010;5(11):e14083.

Natalia Viana Tamiasso [1]

Juliana de Castro Cosme [2]

Marcus de Freitas Ferreira [3]

Louisiane de Carvalho Nunes [4]

[1] Doutorando em Ciencia Animal. Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG, Brasil.

[2] Medica Veterinaria.

[3] Departamento de Medicina Veterinaria, Universidade Federal do Espirito Santo.

[4] Departamento de Medicina Veterinaria, Setor de Patologia Animal. Universidade Federal do Espirito Santo.

Correspondencia: louisianecn@yahoo. com.br

Caption: Figura 1. Estomago de suino em idade de abate. A) Regiao aglandular evidenciando lesao de paraqueratose e ulceracoes. B) Regiao glandular evidenciando areas de erosao e hiperemia.

Caption: Figura 2. Estomago de suino em idade de abate evidenciando paraqueratose grau 2. Hematoxilina-Eosina, Barra = 143,5 [micro]m.
Tabela 1. Criterios para classificacao das leses histologicas de
estomagos suinos corados com HE segundo Szeredi et al. (11)

Lesao           Grau                 Caracteristica

Paraqueratose    0                      Ausente
                 1     1 a 10 camadas celulares paraqueratoticas
                 2        Mais de 10 camadas paraqueratoticas
Ulceracao ou     0                      Ausente
  erosao         1             1 ou 2 ulceras ou eroses
                 2            Mais de 2 ulceras ou eroses
Infiltrado       0                      Ausente
 inflamatorio    1            Infiltrado inflamatorio leve
                 2          Infiltrado inflamatorio moderado
                 3           Infiltrado inflamatorio severo

Tabela 2. Quantificacao dos estomagos suinos de acordo com o grau
de lesao macroscopica em regiao aglandular.

Grau da lesao           Numero de amostras
                        de regiao aglandular

Grau 0 (sem lesao                0
  macroscopica)
Grau 1 (paraqueratose            7
  ou epitelio
  rugoso)
Grau 2 (eroses)                 0
Grau 3 (ulceraces)              3

Tabela 3. Quantificacao dos estomagos suinos de acordo com o grau
de lesao macroscopica em regiao glandular.

Grau da lesao            Numero de amostras
                         de regiao glandular

Grau 0 (sem lesao                 1
  macroscopica)
Grau 1 (hiperemia ou              4
  edema ou hemorragia)
Grau 2 (eroses)                  3
Grau 3 (ulceraces)               2
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Author:Tamiasso, Natalia Viana; de Castro Cosme, Juliana; de Freitas Ferreira, Marcus; de Carvalho Nunes, L
Publication:Veterinaria e Zootecnia
Date:Jun 1, 2017
Words:2852
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