Clonidine prevents development of hypertension in N (omega)-nitro-L-arginine-treated rats/Klonidin N (omega)-nitro-L-arjinin aracili hipertansiyon gelisimini onler.

ABSTRACT

Objective: Although there are some evidences on the contribution of increased sympathoadrenergic activity on long-term nitric oxide synthase (NOS) inhibition induced hypertension, the contribution of sympathetic activity to the development of this model of hypertension are not sufficiently studied. The aim of the present study is to investigate the effects of clonidine on blood pressure and vascular alpha-adrenergic receptors in the long-term N (omega)-nitro-L-arginine (L-NNA) treated rats.

Methods: Sixty two Wistar rats were randomly divided into 8 groups. All groups were administrated L-NNA and/or clonidine in two different concentrations for ten days. L-NNA was administrated in concentrations of 15 and 45 mg/100ml to L-NNA45 and L-NNA45 groups, respectively. Clonidine was also administrated in concentrations of 150 and 225 [micro]g/100ml to KLO225 and KL0225 groups, respectively. Blood pressure and heart rates were measured with tail-cuff method and plasma NOx levels with spectrophotometer. The [alpha]- adrenoreceptors responses were evaluated in thoracic aorta rings in "in vitro" conditions.

Results: Clonidine prevented the L-NNA induced hypertension dose-dependently, but did not effect the heart rates decreased by L-NNA. The heart rates and blood pressure of normotensive rats were not changed by clonidine alone. Plasma NOx levels increased in L-NNA15 group (0.62 [+ or -] 0.11 [micro]mol/L, p=0.003) but did not change in other groups. The sensitivity of aorta to phenylephrine (-7.33 [+ or -] 0.11 [micro]mol/L, p=0.001) and clonidine (-7.60 [+ or -] 0.27 [micro]mol/L, p=0.003) in L-NNA45 group and phenylephrine (-6.94 [+ or -] 0.13 [micro]mol/L, p=0.002) in L-NNA15 group increased. The sensitivity of aorta to phenylephrine (7.93 [+ or -] 0.16 [micro]mol/L, p=0.001) in KL0225 group and to clonidine (-7.20 [+ or -] 0.10 [micro]mol/L, p=0.009) in KLO150 group increased.

Conclusion: This study supports the idea suggesting that symphathetic nervous system activation is partly responsible for the development of the long-term NOS inhibition induced hypertension. In conclusion, it was shown for the first time that clonidine prevents the development of long-term NOS inhibition induced hypertension dose-dependently.

Keywords: Hypertension, nitric oxide, clonidine, sympathetic activity, alpha adrenergic receptors 

OZET

Amac: Kronik nitrik oksit sentaz (NOS) inhibisyonu aracili hipertansiyona artmis sempatoadrenerjik aktivitenin katkisi bilinmekle birlikte yeterince acyk degildir. Bu model hipertansiyona sempatik aktivitenin katkisim belirlemek icin bu calismada uzun sureli N (omega)-nitro-L-arjinin (L-NNA) uygulamasiyla gelisen hipertansiyonda sempatolitik bir ajan olan klonidinin kan basinci ve vaskuler alfa-adrenerjik reseptorler uzerine etkileri incelendi.

Yontemler: Altmis iki Wistar sicanlar randomize bir sekilde 8 gruba ayrildi: Tum gruplara L-NNA ve/veya klonidin iki farkli konsantrasyonda icme suyuyla 10 gun sureyle uygulandi. L-NNA15 ve L-NNA45 gruplari sirasiyla 150 ve 45mg/100ml konsantrasyonda L-NNA aldy. KLO150 ve KLO225 gruplarina sirasiyla 150 ve 225[micro]g/100ml konsantrasyonda klonidin uygulandi. Kan basinci ve kalp hizi "tail-cuff" yontemi, plazma NOx duzeyleri spektrofotometre ile tespit edildi. [alpha]-adrenerjik reseptor yanitlari aorta halkalarinda "in vitro" sartlarda degerlendirildi.

Bulgular: Klonidin L-NNA uygulamasi ile olusan hipertansiyonun gelisimini doz bagimli olarak onlerken kalp hizinda meydana gelen anlamli dususu etkilemedi. Tek basina klonidin uygulanan normotansif sicanlarin kan basinci ve kalp hizinda bir degisiklik olmadi. Plazma NOx seviyesi L-NNA15 grubunda artti (0.62 [+ or -] 0.11 [micro]mol/L, p=0.003), diger gruplarda ise degismedi. Aorta halkalarinin "in vitro" deneylerde L-NNA45 grubunda hem fenilefrine (-7.33 [+ or -] 0.11, p=0.001) hem de klonidine (-7.60 [+ or -] 0.27 [micro]mol/L, p=0.003), L-NNA15 grubunda ise fenilefrine duyarliginin arttigi tespit edildi (-6.94 [+ or -] 0.13 [micro]mol/L, p=0.002). KLO150 grubunda aorta halkalarinin klonidine (-7.20 [+ or -] 0.10 [micro]mol/L, p=0.009), KL0225 grubunda ise fenilefrine duyarligi artti (7.93 [+ or -] 0.16 [micro]mol/L, p<0.001).

Sonuc: Bu bulgular NOS inhibisyonu aracili hipertansiyonun gelisiminden sorumlu mekanizmalardan birinin sempatik sinir sistemi aktivasyonu oldugu gorusunu desteklemekte ve uzun sureli L-NNA uygulamasy ile olusan kalp hizi dususunun gelisen hipertansiyondan bagimsiz olabilecegine isaret etmektedir. Sonuc olarak santral etkili bir antihipertansif ilac olan klonidinin uzun sureli NOS inhibisyonu aracili hipertansiyonun gelisimini doz bagimli olarak onledigi bu calismada ilk kez gosterilmistir. (Anadolu Kardiyol Derg 2008; 8: 104-10)

Anahtar kelimeler: Hipertansiyon, nitrik oksit, klonidin, sempatik aktivite, alfa adrenerjik reseptorler

Giris

Kronik nitrik oksit sentaz (NOS) inhibisyonu aracili hipertansiyon modeli esansiyel hipertansiyon arastirmalarinda yogun olarak kullanilmaktadir. Kronik NOS inhibisyonu aracili hipertansiyona total periferik direnc artisinin, artmis renal sodyum tutulumunun, sempatik sistem aktivasyonunun ve cesitli endojen vazoaktif maddelerin katkisi oldugu ileri surulmektedir (1, 2). Nitrik oksit sentaz inhibisyonu aracili hipertansiyonda artmis vaskuler [alpha]-adrenerjik reseptor duyarliginyn katkisina da isaret edilmektedir (3-5). Bu model hipertansiyonun gelismesinde, sempatik sistem aktivasyonu uzerinde yogun olarak calysylmasyna raomen, ozellikle plazma veya idrar katekolamin duzeylerinin arttigini (6), degismedigini (7) veya azaldigini bildiren celiskili sonuclar mevcuttur (7, 8). Nitrik oksit sentaz inhibisyonu sonucu kan basincinda meydana gelen artisin sempatolitik bir ilac olan fentolamin infuzyonu ve bir gangliyon blokoru olan pentolinyum ile dikkate deger bir sekilde onlenmesi sempatik aktivite artisinin bu model hipertansiyonda rol alan mekanizmalarin onemlilerinden birisi oldgou izlenimini vermektedir: Bu antihipertansif maddeler ayni zamanda normotansif sicanlarin bazal kan basincini da dusurduklerinden, antihipertansif tesirlerinin artmis bir sempatik aktiviteyi onlemelerinden kaynaklandigina dair yaklasim yeterince ikna edici gorunmemektedir (9,10). Antihipertansif tesirin doz-bagimly olmasi ve kontrol deneklerinde hipotansiyon olusturmamasi onemlidir. Bu model hipertansiyonun gelisimi bircok ilac tarafindan onlenmektedir (11-14). Bu model hipertansiyonun gelismesinde, sempatik sinir sistemi aktivasyonunun katkisini degerlendirmek icin, sempatik noronal atesleme uzerine direkt etkili bir antihipertansif ilacin etkinligi anlam ifade edecektir. Klonidinin hem spontan hipertansif sicanlarda, hem de diger hipertansiyon modellerinde yapilan bircok calismada kan basincini onemli derecede onledigi gosterilmistir (15-18). Santral ve periferik sempatik sinir sistemi aktivitesini azaltarak kan basincini dusurdugu iyi bilinen klonidinin, NOS inhibisyonu aracili hipertansiyon uzerine etkileri bilinmemektedir (19). Bu calismada; uzun sureli N (omega)-nitro-L-arjinin (L-NNA) uygulamasiyla gelisen hipertansiyonda klonidinin kan basinci ve vaskuler alfa-adrenerjik reseptorler uzerine etkilerini inceleyerek kronik NOS inhibisyonu aracili hipertansiyon gelisimine sempatik sistemin katkisiny belirlemek amaclanmistir.

Yontemler

Denekler

Deneylerde yaklasik 300g agirliginda 62 adet erkek Wistar turu sican kullanildi. Sicanlar dortlu gruplar halinde ozel kafeslere alinarak, standart sartlarda (12 saat gunisigi, 12 saat karanlik, havalandirmali, sabit isili odalarda) bakima alindilar. Yaklasik 4 hafta sonra deneysel calismalara baslandi. Sicanlarin beslenmesinde 8 mm'lik standart sican pellet yemi kullanildi. Hayvanlar icin icme suyu olarak musluk suyu verildi. Hayvanlarin istedikleri kadar yem yemelerine ve su icmelerine izin verildi. Deneklerin agirlik artislari deney baslangicinda ve bitiminde elektronik tarti (Chyo MP-300 electronic balance, Chyo Balance Corp, Kyoto, Japan) ile olculdu.

Bu calismanin tum prosedurleri ve calisma protokolu universitemizin Deney Hayvanlan Etik Kurulu Yonergesine uygun olarak yapildi.

Deneysel protokol

Yedi grupta 8 denek ve bir grupta 6 denek olacak sekilde toplam 8 grup olusturuldu; Kontrol grubu (n=8): Sicanlara deney suresince herhangi bir islem yapilmadi. L-NNA15 (n=8): Sicanlara 10 gun sureyle icme suyunda 15mg/100ml L-NNA uygulandi. L-NNA45 (n=8): Sicanlara 10 gun sureyle icme suyunda 45mg/100ml L-NNA uygulandi. L-NNA15+KLO150 (n=8): Sicanlara 10 gun sureyle icme suyunda 15mg/100ml L-NNA+150[micro]g/100ml klonidin birlikte uygulandi. L-NNA45+KLO150 (n=8): Sicanlara 10 gun sureyle icme suyunda 45mg/100ml L-NNA+150[micro]g/100ml klonidin birlikte uygulandi. L-NNA45+KLO225 (n=8): Sicanlara 10 gun sureyle icme suyunda 45mg/100ml L-NNA+225[micro]g/100ml klonidin birlikte uygulandi. KLO150 (n=8): Sicanlara 10 gun sureyle icme suyunda 150[micro]g/100ml klonidin uygulandi. KL0225 (n=6): Sicanlara 10 gun sureyle icme suyunda 225[micro]g/100ml klonidin uygulandi. Gruplarin olusturulmasi sirasinda sicanlar rastgele secildi. Gunluk olarak her gun tum gruplarin tukettikleri icme suyu miktarlan olculdu. Kontrol grubunun ilacsiz, diger gruplarin ilacli icme sulari her gun yenilenerek tazelendi. Uygulanan konsantrasyonlara gore sicanlara verilen gunluk L-NNA ve klonidin miktarlari hesaplandi.

Kan basinci ve kalp hizi olcumu

Sicanlarin sistolik kan basinci ve kalp hizi olcumleri anestezi uygulanmadan kuyruktan indirekt "tail-cuff" yontemi ile yapildi (MAY BPHR 9610-PC Tail-Cuff Indirect Blood Pressure Recorder. Commat Ltd., Ankara, Turkiye). Sicanlarin kan basinci ve kalp hizi olcumleri L-NNA uygulamaya baslamadan once (O.gun) ve L-NNA uygulamaya basladiktan sonra 5. ve 10. gunlerde olculdu. Her bir denek tek basina olarak muhafaza edici bir kutuya kondu ve sonra denegin kuyruguna tail-cuff cihazinin cuff ve sensoru yerlestirildi. Sicanlarin kuyruklary duzenli sinyal sesi ve pulse (atim) alana kadar 37-38 Co de 10-20 dakika sureyle isitildi (MAY TWC 02 Tail Warming Controller. Commat Ltd., Ankara, Turkiye). Olcumler sessiz ve sakin laboratuvar ortaminda denegin rahat ve sakin oldugu, duzenli sinyal sesinin alindigi anda yapildi ve degerler bilgisayara kaydedildi. Sicanlardan en az beser olcum alinip herbir sican icin bu degerlerin ortalamalan hesaplandi.

Cerrahi uygulamalar

Deney sonunda denekler 1,2 g/kg i.p. uretan anestezisi ile uyutuldu. Hayvanlar tam olarak anesteziye girdikten sonra sirt ustu yatirilarak hizli bir sekilde karin ve gogus boslugu orta hattan acildi. Plazma NOx olcumu icin kalpten yaklasik 2 ml kan ornegi EDTA'li tuplere alindi. Torasik aorta diafragmanin uzerinden baslayarak arkus aortaya kadar diseke edilerek hizli bir sekilde cikarildi.

Izometrik olcumler

Torasik aorta cikarildiktan sonra soguk Krebs-Ringer bikarbonat solusyonu icine alinarak cevre bao ve destek dokularindan dikkatlice temizlendi. Torasik aorta temizlendikten sonra abdominal aortaya yakin uctan yaklasik 4 mm boyunda halka halinde kesildi. Torasik aortadan elde edilen 4 mm boyundaki halkalar, lumeninden birbirine paralel iki paslanmaz cengel gecirilerek icerisinde 37[degrees]C'de isitilmis ve %95 O2+%5 C[O.sub.2] karisimi ile gazlandirilan Krebs-Ringer bikarbonat solusyonu bulunan 20 ml'lik izole organ banyosuna asildi. Alt cengel izole organ banyosunun tutma kismina tutturuldu, ust cengel ise izometrik kasilma cevaplarini kaydetmek icin transdusere (Grass FT 0.03 Force-Displacement Transducer) baglandi. Kayitlar poligraf ile yapildi (Grass Model 79 Polygraph). Krebs-Ringer bikarbonat solusyonu pH=7.4 olacak sekilde (mmol/L) 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 K[H.sub.2]P[O.sub.4], 25 NaHC[O.sub.3], 10.1 Dekstroz, 2.5 Ca[Cl.sub.2]2[H.sub.2]O, 1.2 MgS[O.sub.4]7[H.sub.2]O icermektedir. Izole organ banyosuna asilan torasik aorta halkalari 2 gramlik optimal istirahat gerimi altinda 1 saat boyunca dengelendi. Izole organ banyosunda metabolik son urunlerin birikimini onlemek icin banyodaki Krebs-Ringer bikarbonat solusyonu yaklasik 15 dakika arayla tazelendi.

Sican torasik aorta halkalari dengelendikten sonra, tek doz fenilefrinle ([10.sup.7]M) on kasilma uygulanmis preparatlar asetilkolinle ([10.sup.-6]M) test edilerek endotel tabakasinin saglamligi teyit edildi. Test islemini takiben yikama yapilip preparat dengelendikten sonra klonidin artan konsantrasyonlarda ([10.sup.-9]-[10.sup.-5] M) banyoya uygulanarak konsantrasyon cevap egrileri elde edildi. Yikama yapildi ve preparatlar dengelendikten sonra fenilefrin artan konsantrasyonlarda ([10.sup.-9]-[10.sup.-4] M) banyoya uygulanarak konsantrasyon cevap egrileri elde edildi.

Plazma NOx olcumu

Sicanlardan alinan kan orneklerinin plazma NOx konsantrasyonlari daha once laboratuvarimizda calisilan Cortas ve Wakid'in bildirdigi yontemle tespit edildi (20, 21). Kisaca ozetlenirse, alinan kanlar ETDA'li tuplere konularak 5000g'de santrufuj edildi. Plazmalar ayrilarak olcum yapilana kadar -20[degrees]C saklandi. Olcumlerde kullanilan tum cozeltiler titizlikle hazirlandi. Olcum sirasinda plazmalardan 250 [micro]l alinarak uzerine 1ml cinko sulfat cozeltisi eklenip vortekslendikten sonra 1,250 [micro]l sodyum hidroksit cozeltisi ilave edildi. 3500g'de 10 dakika boyunca santrifuj edildikten sonra ustteki cozelti kismi alinarak uzerine 2 ml distile su 1 ml glisin tamponu eklenerek yikanmis kadmiyum granullerinin uzerine eklendi. Doksan dakika boyunca karanlikta inkube edildikten sonra 2 ml indirgenmis cozelti alinarak uzerine 1 ml sulfanilamid 1ml naftiletilendiamin cozeltisi 0.5 ml distile su ilave edildi. Ornekler 20-60 dakika bekletildikten sonra 545 nm dalgaboyunda olcum yapildi.

Kullanilan kimyasallar

Fenilefrin, asetilkolin, klonidin, L-NNA, N-(-1naphthyl)-etilendiamin dihidroklorid, glisin hidroklorid, uretan (Sigma Aldrich Inc.St. Louis, MO, USA), sulfirikasit, hidroklorik asit, bakir sulfat pentahidrat, sodyum nitrit, sodyum hidroksit, sulfanil amid (Merck. KgaA, Germany), granul kadmiyum (Fluka Chemie, Steinheim, Switzerland), cinko sulfat heptahidrat (Carlo Erba, Milano, Italy) satin alindi.

[ILLUSTRATION OMITTED]

Istastistiksel analiz

Elde edilen veriler ortalama [+ or -] standart hata olarak belirlendi. EC50 degerleri "Origin 5.0" istatistik programi ile degerlendirildi. Elde edilen verilerin istatistiksel anlamlilyk duzeyleri "SPSS for Windows version 12" (Chicago, IL, USA) istatistik programi kullanilarak belirlendi. Kan basinci verileri Student t testi, kalp hizi verileri ise nonparametrik Wilcoxon testi ile, in vitro veriler ve plazma NOx duzeyi sonuclari da tek yonlu varyans analizi (ANOVA) ve post hoc Bonferroni testi ile degerlendirildi. p<0.05 degerler istatistiksel olarak anlamli kabul edildi.

Bulgular

Hem dusuk, hem de yuksek doz L-NNA alan sicanlarda sistolik kan basinci 5. ve 10. gunlerde baslangica gore progresif olarak artti (Sekil 1, 2). Bununla birlikte beklendigi gibi L-NNA45 grubunda kan basincindaki artis daha fazia oldu. L-NNA ile birlikte klonidin verildiginde kan basinci klonidin dozuna bagimli olarak dustu. Tek basina klonidin uygulamasynda ise her iki dozda da kan basincinda bir degisiklik tespit edilmedi (Sekil 3). Tek basina hem dusuk, hem de yuksek doz L-NNA verilen gruplarin kalp hizinda doz bagimli olmayan, benzer oranda anlamli bir dusme meydana geldi. Tek basina klonidin uygulamalari ise kalp hizini degistirmedi. Ustelik klonidin L-NNA uygulamalari sonucunda dusmus olan kalp hizinda da bir degisiklige neden olmadi (Tablo 1).

[ILLUSTRATIONS OMITTED]

Izole torasik aorta deneylerinde dusuk doz L-NNA uygulanmis sicanlarda fenilefrinin EC50 degeri (p=0.002), yuksek doz L-NNA uygulanmis sicanlarda ise hem fenilefrin (p=0.001), hem de klonidinin (p=0,003) EC50 degerleri dustu (Tablo 2). Hem dusuk, hem de yuksek doz L-NNA ile birlikte dusuk doz klonidin verilen gruplarda fenilefrinin EC50 degerlerindeki bu azalma ortadan kalkti. Fakat yuksek doz L-NNA ve yuksek doz klonidin verilen grupta fenilefrinin EC50 degeri dusuk kalmaya devam etti (p=0.002). Tek basina dusuk doz klonidin alan grupta klonidinin EC50 degerinde azalma olurken (p=0.009), yuksek doz klonidin verilen grupta ise fenilefrinin hem Emax (p=0.036), hem de EC50 (p=0.001) degerinde bir azalma tespit edildi. Tum gruplarda, KLO225 grubu haric, fenilefrinin ve klonidinin Emax degerlerinde bir degisiklik olmady. Sadece dusuk doz L-NNA alan grupta plazma NOx degerlerinde bir artma olurken diger gruplarda ise herhangi bir degisiklik tespit edilmedi (Tablo 3).

Tartisma

Bu calismada klonidin L-NNA uygulamasi ile olusan hipertansiyonun gelisimini doz bagimli olarak onlerken kalp hizinda meydana gelen anlamli dususu etkilemedi. Tek basina klonidin uygulanan normotansif sicanlarin kan basinci ve kalp hizinda ise bir degisiklik meydana gelmedi. Plazma NOx seviyesi L-NNA15 grubunda artti, diger gruplarda ise degismedi. Aorta halkalarinin "in vitro" deneylerde L-NNA45 grubunda hem fenilefrine, hem de klonidine, L-NNA15 grubunda ise yalnizca fenilefrine duyarliginyn arttigi belirlendi. KLO150 grubunda aorta halkalarinin klonidine, KLO225 grubunda ise fenilefrine duyarligi artti. Bu sonuclar, klonidinin L-NNA uygulamasiyla meydana gelen hipertansiyon gelisimini doz bagimli bir sekilde onlemesi ve normotansif kontrol sicanlarin kan basinclarinda bir degisiklik yapmamasi, L-NNA uygulamasiyla gelisen hipertansiyondan sorumlu mekanizmalardan birisinin sempatik aktivite artisi olduguna isaret etmektedir.

Izole torasik aortada, in vivo dusuk doz klonidin uygulamasi klonidinin duyarliliginda bir artis yaparken, yuksek doz klonidin uygulamasi fenilefrin duyarliginda bir artisa ve fenilefrinin maksimum kasilma yanitinda bir azalmaya neden olmustur. Klonidinin parsiyel [alpha]1-adrenerjik reseptor agonisti ozellik gosterdigi ve bu etkisinin doz bagimli ortaya ciktigini ileri suren calismalar vardir (22). Bu calismada da yuksek doz klonidin uygulanan sicanlarda maksimum fenilefrin yanitinin anlamli olarak azalmasi parsiyel agonistik etkiyi dusundurmektedir. Dusuk doz ve yuksek doz klonidin verilen sicanlarda fenilefrinin [EC.sub.50] degerinde farkliligin nedeni yeterince acik olmamakla birlikte, fenilefrin duyarligindaki artisin klonidinin sempatolitik etkinliginin bir sonucu olabilecegine onceki calismalarda isaret edilmistir (23-25). Klonidinin tek basina normotansif kontrol grubu sicanlarda hipotansiyon olusturmamasi, alfa-adrenerjik reseptor duyarliklarindaki bu degisikliklerden kaynaklaniyor olabilir.

On gun sureyle L-NNA uygulamasi Emax degisikligi yapmaksizin [alpha]1- ve [alpha]2- adrenerjik reseptorlerde duyarlik artisi meydana getirmektedir. Dusuk doz L-NNA alan grupta torasik aortada [alpha]1-adrenerjik reseptor duyarligi artarken, yuksek doz L-NNA alan grupta ise hem [alpha]1-adrenerjik reseptor, hem de [alpha]2-adrenerjik reseptor duyarliginda artis tespit edilmistir. Yuksek doz L-NNA uygulamasi ile [alpha]1-adrenerjik reseptore ilaveten [alpha]2-adrenerjik reseptore de bir duyarlyk artisi soz konusudur. Bulgularimiz yuksek doz NOS inhibitoru uygulanan (L-NAME 60 mg/kg/gun, 14 gun) sicanlarin endotelyumu tahrip edilmis torasik aorta halkalarinda [alpha]2-adrenerjik reseptor duyarliginda bir artisin oldugunu gosteren calismayla uyumludur (3). Bu veriler NOS inhibisyonu aracili hipertansiyondan vaskuler yataklardaki vazokonstriksiyon artisinin sorumlu olabilecegi gorusunu de desteklemektedir (26).

Mevcut calismada L-NNA uygulanmasiyla gelisen hipertansiyonda kalp hizi anlamli olarak dusmektedir. NOS inhibisyonu sonucu kalp hizinda genellikle dusme meydana geldigi bildirilmektedir (27-30). Ancak klonidin uygulamasiyla kan basinci normale donmesine ragmen kalp hizi dusuk kalmaya devam etmistir. Kalp hizini kontrol eden sistemlerin kan basincini duzenleyen sistemlere gore klonidine daha az duyarli olduguna isaret eden calismalar bu sonucu destekler niteliktedir (31, 32). Kalp hizinin ve kan basincinin duzenlenmesinin kismen birbirinden bagimsiz olmasi da soz konusudur (22). Gercekten de onceki calysmamizda L-NNA dozu sicanlara kademeli bir sekilde artirilarak uygulandiginda kan basincinin yukselmesine ragmen kalp hizinda bir dususun olmadigi gosterildi (33).

Bu calismada dusuk doz L-NNA alan grupta plazma NOx seviyesi artarken, yuksek doz L-NNA alan grupta ise herhangi bir degisiklik gorulmemistir. Yuksek doz L-NNA uygulamasiyla plazma NOx seviyesinin degismemesinin nedeni yeterince acik degildir. Plazma NOx duzeyi olcumunun NO aktivitesini yeterince yansitmamasi olasiligi soz konusu olabilir. Ancak bizim bulgularimizi destekleyen daha onceki calismalarda L-NNA benzeri non-spesifik bir NOS inhibitoru olan L-NAME sicanlara yuksek dozlarda uygulandiginda plazma NOx duzeylerinde bir degisiklik meydana gelmedigi gosterilmistir (34, 35). Dusuk doz kronik L-NNA uygulamasiyla hipertansiyon olusturulan sicanlarin plazma NOx seviyesindeki artis, Moncada'nin "dusuk doz NOS inhibitoru uygulandiginda plazma NOx seviyesinin yukselmesinin nedeni artmis vazokonstriktor etkinligi kompanse etmek amaciyla daha fazia NO uretilmesidir" yorumuyla uyumludur (36).

Gunumuzde klonidinin kan basinci ve damarlara etkileri uzerine cok sayida mekanizma ileri surulmustur. Klonidinin damarlarda NO-cGMP yolaginin ve bazi potasyum kanal tiplerinin aktivitesini artirdigi, hatta prostaglandin salinimini etkileyerek vazodilator etki gosterdigi bildirilmektedir (37, 38). Klonidinin damarlar uzerindeki gevsetici etkisinin hem endotel bagimli, hem de bagimsiz mekanizmalarla meydana geldigine isaret edilmektedir (39). Ayrica uzun sureli klonidin uygulamasi noradrenalin disinda dopamin, serotonin ve GABA norotransmitter saliniminda degisikliklere neden olabilmekte (40) ve klonidin, azalmis olan GABA sentezini artirarak hipertansiyonu geri dondurebilmektedir (41). Bu nedenle, klonidinin L-NNA aracili hipertansiyon gelisimini onlemesinde bu olumlu etkilerinin de olasi katkilari dislanamaz.

Sonuclar

Bu bulgular NOS inhibisyonu aracili hipertansiyonun gelisiminden sorumlu mekanizmalardan birinin sempatik sinir sistemi aktivasyonu oldugu gorusunu desteklemekte ve uzun sureli L-NNA uygulamasi ile olusan kalp hizi dususunun gelisen hipertansiyondan bagimsiz olabilecegine isaret etmektedir. Sonuc olarak klonidinin uzun sureli NOS inhibisyonu aracili hipertansiyonun gelisimini doz bagimli olarak onledigi bu calismada ilk kez gosterilmistir.

Kaynaklar

(1.) Vapaatalo H, Mervaala E, Nurminen ML. Role of endothelium and nitric oxide in experimental hypertension. Physiol Res 2000; 49:1-10.

(2.) Zatz R, Baylis C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension 1998; 32: 958-64.

(3.) Kanagy NL. Increased vascular responsiveness to alpha 2-adrenergic stimulation during NOS inhibition-induced hypertension. Am J Physiol 1997; 273: H2756-64.

(4.) Tugrul Y. Sicanlarda uzun sureli nitrik oksid sentaz (NOS) ve siklooksijenaz (COX) enzimlerinin birlikte inhibisyonu (ko-inhibisyon) sonucu kan basinci ve alfa adrenerjik agonistlere karsi gelisen vaskuler cevaplar. Elazig, Firat Univ (Tez). 2002

(5.) Mendizabal VE, Feleder EC, Adler-Graschinsky E. Effects of the chronic in vivo administration of L-NAME on the contractile responses of the rat perfused mesenteric bed. J Auton Pharmacol 1999;19: 241-8.

(6.) Yuasa S, Li X, Hitomi H, Hashimoto M, Fujioka H, Kiyomoto H, et al. Sodium sensitivity and sympathetic nervous system in hypertension induced by long-term nitric oxide blockade in rats. Clin Exp Pharmacol Physiol 2000; 27:18-24.

(7.) Liu Y, Tsuchihashi T, Kagiyama S, Matsumura K, Abe I, Fujishima M. Central and peripheral mechanisms involved in hypertension induced by chronic inhibition of nitric oxide synthase in rats. J Hypertens 1998; 16:1165-73.

(8.) Aksulu HE, Bingol I, Karatas F, Saomanligil H, 0stundag B. Changes in plasma angiotensin-converting enzyme activity and noradrenaline responses to long-term nitric oxide inhibition vary depending on their basal values in chickens. Physiol Res 2000; 49: 175-82.

(9.) Zanchi A, Schaad NC, Osterheld MC, Grouzmann E, Nussberger J, Brunner HR, et al. Effects of chronic NO synthase inhibition in rats on renin-angiotensin system and sympathetic nervous system. Am J Physiol 1995; 268: H2267-73.

(10.) Moriguchi S, Ohzuru N, Koga N, Honda K, Saito R, Takano Y, et al. Central administration of a nitric oxide synthase inhibitor causes pressor responses via the sympathetic nervous system and the renin-angiotensin system in Wistar rats. Neurosci Lett 1998;245:109-12.

(11.) Deniz E, Sahna E, Aksulu HE. Nitric oxide synthase inhibition in rats: melatonin reduces blood pressure and ischemia/reperfusion-induced infarct size. Scand Cardiovasc J 2006; 40: 248-52.

(12.) Takase H, Moreau P, Kung CF, Nava E, Luscher TF. Antihypertensive therapy prevents endothelial dysfunction in chronic nitric oxide deficiency. Effect of verapamil and trandolapril. Hypertension 1996; 27: 25-31.

(13.) Kato M, Matsumoto A, Nakajima T, Hirose K, Iwasawa K, Takenaka K, et al. Amlodipine increases nitric oxide production in exhaled air during exercise in patients with essential hypertension. Am J Hypertens 2004; 17: 729-33.

(14.) Giles TD. Aspects of nitric oxide in health and disease: a focus on hypertension and cardiovascular disease. J Clin Hypertens (Greenwich) 2006; 8: 2-16.

(15.) Smith LJ, Sussman AM, Serra M, Buccafusco JJ. Long term treatment with clonidine during the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 1985; 47: 457-60.

(16.) Ishii R, Naruse T, Tagawa T, Yamahata T, Dote S, Hamada K, et al. Antihypertensive effects of a new transdermal delivery system for clonidine (M-5041T) in spontaneously hypertensive rats. Arch Int Pharmacodyn Ther 1994; 327: 294-308.

(17.) Jin HK, Yang RH, Wyss JM, Chen YF, Oparil S. Intrahypothalamic clonidine infusion prevents NaCl-sensitive hypertension. Hypertension 1991; 18: 224-9.

(18.) Thomas L, Gasser B, Bousquet P, Monassier L. Hemodynamic and cardiac anti-hypertrophic actions of clonidine in Goldblatt one-kidney, one-clip rats. J Cardiovasc Pharmacol 2003; 41: 203-9.

(19.) DeQuattro V, Li D. Sympatholytic therapy in primary hypertension: a user friendly role for the future. J Hum Hypertens 2002; 16 Suppl 1: S118-23.

(20.) Yilmaz E. Sicanlarda plazma nitrik oksit duzeylerinin olcumu: Elektrokimyasal ve spektrofotometrik yontemlerin karsilastirilmasi. Elazig, Firat Universitesi, 2004.

(21.) Cortas NK, Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmium-reduction method. Clin Chem 1990; 36:1440-3.

(22.) Pompermayer K, Salgado MC, Feldman J, Bousquet P. Cardiovascular effects of clonidine-like drugs in pithed rabbits. Hypertension 1999; 34: 1012-5.

(23.) Guthrie GP Jr, Kotchen TA. Effects of prazosin and clonidine on sympathetic and baroreflex function in patients with essential hypertension. J Clin Pharmacol 1983; 23: 348-54.

(24.) Davies IB, Sudera D, Sever PS. Endogenous agonist regulation of alpha-adrenoceptors in man. Clin Sci (Lond) 1981; 61 Suppl 7:207s-10s.

(25.) Parlow JL, Sagnard P, Begou G, Viale JP, Quintin L. The effects of clonidine on sensitivity to phenylephrine and nitroprusside in patients with essential hypertension recovering from surgery. Anesth Analg 1999; 88:1239-43.

(26.) Ramchandra R, Barrett CJ, Malpas SC. Nitric oxide and sympathetic nerve activity in the control of blood pressure. Clin Exp Pharmacol Physiol 2005; 32: 440-6.

(27.) Dananberg J, Sider RS, Grekin RJ. Sustained hypertension induced by orally administered nitro-L-arginine. Hypertension 1993; 21: 359-63.

(28.) Hu L, Manning RD Jr, Brands MW. Long-term cardiovascular role of nitric oxide in conscious rats. Hypertension 1994; 23: 185-94.

(29.) Loichot C, Cazaubon C, Grima M, De Jong W, Nisato D, Imbs JL, et al. Vasopressin does not effect hypertension caused by long-term nitric oxide inhibition. Hypertension 2000; 35: 602-8.

(30.) Matsuoka H, Nishida H, Nomura G, Van Wet BN, Toshima H. Hypertension induced by nitric oxide synthesis inhibition is renal nerve dependent. Hypertension 1994; 23: 971-5.

(31.) Jarrott B, Lewis SJ, Doyle AE, Louis WJ. Effects of continuous infusions (10 days) and cessation of infusions of clonidine and rilmenidine (S 3341) on cardiovascular and behavioral parameters of spontaneously hypertensive rats. Am J Cardiol 1988; 61: 39D-44D.

(32.) Kooner JS, Birch R, Frankel HL, Peart WS, Mathias CJ. Hemodynamic and neurohormonal effects of clonidine in patients with preganglionic and postganglionic sympathetic lesions. Evidence for a central sympatholytic action. Circulation 1991; 84: 75-83.

(33.) Oktar S YE, Sahna E, Aksulu HE. NOS Inhibisyonu Aracili Hipertansiyon: Sicanlarda Sabit ve Kademeli doz L-NNA Uygulamalarinin Karsilastinlmasi. Firat Tip Dergisi 2007;12: 251-5.

(34.) Eum HA, Yeom DH, Lee SM. Role of nitric oxide in the inhibition of liver cytochrome P450 during sepsis. Nitric Oxide 2006;15: 423-31.

(35.) Chan CY, Huang SW, Wang TF, Lu RH, Lee FY, Chang FY, et al. Lack of detrimental effects of nitric oxide inhibition in bile duct-ligated rats with hepatic encephalopathy. Eur J Clin Invest 2004; 34: 122-8.

(36.) Moncada S. Nitric oxide: discovery and impact on clinical medicine. J R Soc Med 1999; 92: 164-9.

(37.) Pimentel AM, Costa CA, Carvalho LC, Brandao RM, Rangel BM, Tano T, et al. The role of NO-cGMP pathway and potassium channels on the relaxation induced by clonidine in the rat mesenteric arterial bed. Vascul Pharmacol 2007; 46: 353-9.

(38.) Hermann D, Schlereth T, Vogt T, Birklein F. Clonidine induces nitric oxide- and prostaglandin-mediated vasodilation in healthy human skin. J Appl Physiol 2005; 99: 2266-70.

(39.) Molin JC, Bendhack LM. Clonidine induces rat aorta relaxation by nitric oxide-dependent and-independent mechanisms. Vascul Pharmacol 2004; 42:1-6.

(40.) Iwasaki E, Takasugi Y, Koga Y. [Alteration of neurotransmitters in the cerebrospinal fluid in SHRSP rats due to long-term administration of clonidine]. Masui 2006; 55: 330-7.

(41.) Gozlinska B, Czyzewska-Szafran H. Clonidine action in spontaneously hypertensive rats (SHR) depends on the GABAergic system function. Amino Acids 1999;17: 131-8.

Suleyman Oktar, Selcuk Ilhan, Hakky Engin Aksulu

Firat Universitesi Tip Fakultesi, Farmakoloji Anabilim Dali, Elazig, Turkiye

Yazisma Adresi/Address for Correspondence: Dr. Suleyman Oktar, Firat Universitesi Tip Fakultesi, Farmakoloji Anabilim Dali, Elazig, Turkiya Tel.: [phone] E-posta: [e-mail]

Tablo 1. Tum gruplarin kalp hizi (vuru/dak) degerieri

Gruplar                0. Gun            10.gun            p
                                                       0.-10.gun

Kontrol            317 [+ or -] 5    315 [+ or -] 5       AD
n=8                316 (300-340)     315 (296-348)

L-NNA15            328 [+ or -] 8   281 [+ or -] 6 *     <0.01
n=8                325 (292-356)     258 (252-306)

L-NNA45            334 [+ or -] 7    299 [+ or -] 9      <0.05
n=8                340 (304-372)     274 (268-352)

L-[NNA.sub.15+]    316 [+ or -] 8   268 [+ or -] 5 *     <0.01
[KLO.sub.150]      314 (284-350)     280 (252-284)
n=8

L-[NNA.sub.45+]    332 [+ or -] 6   280 [+ or -] 4 *    <0.001
[KLO.sub.150]      334 (308-356)     262 (262-294)
n=8

L-[NNA.sub.45+]    323 [+ or -] 7    292 [+ or -] 6      <0.01
[KLO.sub.225]      328 (288-352)     298 (272-360)
n=8

[KLO.sub.150]      335 [+ or -] 6   328 [+ or -] 10       AD
n=8                340 (304-360)     317 (300-372)

[KLO.sub.225]      330 [+ or -] 8    327 [+ or -] 4       AD
n=6                339 (300-368)     315 (300-368)

Degerler Ortalama [+ or -] Standart Hata ve Mediyan (Maksimum-
Minimum) olarak gosterilmistir. Gruplara rasi karsilastirmalar
icin nonparametrik Wilcoxon testi kullanilmistir.

n: Her bir gruptaki sican sayisini gostermektedir.

*--p<0.01- Kontrole gore anlamli olarak farklidir.

AD--anlamli degil, KLO--klonidin, L-NNA--N (omega)-nitro-L-arjinin

Gruplar: Kontrol, 10 gun boyunca herhangi bir uygulama yapilmadi.
L-[NNA.sub.15], 10 gun boyunca yaklasik 15mg/100ml konsantrasyonunda
L-NNA verildi. [LNNA.sub.45], 10 gun boyunca yaklasik 45mg/100ml
konsantrasyonunda L-NNA verildi. [LNNA.sub.15] + [KLO.sub.150], 10 gun
boyunca yaklasik 15mg/100ml L-NNA+150 [micro]g/100ml
konsantrasyonunda klonidin verildi. [LNNA.sub.45] + [KLO.sub.150],
10 gun boyunca yaklasik 45mg/100ml L-NNA + 150 [micro]g/100ml
konsantrasyonunda klonidin verildi.
[LNNA.sub.45] + [KLO.sub.225], 10 gun boyunca yaklasik 45mg/100
ml L-NNA + 225 [micro]g/100m1 konsantrasyonunda klonidin verildi.
[KLO.sub.150], 10 gun boyunca yaklasik 150 [micro]g/100ml
konsantrasyonunda klonidin verildi. [KLO.sub.225], 10 gun boyunca
yaklasik 225 [micro]g/100ml konsantrasyonunda klonidin verildi

Tablo 2. Tum gruplar icin izole torasik aorta halkalarinin
EC50 ve Emax degerleri

                           Fenilefrin                      p **
                                                        Fenilefrin
Gruplar          Emax, g              EC50 (log)           EC50

Kontrol     1.54 [+ or -] 0.08   -6.37 [+ or -] 0.13
n=6

L-NNA15     1.31 [+ or -] 0.13   -6.94  [+ or -] 0.13     0.002
n=8

L-NNA45     1.46 [+ or -] 0.18   -7.33 [+ or -] 0.11      0.001
n=5

L-NNA15 +   1.52 [+ or -] 0.11   -6.54 [+ or -] 0.22        AD
KLO150
n=8

L-NNA45 +   1.46 [+ or -] 0.18   -6.86 [+ or -] 0.52        AD
KLO150
n=7

L-NNA45 +   1.63 [+ or -] 0.27   -7.33 [+ or -] 0.24      0.001
KLO225
n=6

KLO150      1.54 [+ or -] 0.17   -6.98 [+ or -] 0.11        AD
n=4

KLO225      1.21 [+ or -] 0.09   -7.93 [+ or -] 0.16      0.001
n=4

F *                0.57                  1.06

p *                0.77                  0.41

                             Klonidin
                                                           p **
Gruplar          Emax, g              EC50 (log)         Klonidin
                                                           EC50

Kontrol     0.47 [+ or -] 0.09   -6.40 [+ or -] 0.15
n=6

L-NNA15     0.64 [+ or -] 0.09   -6.79 [+ or -] 0.15        AD
n=8

L-NNA45     0.97 [+ or -] 0.27   -7.60 [+ or -] 0.27      0.003
n=5

L-NNA15 +   0.76 [+ or -] 0.11   -6.35 [+ or -] 0.13        AD
KLO150
n=8

L-NNA45 +     Belirlenemedi         Belirlenemedi           --
KLO150
n=7

L-NNA45 +   0.78 [+ or -] 0.13   -6.95 [+ or -] 0.39        AD
KLO225
n=6

KLO150      0.79 [+ or -] 0.19   -7.20 [+ or -] 0.10      0.009
n=4

KLO225      0.21 [+ or -] 0.04   -6.47 [+ or -] 0.21        AD
n=4

F *                2.39                  1.76

p *                0.05                  0.13

Degerler Ortalama [+ or -] Standart Hata olarak gosterilmistir

*--one-way ANOVA testi F ve p degerieri

**--kontrol grubu He karsilastirmalar icin post-hoc Bonferroni testi

AD--anlamh degil, KLO--klonidin, L-NNA-N (omega)-nitro-L-arjinin

Gruplar: Kontrol, 10 gun boyunca herhangi bir uygulama
yapilmadi. L-NNA15, 10 gun boyunca yaklasik 15mg/100ml
konsantrasyonunda L-NNA verildi. LNNA45, 10 gun boyunca
yaklasik 45mg/100ml konsantrasyonunda L-NNA verildi. LNNA15 +
KLO150, 10 gun boyunca yaklasik 15mg/100ml L-NNA + 150 [micro]g/
100ml konsantrasyonunda klonidin verildi. LNNA45 + KLO150,10
gun boyunca yaklasik 45mg/100ml L-NNA + 150 [micro]g/100ml
konsantrasyonunda klonidin verildi. LNNA45 + KLO225, 10 gun
boyunca yaklasik 45mg/100ml L-NNA + 225 [micro]g/100ml
konsantrasyonunda klonidin verildi. KLO150, 10 gun boyunca
yaklasik 150 [micro]g/100ml konsantrasyonunda klonidin verildi.
KLO225, 10 gun boyunca yaklasik 225 [micro]g/100ml
konsantrasyonunda klonidin verildi

Tablo 3. Tum gruplarin plazma NOx degerleri

Gruplar            Plazma NOx, [micro]mol/L   p **

Kontrol            0.25 [+ or -] 0.01
n=7

L-NNA15            0.62 [+ or -] 0.11         0.003
n=5

L-NNA45            0.26 [+ or -] 0.03          AD
n=8

L-NNA15 + KLO150   0.45 [+ or -] 0.10          AD
n=8

L-NNA45 + KLO150   0.21 [+ or -] 0.01          AD
n=8

L-NNA45 + KLO225   0.22 [+ or -] 0.02          AD
n=8

KLO150             0.25 [+ or -] 0.01          AD
n=8

KLO225             0.34 [+ or -] 0.08          AD
n=6

F *                       4.92

D *                      -0.05

Degerler Ortalama [+ or -] Standart Hata olarak gosterilmistir.

*--one-way ANOVA testi F ve p degerleri

**--kontrol grubu He karsilastirmalar icin post-hoc
Bonferroni testi

AD--anlamh degil, KLO--klonidin, L-NNA--N (omega)-nitro-L-arjinin,
NOx--Nitrit/Nitrat

Gruplar: Kontrol, 10 gun boyunca herhangi bir uygulama yapilmadi.
L-NNA15, 10 gun boyunca yaklasik 15mg/100ml konsantrasyonunda
L-NNA verildi. LNNA45, 10 gun boyunca yaklasik 45mg/100ml
konsantrasyonunda L-NNA verildi. LNNA15 + KLO150, 10 gun boyunca
yaklasik 15mg/100ml L-NNA + 150 [micro]g/100ml konsantrasyonunda
klonidin verildi. LNNA45 + KLO150, 10 gun boyunca yaklasik 45mg/
100ml L-NNA + 150 [micro]g/100ml konsantrasyonunda klonidin
verildi. LNNA45 + KLO225, 10 gun boyunca yaklasik 45mg/100 ml
L-NNA + 225 [micro]g/100ml konsantrasyonunda klonidin verildi.
KLO150, 10 gun boyunca yaklasik 150 [micro]g/100ml konsantrasyonunda
klonidin verildi. KLO225, 10 gun boyunca yaklasik 225 [micro]g/100ml
konsantrasyonunda klonidin verildi