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A metodologia de superficie de resposta como ferramenta para a avaliacao da producao de alginato e poli-hidroxibutirato pela Azotobacter vinelandii.

Introducao

O alginato e um polissacarideo normalmente extraido das paredes celulares de algas marrons (Phaeophyta), sendo utilizado como agente estabilizante, espessante e gelificante, na industria de alimentos e tambem como imobilizador de celulas nas industrias farmaceutica e biotecnologica.

O alginato, nas algas marinhas, encontra-se como componente estrutural da parede celular e nos espacos intracelulares, promovendo rigidez e, ao mesmo tempo, flexibilidade a parede celular e compreende cerca de 40% da materia seca destes organismos. Anualmente, a industria produz cerca de 30 mil toneladas de alginatos, cujas algas sao cultivadas em fazendas marinhas.

A estrutura do acido alginico consiste de cadeias lineares de residuos de acido [beta]-D-manuronico (M) unidos por ligacoes tipo (1[flecha diestra]4) e residuos de seu epimero, o acido [alfa]-L-guluronico (G), em varias proporcoes. Estes residuos estao arranjados na forma de blocos de acidos manuronico (M) ou guluronico (G), ligados de forma que a sequencia destes residuos na molecula seja alternada (BRAYNER et al., 2007). A molecula deste polimero e constituida por blocos homopolimericos, M- e G-, e por blocos heteropolimericos MG- (Figura 1). Na molecula, a disposicao espacial dos monomeros se da segundo a posicao energetica mais favoravel. Para blocos G--G, esta e uma posicao em forma de cadeira, [sup.1][C.sub.4], sendo os monomeros unidos por ligacao glicosidica [alfa](1[flecha diestra]4). Para M--M, trata-se da posicao 4C1, sendo a ligacao glicosidica do tipo [beta](1[flecha diestra]4). O grupo carboxilico e responsavel por uma ligacao glicosidica equatorial/equatorial em M--M, uma ligacao glicosidica axial/axial em G--G e uma ligacao glicosidica equatorial/axial para M--G.

[FIGURA 1 OMITIR]

As propriedades fisico-quimicas dos alginates dependem da massa molecular, da proporcao dos monomeros M:G ao longo da cadeia e tambem do grau de acetilacao. Os alginates sao produzidos por bacterias e por algas marinhas marrons, e os residuos de manuronato dos alginatos bacterianos, mas nao os de algas, sao acetilados nas posicoes O-2 e/ou O-3 (XIAO et al., 2006).

Atualmente, a producao e concentrada, principalmente, no cultivo de algas marinhas marrons, entretanto, varias bacterias pertencentes ao genero Pseudomonas e Azotobacter produzem alginato (ROZEBOOM et al., 2008) e a estrutura dos blocos de residuos dos monomeros e similar nos alginatos produzidos por algas marinhas e nos sintetizados por A. vinelandii (PENA et al., 2006). Em contraste, todos os alginatos de Pseudomonas, embora possuam monomeros G, nao possuem sequencias destes monomeros, ou seja, nao possuem blocos G (GARCIA-CRUZ et al., 2008).

Pela propriedade de o acido alginico ser insoluvel em agua a temperatura ambiente, os sais de sodio, calcio e potassio do acido alginico, soluveis em agua, sao preferidos para o emprego na industria de alimentos. O composto mais amplamente usado e o alginato de sodio. Em muitas aplicacoes, o alginato de sodio soluvel torna-se insoluvel por meio da adicao de cations divalentes, geralmente calcio, resultando em geis ou filmes. A forca do gel depende da natureza do cation divalente.

Com a diversidade de aplicacoes deste polimero nos setores alimenticio e farmaceutico e a constante poluicao dos mares, uma vez que as algas necessitam de agua limpida para seu crescimento, a comunidade cientifica engajou-se em uma pesquisa continuada, visando entender melhor as vias bioquimicas, a funcao fisiologica e a biologia das bacterias produtoras deste polimero, visando a regulacao da sua formacao e composicao, e ainda a otimizacao do processo de producao. A bacteria Azotobacter vinelandii se mostrou mais promissora para a producao de alginato por nao ser patogenica e produzir elevadas quantidades deste polimero.

A Azotobacter vinelandii, alem de produzir o alginato, apresenta outra caracteristica importante: sob limitacao de nutrientes como fosforo, oxigenio e na presenca de excesso de uma fonte de carbono esta bacteria produz poli-hidroxialcanoatos (PHAs), polimeros intracelulares pertencentes a familia dos poliesteres. Os PHAs podem ser sintetizados por muitas bacterias em biorreatores a partir de acucares em condicoes de estresse. Estes polimeros podem representar ate 80% da massa seca total da celula. Sao polimeros 100% biodegradaveis e biocompativeis.

Os PHAs tambem sao conhecidos como bioplasticos, pois possuem propriedades termoplasticas e caracteristicas de desempenho semelhantes as dos plasticos convencionais, entretanto, os bioplasticos sao facilmente degradados pela acao de microrganismos no meio ambiente. Sao exemplos de PHAs: polihidroxibutirato (PHB), poli-[beta]-hidroxivalerato (PHV) e o poli-hidroxibutirato-co-valerato (PHB-V).

[FIGURA 2 OMITIR]

Muitos microrganismos sao produtores de PHAs e, destes, a especie Azotobacter vinelandii e uma bacteria que pode acumular grandes quantidades de PHB com a vantagem de utilizar, durante seu crescimento, ampla variedade de acucares nao necessariamente refinados, como os encontrados em melaco de cana-de-acucar, beterraba e xarope de milho.

Tendo em vista a importancia mundial do alginato e do poli-hidroxibutirato, este trabalho ilustra o estudo da producao de ambos os compostos pela bacteria Azotobacter vinelandii, utilizando fermentacao submersa com diferentes parametros (pH, temperatura de incubacao, tempo de incubacao, diferentes concentracoes de sais e tambem diferentes concentracoes de sacarose como fonte de carbono) e a Metodologia de Superficie de Resposta como instrumento estatistico para a avaliacao da producao.

Material e metodos

Material

a) Microrganismo

O microrganismo utilizado foi o Azotobacter vinelandii CCT 2841 = DSM 85, obtido da Fundacao Tropical de Pesquisas e Tecnologia 'Andre Tosello'--Campinas, Estado de Sao Paulo.

b) Meio de Manutencao

A linhagem do microrganismo Azotobacter vinelandii foi mantida em agar YM cuja formula e composta por (em gramas por litro): extrato de levedura 3,0; extrato de malte 3,0; peptona 5,0; dextrose 10,0; agar 20,0 e agua destilada 1,0 L.

c) Meio de pre-fermentacao e fermentacao

Para a pre-fermentacao foram utilizados Erlenmeyers de 250 mL, contendo 50 mL de caldo nutriente. Na etapa de fermentacao para a producao de PHB e alginato, foi utilizado o meio minimo ou basal composto por (em gramas por litro): K[H.sub.2]P[O.sub.4] 0,16; [K.sub.2]HP[O.sub.4] 0,64; MgS[O.sub.4] x 7[H.sub.2]O 0,4; NaCl 0,2; CaS[O.sub.4] x 2[H.sub.2]O 0,05; FeS[O.sub.4] x 7[H.sub.2]O 0,0025 e [Na.sub.2]Mo[O.sub.4].2[H.sub.2]O 0,001. O pH foi ajustado de acordo com o delineamento experimental. As solucoes de sacarose em diferentes concentracoes foram misturadas no meio minimo no momento da fermentacao. O meio minimo foi esterilizado separadamente da solucao de sacarose, ambos em autoclave a 121[grados]C por 20 min.

Metodos

a) Preparo do pre-inoculo

A partir da cultura estoque do Azotobacter vinelandii CCT 2841 = DSM 85, foram repicados, por estrias em esgotamento, tubos inclinados de PCA e incubados em estufa a 30[grados]C por 24h.

b) Producao do PHB e do Alginato

A producao foi dividida em duas etapas: prefermentacao e fermentacao. Na primeira, foi realizada a suspensao das celulas bacterianas (obtidas no item Metodos a.) pela adicao de 5,0 mL do caldo nutriente em cada tubo de ensaio. A seguir, foram transferidas para frascos Erlenmeyer, contendo 45 mL deste mesmo meio e estes foram incubados em agitador orbital rotatorio a 30[grados]C, 225 rpm por 24h (PAGE et al., 2001). Na segunda etapa, foi realizada a padronizacao do inoculo. Para isto, foi utilizado um espectrofotometro Cintra 5 UV-VIS Double Beam ate se atingir uma densidade otica de 0,7 a 0,9 a 620 nm (BELLENGER et al., 2008). Logo apos, os frascos Erlenmeyer foram incubados em agitador orbital rotatorio a 120 rpm na temperatura e no tempo de incubacao pre-determinados pelo planejamento experimental (item Metodos c.).

c) Otimizacao dos parametros de fermentacao

Para a otimizacao da producao do PHB ([Y.sub.1] = poli-hidroxibutirato) e do alginato ([Y.sub.2] = alginato), foram realizados dois planejamentos experimentais, utilizando-se o software Statistica 6.0, de maneira a se determinar a melhor area de producao de ambos os compostos. Desse modo, no primeiro delineamento experimental, foi realizado um planejamento estatistico fatorial fracionado [2.sup.6-2] e as variaveis independentes estudadas foram: [X.sub.1] = fonte de carbono em g [L.sup.-1] (sacarose); [X.sub.2] = pH; [X.sub.3] = temperatura de incubacao em [grados]C; [X.sub.4] = acetato de amonio em mmol [L.sub.-1]; [X.sub.5] = citrato de amonio e ferro (III) em [micron]mol [L.sup.-1] e [X.sub.6] = tempo de incubacao em horas; resultando em 16 experimentos acrescidos de duas repeticoes no ponto central (MONTGOMERY, 2001) (Tabela 1).

Com a perspectiva de se aproximar da regiao otima de producao, realizou-se um segundo planejamento experimental, utilizando-se apenas as variaveis significativas ([X.sub.1] = sacarose em g [L.sup.-1] e [X.sub.3] = temperatura de incubacao em [grados]C) acrescidas da variavel [X.sub.6] = tempo de incubacao em hora, resultando em um planejamento estatistico fatorial completo [3.sup.3-0] em triplicata (81 experimentos) como descrito na Tabela 2. Durante o segundo experimento, manteve-se o pH inicial em 7 e as solucoes de acetato de amonio e citrato de amonio e ferro (III) em 37,5 mmol [L.sup.-1] e 57 [micron]mol [L.sup.-1], respectivamente.

Metodos analiticos

a) Determinacao do Crescimento Celular (Biomassa)

A massa celular foi determinada, medindo-se, no espectrofotometro a 620 nm, uma suspensao de celulas em agua destilada, apos separacao das mesmas por centrifugacao a 8.000 rpm, 15 min. a 4[grados]C. Previamente, foi obtida a curva de correlacao de absorbancia versus peso seco. Todas as analises foram realizadas em triplicata.

b) Obtencao do alginato e PHB

As celulas foram separadas do meio fermentado por centrifugacao a 8.000 rpm durante 15 min. a 4[grados]C. Em seguida, foram tratadas com acetona absoluta para se obter melhor pureza do produto final. Apos esse procedimento, fez-se a retirada do PHB intracelular com cloroformio. Para isto, utilizou-se a proporcao de 100 mL de cloroformio para cada 1-2 g de celulas e a mistura permaneceu em refluxo por 15 min. na temperatura de 61[grados]C. A seguir, separou-se o PHB do material celular por meio da filtracao seguida de precipitacao com etanol absoluto e o precipitado foi seco em estufa a vacuo a 45[grados]C ate peso constante.

O sobrenadante obtido na centrifugacao foi utilizado para a obtencao do alginato. Desse modo, adicionaram-se 3V de etanol absoluto para a precipitacao do alginato, o qual foi seco em estufa a vacuo a 45[grados] C ate peso constante.

c) Purificacao do alginato e PHB

A purificacao foi realizada, dissolvendo-se o PHB em hidroxido de sodio 1 N, precipitando-o novamente com etanol absoluto (LIN; SADOFF, 1968). O alginato seco foi dissolvido em agua destilada e precipitado novamente com etanol absoluto. Ambos os procedimentos foram repetidos tres vezes.

Resultados e discussao

Primeiro planejamento experimental

Com o estudo da Analise de Variancia (ANOVA) pelo software STATISTICA, observou-se, no primeiro planejamento experimental (planejamento estatistico fatorial fracionado [2.sup.6-2]), que, embora tenham sido analisados diferentes parametros (concentracao da fonte de carbono (sacarose), pH, temperatura de incubacao, concentracao de acetato de amonio, concentracao de citrato de amonio e ferro (III) e tempo de incubacao), nenhum parametro foi significante estatisticamente para o favorecimento da biomassa. Entretanto, por meio da Metodologia de Superficie de Resposta (MSR), pode-se observar que o aumento da biomassa (2,29 mg [mL.sup.-1]) foi acompanhado pelo acrescimo da concentracao de sacarose (55 g [L.sup.-1]) na temperatura entre 38-42[grados]C e tempo entre 40-50h (Figura 3). O comportamento da biomassa em relacao a fonte de carbono apresentou valores semelhantes aos obtidos por Cho et al. (2001) e foi observado que, quanto maior a concentracao da fonte de carbono, maior e o crescimento bacteriano.

O estudo do crescimento bacteriano da Azotobacter vinelandii, com relacao a variacao de temperatura, nao havia sido registrado anteriormente nos artigos de referencia, que apenas citavam a faixa de 25-30[grados]C. Entretanto, a melhor temperatura para o desenvolvimento celular foi entre 38-42[grados]C. O tempo tambem e fator importante para se determinar a fase do crescimento bacteriano; sendo assim, o valor encontrado neste primeiro experimento foi entre 40-50h como o maior valor de biomassa da A. vinelandii e, acima deste tempo, ocorreu uma diminuicao da biomassa. Alguns autores (VARGAS-GARCIA et al., 2002; LIN; SADOFF, 1968) tambem encontraram maiores valores de biomassa entre 40-50h. O comportamento grafico dos resultados esta representado pelas equacoes: Figura 3(a): Biomassa (mg [mL.sup.-1]) = 1,169 + 0,0061 * x + 0,0189 * y, em que: x = sacarose (g [L.sup.-1]) e y = temperatura ([grados]C) e Figura 3(b): Biomassa (mg [mL.sup.-1]) = 1,8635 - 0,0071 * x + 0,0189 * y, em que: x = tempo (h) e y = temperatura ([grados]C).

[FIGURA 3 OMITIR]

Em nosso experimento, a producao de PHB teve como parametros significativos, apenas a concentracao de sacarose e a temperatura de incubacao. Com a Metodologia de Superficie de Resposta (MSR), pode-se observar que a producao maxima (12-14 mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1]) foi obtida em menores concentracoes de sacarose entre 5 a 20 g [L.sup.-1] e nas maiores temperaturas entre 39 e 42[grados] C (Figura 4). A vantagem em se utilizar a sacarose como fonte de carbono e que este acucar e mais abundante e barato que a glicose e o Brasil e um dos maiores produtores deste acucar, motivos pelos quais foi escolhida esta fonte de carbono. A equacao que representa o comportamento da producao do PHB (mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1]) e = -4,62-0,081*x+0,46*y (em que: x = concentracao de sacarose (g [L.sup.-1]) e y = temperatura ([grados]C)).

[FIGURA 4 OMITIR]

O estudo da Analise de Variancia (ANOVA), na producao concomitante de alginato e polihidroxibutirato pela bacteria A. vinelandii, pode revelar que nenhuma das variaveis independentes apresentou significancia estatistica na producao do alginato. Entretanto, a metodologia de superficie de resposta (MSR) indicou que a producao de alginato foi maxima (89-100 mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1]) entre 40-55h de fermentacao, temperatura de 24-28[grados]C e sacarose na concentracao de 40-55 g [L.sup.-1] (Figura 5). A equacao que demonstra o comportamento da producao de alginato em funcao da temperatura (x) e do tempo (y) e: Alginato (mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1]) = 256,55 - 4,31 * x - 0,8966 * y. A Figura 5 (b) demonstra o comportamento da producao de alginato em funcao da concentracao de sacarose (x) e do tempo (y), cuja equacao e: Alginato (mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1]) = 106,31 +0,3338 * x - 0,8966 * y.

[FIGURA 5 OMITIR]

Comparando-se a quantidade de alginato produzida com os valores descritos na literatura, pode-se observar que Horan et al. (1983) obtiveram cerca de 180 mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1], utilizando 20 g [L.sup.-1] de sacarose como fonte de carbono. Brivonese e Sutherland (1989) utilizaram glicose como fonte de carbono e obtiveram entre 6-7,5 g [L.sup.-1] de alginato a 280 rpm e observaram que, diminuindo a agitacao para 120 rpm, a producao foi de apenas 1,4 g [L.sup.-1] de alginato. Os resultados deste trabalho mostraram que a producao maxima de alginato foi de 29,8 g [L.sup.-1] em 48h de incubacao e 120 rpm.

Embora nao apresentasse significancia estatistica, o menor valor de pH (pH = 6) foi favoravel para a produtividade do PHB e do alginato. Observou-se, tambem, que a produtividade de ambos os compostos foi favorecida com a adicao de 15,0 mmol [L.sup.-1] (concentracao mais baixa) de acetato de amonio e 90,0 [micron]mol [L.sup.-1] de citrato de amonio e ferro (III), a maior concentracao testada.

Segundo planejamento experimental

No segundo planejamento experimental ([3.sup.3-0]), utilizando-se como variaveis independentes a fonte de carbono, a temperatura e o tempo de incubacao, foi possivel comprovar que o aumento da biomassa foi favorecido pelas elevadas concentracoes de sacarose na temperatura de 38[grados]C (Figura 6).

[FIGURA 6 OMITIR]

Verificou-se tambem aumento na produtividade do PHB de 12 para 45 mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1] e do alginato de 100 para 1.600 mg [g.sup.-1] de celula [h.sup.-1]. Portanto, a produtividade de ambos os compostos foi maxima na temperatura de incubacao de 62[grados]C, no menor tempo de incubacao (18h) e com sacarose na concentracao de 11 g [L.sup.-1] (Figura 7). A pureza do PHB extraido foi de 94% para ambos os planejamentos experimentais.

[FIGURA 7 OMITIR]

A producao concomitante de alginato e PHB pela bacteria Azotobacter vinelandii e maxima para ambos os compostos quando a fermentacao e realizada em menor tempo de incubacao, 15-18h, e, portanto, quando a biomassa bacteriana ainda se encontra baixa (0,50 mg [mL.sup.-1]). A temperatura de incubacao ideal foi de 62[grados]C e a concentracao de sacarose de 11 g [L.sup.-1]. A analise de variancia (ANOVA) indicou que apenas a concentracao de sacarose, a temperatura e o tempo de incubacao apresentaram significancia estatistica em grande parte das analises; as demais variaveis nao foram estatisticamente significativas para a producao maxima de ambos os produtos. Desse modo, foi possivel produzir elevadas concentracoes de alginato e PHB apenas controlando a concentracao de sacarose inicial, a temperatura e o tempo de incubacao.

Agradecimentos

Ao CNPq pela concessao da bolsa de mestrado.

DOI: 10.4025/actascitechnol.v32i2.1792

Referencias

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Received on April 2, 2008.

Accepted on May 14, 2009.

Adriana Navarro da Silva * e Crispin Humberto Garcia-Cruz

Universidade Estadual Paulista, Rua Cristovao Colombo, 2265, 15054-000, Jardim Nazareth, Sao Jose do Rio Preto, Sao Paulo, Brasil. * Autorpara correspondencia. E-mail: drykans@yahoo.com.br
Tabela 1. Variaveis independentes estudadas no primeiro
planejamento experimental [2.sup.6-2].

Variaveis                                                Niveis

                                                    -1     0     + 1

[X.sub.1] - fonte de carbono (g [L.suup.-1])       10,0   30,0   50,0
[X.sub.2] - pH                                      6      7      8
[X.sub.3] - temperatura de incubacao ([grados]C)   25,0   32,5   40,0
[X.sub.4] - acetato de amonio (mmol [L.sup.-1])    15,0   37,5   60,0
[X.sub.5] - citrato ferrico ([micron]mol
  [L.sup.-1])                                      30,0   60,0   90,0
[X.sub.6] - tempo de incubacao (h)                  48     72     96

Tabela 2. Variaveis independentes estudadas no segundo
planejamento experimental [3.sup.3-0].

Variaveis                                      Niveis

                                            -1   0    +1

X1 - Fonte de Carbono (g [L.sup.-1])        2    6    10
X2 - Temperatura de incubacao ([grados]C)   40   50   60
X3 - Tempo de incubacao (h)                 18   33   48
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Title Annotation:texto en portugues
Author:Navarro da Silva, Adriana; Garcia-Cruz, Crispin Humberto
Publication:Acta Scientiarum Technology (UEM)
Date:Apr 1, 2010
Words:3970
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