Alteracoes morfologicas do sistema nervoso central induzidas em camundongos por Trypanosoma cruzi.

Introdução

O primeiro relato de parasitismo, no sistema nervoso central (SNC), por Trypanosoma cruzi (T. cruzi), foi descrito em seres humanos por Chagas (1911). Estudos posteriores indicaram maior susceptibilidade de crianças até dois ou quatro anos de idade à meningoencefalite chagásica (Prata, 1994). Durante a fase aguda da infecção com comprometimento do SNC, descrevem-se encefalomielite com a presença de parasitas, lesões degenerativas com proliferação glial, hemorragia e infiltração linfocitária perivascular e das leptomeninges (Pittella, 1993).

Parasitismo experimental do SNC por T. cruzi tem sido fartamente descrito, especialmente em ratos (Jardim, 1971; De Oliveira et al., 2002; Rivera et al., 2004) e camundongos (Alencar e Elejalde, 1960; Jardim, 1967). Ratos e camundongos com menos de 25 dias de idade são mais susceptíveis à infecção por T. cruzi, apresentando parasitismo encefálico e parasitemia mais elevada (Culbertson e Kessler, 1942; Costa et al., 1986; Da Mata et al., 2000). Alterações encefálicas intensas em ratos infectados aos dez dias de idade foram constatadas por Da Mata et al. (2000).

O comprometimento do SNC, durante a fase aguda da infecção chagásica, é evidenciado pela presença de formas amastigotas e reação inflamatória em forma de nódulos gliais distribuídos pelo tecido nervoso, caracterizando encefalite multifocal (Da Mata et al., 2000).

Apesar dos efetivos esforços na busca por tratamento mais adequado, a tripanossomíase americana ainda constitui um problema de saúde pública. É reconhecida, atualmente, como doença negligenciada (DNDi, 2006), está distribuída pela América Latina e afeta milhões de pessoas com alto impacto de morbidade e mortalidade (Dias et al., 2002). Por outro lado, o curso da infecção depende, pelo menos em parte, das características intrínsecas de cada isolado de T. cruzi (Dias et al., 2002). Estes fatos justificam e explicam o vasto número de pesquisas básicas que abordam a doença de Chagas.

Este trabalho objetivou avaliar o comprometimento do SNC por T. cruzi e contribuir na caracterização de um isolado deste parasito, o qual foi obtido de um paciente portador da forma cardiodigestiva da doença de Chagas.

Material e métodos

Utilizaram-se 48 camundongos Swiss webster, de ambos os gêneros. Foram constituídos grupos de cinco animais cada um, submetidos aos tratamentos, que receberam ração (labina-purina) e água à vontade até o sacrifício. Foram avaliados a parasitemia, o peso dos animais e as alterações no SNC em animais sem e com imunossupressão por ciclofosfamida dissolvida em salina e administrada intraperitonealmente na dosagem de 100 mg [kg.sup.-1] de peso corporal no 5[degré] dia de infecção (Calabrese et al., 1991). Os animais foram inoculados com 4 x [10.sup.3] ou 2 x [10.sup.5] tripomastigotas de um isolado de T. cruzi, obtido de um paciente portador da forma cardiodigestiva da doença de Chagas (Oliveira et al., 1993). A parasitemia foi avaliada em dias alternados, a partir do terceiro dia da inoculação (Brener, 1962). Os animais foram sacrificados no 23[degré] dia após a inoculação, em anestesia com cloral hidratado, perfundidos e fixados com paraformaldeído a 4%. Foram analisados fragmentos do encéfalo e medula espinhal nos níveis cervical, torácico e lombar. Estes fragmentos foram submetidos à técnica histológica, incluídos em parafina e confeccionaram-se lâminas, as quais foram coradas com hematoxilina-eosina. O material foi analisado em microscopia de luz com aumento de 300 X. Os dados quantitativos foram tratados pelo teste "t" de Student.

Resultados

Animais inoculados aos dez dias de idade com 4 x [10.sup.3] ou 2 x [10.sup.5] tripomastigotas apresentaram ganhos de peso semelhante, porém menores que os animais-controle (Tabela 1).

De modo semelhante, animais inoculados aos 25 dias com ambos os inóculos também não apresentaram diferenças entre si no ganho de peso, porém estes foram menores que seus controles. Já a imunossupressão, no 5[degré] dia após o inóculo, determinou menor ganho de peso tanto em relação aos animais apenas inoculados quanto aos animais controles (Tabela 2). Não houve mortes em nenhum dos grupos experimentais.

A inoculação de 4 x [10.sup.3] tripomastigotas aos 25 dias de idade induziu curva parasitêmica com início no 7[degré] dia; já para o mesmo inóculo com imunossupressão no 5[degré] dia de infecção, assim como com o inóculo de 2 x [10.sup.5], o início da parasitemia também foi observado no 5[degré] dia após o inóculo (Figura 1).

Os valores da parasitemia média observados no pico em animais com 25 dias de idade infectados com o menor inóculo (720,3) e com o maior inóculo (899,64) não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, mas foram menores que aqueles apresentados por animais igualmente inoculados com 4 x [10.sup.3] aos 25 dias de idade, porém imunossuprimidos no 5[degré] dia de infecção (2.176,77).

Foi observado ninho de amastigotas íntegro sem esboço de reação inflamatória (Figura 2A) e por infiltrados perivasculares. Alterações encefálicas se caracterizaram por reação tecidual, em forma de nódulos gliais distribuídos, tanto na substância branca quanto na cinzenta (Figura 2B).

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

A natureza das células constituintes dos infiltrados perivasculares não está estabelecida. Na região mais periférica do córtex cerebral, observouse infiltrado inflamatório que envolve a piamáter, o qual se expandiu na camada molecular constituindo nódulos gliais subpiais. No cerebelo, os nódulos gliais estiveram presentes preferencialmente na camada molecular. Os nódulos gliais e ninhos de amastigotas foram mais facilmente encontrados nos animais inoculados aos dez dias e se apresentaram com grau variado de densidade celular. As células constituintes dos nódulos gliais, em microscopia de luz, não puderam ser identificadas. Não foram observados nódulos ou ninhos de amastigotas na medula espinhal ou no plexo corioide. Os animais inoculados aos 25 dias de idade, com qualquer um dos inóculos, apresentaram pequeno número de nódulos gliais e com valores semelhantes. Do mesmo modo, animais inoculados com 4 x [10.sup.3] tripomastigotas aos 25 dias de idade e imunossuprimidos no 5[degré] dia de infecção apresentaram valores semelhantes àqueles de mesma idade apenas inoculados tanto com 4 x [10.sup.3] quanto com 2 x [10.sup.5] tripomastigotas. Para qualquer um dos inóculos utilizados, tanto em animais aos dez dias de idade quanto aos 25 dias de idade, o número de nódulos gliais foi estatisticamente maior nos animais mais jovens. O número máximo de nódulos gliais ocorreu quando se conjugou o maior inóculo com a menor idade (Tabela 3).

Discussão

A infecção pelo T. cruzi, em camundongos, aos dez ou aos 25 dias de idade determinou menor ganho de peso em comparação com camundongoscontrole, dados coincidentes com relatos de infecção chagásica em ratos jovens (Oliveira et al., 1986), porém diferem daqueles obtidos em ratos adultos (três meses de idade) por Guerra (1996). O menor ganho de peso corporal nos animais tratados com ciclofosfamida coaduna com a debilidade orgânica do animal e a exacerbação da infecção (Anton, 1987)

Quanto ao início da parasitemia, os resultados que utilizam qualquer um dos inóculos foram mais tardios que aqueles apresentados por Oliveira et al. (1993) ao empregar os inóculos de [10.sup.4] e [10.sup.5] parasitas do mesmo isolado do T. cruzi, porém mais precoces, quando comparados com o inóculo de [10.sup.3] tripomastigotas/animal em camundongos.

A indução de imunossupressão, em animais infectados, determinou parasitemias mais elevadas em comparação com os animais apenas infectados, confirmando dados da literatura (Silva e Rossi, 1990; Calabrese et al., 1991). Os níveis parasitêmicos e a sobrevivência durante a fase aguda de todos animais infectados sugerem a classificação deste isolado como cepa do tipo III (Andrade e Andrade, 1979).

Os animais mais jovens apresentaram alterações teciduais mais intensas, o que coincide com a maior sensibilidade a infecção chagásica na primeira fase da vida pós-natal tanto de animais (Culbertson e Kessler, 1942; Costa et al., 1986) quanto em crianças (Prata, 1994).

O aumento do inóculo utilizado, neste trabalho, em 50 vezes ou a indução da imunossupressão em animais infectados com o menor inóculo, aos 25 dias de idade, não demonstrou aumento das alterações encefálicas, o que se assemelha a dados apresentados para infecção em ratos aos 30 dias de idade (Da Mata et al., 2000).

As alterações histológicas observadas no SNC, durante a fase aguda da infecção por T. cruzi, caracterizaram-se por reação inflamatória multifocal na forma de nódulos, conforme diversos relatos da literatura (Menezes, 1964; Jardim, 1971; Pittella et al., 1993).

Os registros da presença de parasitas envolvidos nos nódulos gliais são abundantes (Menezes, 1964; Pittella et al., 1993), todavia análises na microscopia de luz não demonstraram a presença de amastigotas na maioria dos nódulos, apesar de que estudos imuno-histoquímicos demonstraram a presença de T. cruzi (Da Mata et al., 2000).

O cerebelo tem sido relatado tanto como sítio encefálico de intenso parasitismo (Menezes, 1964) quanto como área pouco parasitada (Queiroz, 1978). Nódulos subpiais, contíguos à leptomeninge, foram observados em conformidade com outros dados (Alencar e Elejalde, 1960; Da Mata et al., 2000).

Não foi observada a presença de T. cruzi, no plexo corioide, o que parece refletir a raridade de registros do acometimento deste plexo durante a infecção (Da Mata et al., 2000). Por outro lado, isto parece contrastar com alusões da literatura de que áreas encefálicas mais irrigadas seriam mais parasitadas (Menezes, 1964). Desse modo, é provável que, também nestas áreas, o parasitismo esteja na dependência da interação entre o parasito e as células presentes.

Ninhos de amastigotas íntegros ou rotos se assemelharam aos já documentados (Prata, 1994; Da Mata et al., 2000), além de infiltrados perivasculares associados ou não aos nódulos gliais (Alencar e Elejalde, 1960; Da Mata et al., 2000).

O maior grau de infecção foi observado quando se conjugou maior inóculo com a menor idade do animal. Este fato ratifica o maior parasitismo encefálico em animais mais jovens (Costa et al., 1986; Da Mata et al., 2000).

A similaridade do número de nódulos gliais e ninhos de amastigotas, entre os grupos apenas infectados e os grupos infectados e imunossuprimidos, demonstram a ausência de correlação entre os estados de imunossupressão e a infecção encefálica tanto em camundongos (Melo e Brener, 1978) quanto em ratos (Da Mata et al., 2000), apesar de que a imunossupressão intensifica o parasitismo cardíaco.

A indução de imunossupressão, em camundongos durante a fase aguda, apesar de induzir níveis parasitêmicos mais elevados, parece não oferecer as condições ideais ao T. cruzi para parasitar o SNC o que concorda com Da Mata et al. (2000). Nos casos humanos de imunossupressão por longo tempo (AIDS, transplantes), infecções oportunistas secundárias são comuns, o que poderia induzir aumento nos níveis de citocinas. A disponibilidade de citocinas teciduais ou circulantes parece representar fator que pode desencadear aumento da permeabilidade da barreira hemato-encefálica (De Vries et al., 1997). Assim, poder-se-á especular que o afrouxamento da BHE possivelmente signifique facilitação de penetração de T. cruzi no SNC, apesar de a quebra da BHE, utilizando ácido caínico em ratos, não ter apontado nessa direção (Da Mata et al., 2000). Por outro lado, a imaturidade do sistema imune dos animais mais jovens, juntamente com a maior permeabilidade dos capilares encefálicos, característicos desta fase, poderia conjugar-se, representando fatores de acesso de T. cruzi ao SNC.

Conclusão

Animais jovens foram mais susceptíveis ao comprometimento encefálico por este isolado de T. cruzi, provavelmente pela imaturidade do sistema imune e maior permeabilidade dos capilares nessa fase de vida. A imunossupressão induzida, nos animais, determinou aumento na parasitemia. O isolado estudado apresentou comportamento compatível com cepa tipo III. Outras abordagens de caracterização, como a bioquímica, poderão ser utilizadas no aprofundamento desta.

Received on August 22, 2007.

Accepted on May 06, 2008.

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Fabiana Ribeiro da Mata (1), Márcio Christian Rodrigues de Souza (1), João Roberto da Mata (1), Ênio Chaves de Oliveira (2) e Tales Alexandre Aversi-Ferreira (3) *

(1) Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. (2) Laboratório de Doença de Chagas, Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. (3) Laboratório de Bioquímica e Neurociências, Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Campus Samambaia, Cx. Postal 131, 74001-970, Goiânia, Goiás, Brasil. * Autor para correspondência. E-mail: [e-mail]

Tabela 1. Peso corporal médio em gramas ([+ or -] desvio-padrão) de
camundongos Swiss webster, aos dez e aos 33 dias de idade. Os animais
foram inoculados aos dez dias de idade com 4 x 103 ou 2 x 105
tripomastigotas do Trypanosoma cruzi.

                          Peso médio
Idade
(dias)     Inóculos       Dia da inoculação (dez dias)

dez dias   4x[10.sup.3]   5,46 [+ or -] 0,38 (4,82 - 5,82)
           2x[10.sup.5]   5,66 [+ or -] 0,72 (5,10 - 6,85)
           Controle       5,47 [+ or -] 0,20 (5,22 - 5,80)

                          Peso médio
Idade
(dias)     Inóculos       Dia do sacrifício (33 dias)

dez dias   4x[10.sup.3]   19,98 [+ or -] 1,01 (18,81 -21,12) (a)
           2x[10.sup.5]   19,52 [+ or -] 2,02 (15,99 - 21,13) (a)
           Controle       29,73 [+ or -] 3,65 (25,31 - 35,02) (b)

Valores máximos e mínimos entre parênteses. Letras diferentes para a
coluna indicam diferenças significativas (test t).

Tabela 2. Peso corporal médio em gramas ([+ or -] desvio-padrão) de
camundongos Swiss webster aos 25 e aos 48 dias de idade. Os
animais foram inoculados aos 25 dias de idade com 4 x 103 (sem e
com imunossupressão no 5[degrees] dia de infecção) ou com
2 x 105 tripomastigotas do Trypanosoma cruzi.

                            Peso médio

Idade                       Dia da inoculação
(dias)   Inóculos           (25 dias)

         4 x [10.sup.3]     11,28 [+ or -] 0,89 (10,30 - 12,40)
25       4 x [10.sup.3] e   13,22 [+ or -] 0,58 (12,05 - 13,98)
dias     imunossuprimidos
         2 x [10.sup.5]     12,19 [+ or -] 1,21 (10,80 - 13,62)
         Controle           12,93 [+ or -] 1,14 (11,20 - 13,25)

                            Peso médio

Idade                       Dia do sacrifício
(dias)   Inóculos           (48 dias)

         4 x [10.sup.3]     28,40 [+ or -] 3,26 (23,39 - 32,20) (a)
25       4 x [10.sup.3] e   23,68 [+ or -] 1,11 (22,16 - 24,98) (b)
dias     imunossuprimidos
         2 x [10.sup.5]     27,81 [+ or -] 1,32 (25,6 - 29,05) (a)
         Controle           33,43 [+ or -] 3 ,56 (29,30 - 37,25) (c)

Valores máximos e mínimos entre parênteses. Letras diferentes para
coluna indicam diferenças significativas (test t).

Tabela 3. Número médio ([+ or -] desvio-padrão) de nódulos gliais no
encéfalo de camundongos Swiss webster inoculados aos dez ou 25
dias de idade, com 4 x 103 ou 2 x 105 tripomastigotas do
Trypanosoma cruzi.

           Tamanho do inóculo

Idade                                       4.000 +
(dias)     4.000                            imunossuprimido

dez dias   4 [+ or -] 1,22 (3 - 6) (a)      -
25 dias    0,20 [+ or -] 0,44 (0 - 1) (b)   0,20 [+ or -] 0,44 (0 - 1)

Idade
(dias)     200.000

dez dias   105,20 [+ or -] 23,92 (89 - 147) (c) *
25 dias    0,4 [+ or -] 0,54 (0 - 1) (d)

Letras diferentes nas colunas indicam diferenças significativas,
nas linhas, apenas o valor com asterico (*) (test t).